专利名称：大麦黄矮病毒干扰病毒基因表达载体及其构建方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，特别是涉及一种大麦黄矮病毒干扰病毒基因表达载体及 其构建方法与应用。更进一步涉及到大麦黄矮病毒GAV病毒基因表达载体，及其转化禾本科 植物小麦并获得抗性植株的方法。
技术背景由大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarf virus,简称BYDV)引起的小麦黄矮病(Wheat yellow dwarfdisease)是发生最为普遍和最具毁灭性的禾谷类作物病毒病之一。该病主要危害小麦， 自1960年在我国陕西、甘肃的小麦上首次发现BYDV以来，目前该病在我国西北、华北、 西南及华东等近20个省、市、自治区的冬春麦区每年都有不同程度的为害。其中以豫西、晋 南、关中、陇东及华东和西南地区为冬小麦的主要流行区，甘肃省河西走廊、陕北等地为冬 春麦混种流行区，宁夏、内蒙古、晋北、冀北及东北地区为春小麦的主要流行区。 BYDV是由蚜虫以持久性方式传播。罹病寄主植物会出现叶片黄化、红化、巻叶和植株矮化 等症状，光合作用与代谢遭到破坏，从而影响抽穗与结实。小麦黄矮病流行年份，全世界麦 区由此病造成的产量损失可达20%-30%， 一般年份也不少于2%-3%。根据不同种的麦蚜传播 大麦黄矮病毒的能力不同，美国学者Rochow将大麦黄矮病毒划分成5个株系，PAV、 MAV、 SGV、 RPV和RMV。在国内周广和等将我国的大麦黄矮病毒分离物划分为GAV、 GPV、 PAGV 禾口RMV，其中GPV为我国特有的株系。对于小麦黄矮病大发生的年份，治虫防病是首选的应急措施。可以通过药剂防治降低虫 口密度来控制病害的发生。但应慎重使用化学杀虫剂，减少药剂防治带来的环境污染。调整 作物布局和播期以及清除田间杂草等栽培措施，在一定程度上也能起到减轻小麦黄矮病发生 的作用。选育和推广抗耐病品种目前仍是防治小麦黄矮病乃至多种病毒病最经济有效的方法。 迄今为止，普通小麦中尚未发现有抗性材料。小麦黄矮病的自然抗性基因主要存在于中间偃 麦草、偃麦草以及赖草属等小麦近缘种属中。辛志勇等运用细胞工程技术，即运用常规杂交 育种手段结合现代生物技术方法，将自然抗性基因从上述外源植物中导入到栽培小麦中。通 过中间偃麦草和普通小麦杂交获得抗小麦黄矮病易位系，并选育出抗病品种"临抗1号"。但是，常规育种的方法存在周期长、定向性差，易带入不良性状的缺陷。在分子生物学和植物生物技术迅速发展的近十余年中，基因工程技术为病毒病的综合防治开辟了新途径，植物病毒抗病基因工程的技术路线已趋向成熟，并且仍在不断发展。迄今，应用的主要策略有A、病毒自身基因介导的抗性(Pathogen-derived resistance, PDR)包括 ①导入病毒外壳蛋白基因CP;②利用病毒非结构蛋白基因，如复制酶基因、运动蛋白基因、 其它一些功能基因等；③利用人工构建的缺损干扰颗粒(defective interfering particle);④利 用病毒弱毒株系全基因组介导的抗性。B、植物自身抗病基因，如N基因、R基因等。C、利 用植物源抗病毒活性物质基因，例如美洲商陆蛋白基因、天花粉蛋白基因等。D、直接或间 接作用于病毒核酸的策略，包括①反义RNA技术；②核酶基因；③dsRNA分解酶基因，如 Pacl基因等； 2'-5'寡聚腺苷系统(2'-5'A)。 E其它的抗病毒基因工程策略，包括①利用卫 星RNA (satellite RNA， Sat-RNA);②利用抗体基因介导病毒抗性；③利用干扰素基因介导 病毒抗性。目前，国内外不同的研究小组已将BYDV的不同株系的外壳蛋白基因(CP)、复 制酶基因分别导入小麦或燕麦，并且获得对BYDV有较强抗性的植株。RNA干扰是由RNA介导的通过特异性的相互作用来抑制基因表达的遗传干扰现象，它 能够特异、有效地降解mRNA，从而引起转录后水平的基因沉默。当表达来源与病毒某一基 因或核苷酸序列的转基因植物发生RNA沉默时，能对入侵的同一病毒或同属中相近病毒的 RNA进行降解，使入侵的病毒不能在植物中积累，从而赋予转基因植物病毒抗性。近年来， RNA干扰技术在研究植物病毒基因功能与致病机制和植物抗病机理中有了广泛应用，但在国 内外RNA干扰介导的BYDV-GAV抗性还未见报道。 发明内容基于上述领域中的空白，本发明提供了一种大麦黄矮病毒干扰病毒基因表达载体，该载 体包含一种致病病毒的外壳蛋白基因。用该载体对植物进行遗传转化，所得到的转基因植株 与入侵的致病病毒之间发生RNA沉默反应，入侵病毒不能繁殖或积累，从而具有抗病性。本 发明还提供该干扰病毒基因表达载体的构建方法及应用，为植物抗病育种提供了一种新的对 策和思路。一种大麦黄矮病毒干扰病毒基因表达载体，其特征是采用的骨架载体是pMCG161，在其 上游的两个酶切位点Ascl、 AvrII间插入大麦黄矮病毒外壳蛋白基因的正义链，在下游的两个 酶切位点Spel、 Sgfl间插入其大麦黄矮病毒外壳蛋白基因的反义链。所述大麦黄矮病毒是大麦黄矮病毒GAV。上述干扰病毒基因表达载体的构建方法，包括如下步骤 (1)设计大麦黄矮病毒GAV外壳蛋白CP基因的引物 SEQ NOl: 5' ATGAATTCAGTAGGCCGTAGA 3' SEQ NO 2: 5' CTATTTGGGAGTCATGTTGGC 3'以BYDV-GAV的总RNA为模板，经RT-PCR扩增全长CP基因片段，回收目的片段后克隆 得到CP基因的阳性克隆，(2) 设计带有四个酶切位点Ascl、 AvrII、 Spel和Sgfl的全长CP基因的RNA干扰引物 SEQ NO 3: 5' CTACTAGTGGCGCGCCATGAATTCAGTAGGCCGTAGA 3'SEQ NO 4: 5' CGGCGATCGCCTAGGCTATTTGGGAGTCATGTTGGC 3'以CP基因的阳性克隆为模板，经RT-PCR扩增介导RNA干扰的BYDV-GAV外壳蛋白的前体双链DNA，目的片段回收后，得到含目的片段阳性质粒，(3) 含目的片段的阳性质粒经AscI、 AvrII酶切得到正义链，经Spel、 AsiSI得到反义链，(4) pMCG161首先经Ascl、 AvrII酶切成线性片断，将正义链连接到pMCG161载体的Ascl 和AwII位点，将反义链连接到pMCG161载体的Spel和Sgfl位点，最终构建成干扰载体。所述克隆获取阳性质粒所用的载体pGEMT-easy载体，转化菌株为大肠杆菌JMllO。 上述大麦黄矮病毒干扰病毒基因表达载体的应用。所述应用是将上述大麦黄矮病毒干扰病毒基因表达载体转化有关受体植物使之对大麦黄 矮病毒产生抗性。所述转化方法为基因枪法、农杆菌介导法或共转化法。 所述转化方法为基因枪法。 所述受体植物为未本科植物。 所述禾本科植物为小麦。本发明在BYDV-GAV的基因组(GenBank登录号AY220739;晋治波等，2003)上设计 了 BYDV-GAV外壳蛋白(CP)介导的RNA干扰的dsRNA (600bp)前体，将BYDV-GAV的 CP基因连接到双向干扰载体pMCG161载体的Ascl和AvrII位点，而后在正义链载体的基础 上将BYDV-GAV的CP基因连接到双向干扰载体pMCG161载体的Spel和Sgfl位点上构建 反义链片断，最终构建了适合禾本科植物转化的BYDV-GAV干扰载体。利用基因枪的方法进 行小麦的遗传转化，借助小麦组织中RdRp的转录作用，产生BYDV-GAV的CP基因的dsRNA 的形式，再由DicerIII的作用产生SiRNA，当小麦受BYDV-GAV侵染时，就可产生SiRNA， 从而达到利用RNA干扰介导对BYDV-GAV的抗性的目的。最终筛选出免疫或高抗 BYDV-GAV的转基因小麦植株。本发明为植物抗病基因工程提供了一种干扰病毒基因表达载体及其构建方法与应用，为 转基因技术及RNA干扰在生物抗性育种中的应用提供了新的思路。将该载体转入小麦中，成 功获得了抗病毒植株，实现了利用RNA干扰原理获得抗BYDV—GAV小麦新品种的预期目标，为RNA干扰介导的植物抗性育种及基因工程提供了成功的实例，弥补了RNA千扰介导 的BYDV-GAV抗性在本领域研究中的空缺。本发明的干扰载体组合并不只限于对BYDV进行转化和用于培育对BYDV有抗性的转 基因植株。利用本发明的干扰载体转化所得的抗性生物体可以是任何微生物、植物或其组织、 细胞，以及由此所获得具有任何抗病活性的微生物、植物，以及该类植物后代的种子、杂交 和转育后代。
图1. RT-PCR扩增获得BYDV-GAV的外壳蛋白(CP)基因的电泳图片；图2. RT-PCR扩增获得介导RNA干扰的BYDV-GAV外壳蛋白(CP)的前体双链DNA的电泳图片；图3A.大麦黄矮病毒GAV株系外壳蛋白干扰载体的构建过程中，正义链载体中正义链片段 的PCR鉴定；图3B.大麦黄矮病毒GAV株系外壳蛋白干扰载体的构建过程中，正义链载体中正义链片段 的酶切鉴定(Ascl and AvrII);图3C.大麦黄矮病毒GAV株系外壳蛋白反义链载体中反义链片段的酶切鉴定(Spel and AsiSI);图3D.大麦黄矮病毒GAV株系外壳蛋白干扰载体的构建过程中，反义链片段的酶切鉴定 (Spel and AsiSI); M: DN A Marker DL2000; CK:阴性对照 图4.载体pMCG161的结构示意图； 图5.质粒载体pMCG161外源片断构建线性图；图6.小麦转基因幼胚愈伤在含有PPT (5mg/L)分化培养基的分化培养； 图7.无激素的培养基上壮苗；图8.在选择压为PPT6mg/L长势旺盛的转基因再生小麦；图9.移栽到花盆中的转基因小麦具体实施方式
实验中使用的载体pMCG161 (该载体保存在中国农业科学院植物保护研究所病毒组实验 室内，可向公众发放)是专门适用于禾本科植物转化的干扰载体(图4)，它含有来源于水稻 的Rice waxy-a intron 1 ，位于5442bp-6576bp，在它的上游含有Ascl和AvrII两个酶切位点， 用来构建CP基因的正义链，在它的下游含有AsiSI与Sgfl位点，用来构建CP基因的反义链(图5)。实验中所用的pGEM T-easy，购自Promega生物技术公司。 BYDV-GAV基因组在GenBank登录号是AY220739。实施例l，大麦黄矮病毒GAV干扰病毒基因表达载体的构建歩骤l、依据BYDV-GAV的基因组序列，本发明首先设计全长CP基因的引物，如下 SEG NO 1: 5' ATGAATTCAGTAGGCCGTAGA 3' SEQ NO 2: 5' CTATTTGGGAGTCATGTTGGC 3'以BYDV-GAV的总RNA为模板，经RT-PCR扩增全长CP基因片段(600bp)(图1)目的片 段回收后连接到pGEM T-easy载体上，转化大肠杆菌JMllO，进行克隆测序鉴定，得到CP 基因的阳性克隆。步骤2、含RNA干扰的前体双链CP基因阳性质粒的获得按照RNA干扰的机制，本发明设计带有四个酶切位点(Ascl、 AvrII、 Spel、 Sgfl)全长CP 基因的RNA千扰引物SEQ NO 3: 5' CTACTAGTGGCGCGCCATGAATTCAGTAGGCCGTAGA 3' SEq NO 4: 5' CGGCGATCGCCTAGGCTATTTGGGAGTCATGTTGGC 3' 以CP基因的阳性克隆为模板，经RT-PCR扩增介导RNA干扰的BYDV-GAV外壳蛋白(CP) 的前体双链DNA(图2)。目的片段回收后连接到pGEM T-easy载体上，转化大肠杆菌JMllO， 进行克隆测序鉴定，得到阳性质粒。步骤3、含目的片段的阳性质粒经Ascl、 AvrII酶切得到正义链，经Spel、 AsiSI(AsiSI与Sgfl 是同位酶)得到反义链。将载体pMCG161首先进行AscI、 AvrII酶切成线性片断，将经AscI、 AvrII酶切得到正义链片断，用T4连接酶连接到pMCG161载体的AscI和AvrlI位点，而后 在正义链载体的基础上构建反义链片断，即将经SpeI、 AsiSI(AsiSI与SgfI是同位酶)得到的 反义链片断，用T4连接酶连接到pMCG161载体的Spel和Sgfl位点，最终构建成干扰载体 pMCG161+CP(SA)(简写pSA)(图3)。同理可得到两个对照载体正义链载体pMCG161+CP(S)(简写pS)、反义链载体 pMCG161+CP(A)(简写pA)。实施例2转基因植物的获得及检测 歩骤l、取构建好的干扰载体及其对照载体，分别转化JM110感受态细胞，涂板，37'C培养 过夜。挑取单菌落，经过小量液体LB (3-5ml)震荡培养；中量培养(20-30ml)后；以1:50的比例接种200ml液体LB培养基，37'C震荡培养2-3小时；加入终浓度为170p g/ml的 氯霉素，继续培养16-18小时；5000rpml0分钟离心收集菌体；采用大量质粒提取试剂盒 (Marligen)纯化质粒。方法参见厂家说明书。获得质粒浓度达2-3mg/ml，含有卯％以上的 超螺旋DNA，可用于基因枪转化。步骤2、将授粉14天左右的小麦幼穗(品种扬麦158)从田间采回来，进行人工剥粒，然 后在超净工作台中经70%乙醇和10% (V/V)次氯酸纳溶液消毒后，用解剖针，挑取小麦幼 胚，幼胚直径约l-1.5mm为宜，放于SD2培养基上，盾片向上，胚芽向下，两胚芽相互间距 0.5cm左右。幼胚进行剥离，并放入SD2培养基上培养。26。C黑暗条件下诱导愈伤组织，3d 后拔去伸长的胚芽，7-10d后将愈伤组织集中于培养皿中央，直径约2cm左右，经0.4mol/L 渗透压培养基(SD2添加0.2mol/L甘露醇，0.2mol/L山梨醇)处理4 6h以备基因枪轰击之 用。步骤3、将步骤2备好的小麦愈伤组织和步骤1中提取的质粒应用于基因枪的转化。轰击后 的愈伤组织继续在原渗透压培养基上处理16 18h，然后转入SD 2培养基黑暗条件下(26°C ) 恢复培养2周。歩骤4、恢复培养后的愈伤组织移到MS+NAA (lmg/L) +KT lmg/L +Bialaphos(PPT)3mg/L 的培养基上诱导分化3周(每日10h光照，24°C)(图6),出现绿芽分化后，转到无激素培养 基(MS+Bialaphos5mg/L)上培养1周，再转入无激素培养基(MS+Bialaphos 5mg/L)上继 续培养(每日10h光照，24 °C )(图7),直到小苗生长到1 2em时，移入 MS+IAA(0.5mg/L)+Bialaphos(6mg/L)的培养基上壮苗(图8)，再生植株生长到适宜大小(苗 高6 8cm，根系较好)时放入4'C冰箱中春化处理20 30天，然后移入装有灭菌土的纸营 养钵中，外罩保鲜膜保湿。最后移入花盆，置于温室。通过基因枪的遗传转化，获得了四个 载体的TO代植株。(图9)步骤5、本发明获得了四个载体的转基因小麦，pSA、 pS 、 pA、 pMCG161的阳性TO代转基 因小麦株数分别是14株、4株、3株、3株。对转基因小麦的TO、 Tl、 T2代分别进行了PCR 鉴定，T0代的阳性转化率是分别是0.46。/。、 0.15%、 0.12%、 0.11%。干扰载体的T3代转基因 小麦的接种试验表明获得了干扰载体的四个抗病性株系，他们是pSA-6、 9、 11、 12，发病严重度平均为3级以下(即抗病)。附录SEQN0 1: 5' ATGAATTCAGTAGGCCGTAGA 3'SEQN0 2: 5' CTATTTGGGAGTCATGTTGGC 37SEQ NO 3: 5' CTACTAGTGGCGCGCCATGAATTCAGTAGGCCGTAGA 3'SEQ NO 4: 5' CGGCGATCGCCTAGGCTATTTGGGAGTCATGTTGGC 3'
权利要求
1、一种大麦黄矮病毒干扰病毒基因表达载体，其特征是采用的骨架载体是pMCG161，在其上游的两个酶切位点AscI、AvrII间插入大麦黄矮病毒外壳蛋白基因的正义链，在下游的两个酶切位点SpeI、SgfI间插入其大麦黄矮病毒外壳蛋白基因的反义链。
2、 根据权利要求1所述的大麦黄矮病毒干扰病毒基因表达载体，所述大麦黄矮病毒是大麦 黄矮病毒GAV。
3、 权利要求2所述的大麦黄矮病毒干扰病毒基因表达载体的构建方法，包括如下步骤(1) 设计大麦黄矮病毒GAV外壳蛋白CP基因的引物 SEQ NO 1: 5' ATGAATTCAGTAGGCCGTAGA 3'， SEQ NO 2: 5' CTATTTGGGAGTCATGTTGGC 3'，以BYDV-GAV的总RNA为模板，经RT-PCR扩增全长CP基因片段，回收目的片段后 克隆得到CP基因阳性克隆， (2) 设计带有四个酶切位点Ascl、 AvrII、 Spel和Sgfl的全长CP基因的RNA干扰引物 SEQ NO 3: 5' CTACTAGTGGCGCGCCATGAATTCAGTAGGCCGTAGA 3'，SEQ NO 4: 5' CGGCGATCGCCTAGGCTATTTGGGAGTCATGTTGGC 3'， 以CP基因阳性克隆为模板，经RT-PCR扩增介导RNA干扰的BYDV-GAV外壳蛋白的 前体双链DNA，目的片段回收后，得到含目的片段的阳性质粒，(3) 含目的片段的阳性质粒经AscI、 AvrII酶切得到正义链，经Spel、 AsiSI得到反义链，(4) pMCG161首先经Ascl、 AvrII酶切成线性片断，将正义链连接到pMCG161载体的Ascl 和AvrII位点，将反义链连接到pMCG161载体的Spel和Sgfi位点，最终构建成干扰载体。
4、 根据权利权利3所述的构建军方法，所述克隆获取会目的片段的阳性质粒所用的载体 pGEMT-easy载体，转化菌株为大肠杆菌JMllO。
5、 权利要求1或2所述的大麦黄矮病毒干扰病毒基因表达载体的应用。
6、 根据权利要求5所述的应用，是将大麦黄矮病毒干扰病毒基因表达载体转化有关受体植 物使之对大麦黄矮病毒产生抗性。
7、 根据权利要求6所述的应用，所述转化方法为基因枪法、农杆菌介导法或共转化法。
8、 根据权利要求7所述的应用，所述转化方法为基因枪法。
9、 根据权利要求6所述的应用，所述受体植物为未本科植物。
10、 根据权利要求9所述的应用，所述禾本科植物为小麦。
全文摘要
本发明涉及“大麦黄矮病毒干扰病毒基因表达载体及其构建方法与应用”，属于基因工程技术领域。本发明提供了一种大麦黄矮病毒干扰病毒基因表达载体，其特征是采用的骨架载体是pMCG161，在其上游的两个酶切位点AscI、AvrII间插入大麦黄矮病毒外壳蛋白基因的正义链，在下游的两个酶切位点SpeI、SgfI间插入其大麦黄矮病毒外壳蛋白基因的反义链。本发明构建的大麦黄矮病毒GAV干扰病毒基因表达载体，通过基因枪法将其转入小麦中，获得对大麦黄矮病毒GAV具有抗性的转基因小麦品种。本发明为植物抗病育种提供了一种高效的育种途径和新的策略。
文档编号C12N15/63GK101215572SQ200810056509
公开日2008年7月9日 申请日期2008年1月21日 优先权日2008年1月21日
发明者艳 刘, 吴蓓蕾, 周广和, 王锡锋 申请人:中国农业科学院植物保护研究所