一种红细胞血型的体外改造方法及其专用配套试剂的制作方法

专利名称：一种红细胞血型的体外改造方法及其专用配套试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种红细胞血型的体外改造方法及其专用配套试剂。
技术背景输血安全和血液偏型是全世界输血界面临的两大难题。长期以来，因血型鉴定 错误、识别错误等主客观因素引起的输血事故发生率居高不下，即使在科技发达的美国，错误输血发生率达1例/1.2万单位之多，其中，由ABO血型不合导致的错 误率为1例/ 3.3万单位，死亡率约1例/ 80万单位，是输血事故死亡的首要原因， 比输血传播疾病(如HIV、 HBV等)发生率(l例/200万单位)高得多。由于目 前红细胞的保存期仅6周，在遇到长节假日、寒暑假等情况时采血量大大减少，很 容易出现某种ABO血型的红细胞供应告急而其它ABO血型红细胞过剩的偏型现 象。血液偏型不仅使急需用血的临床患者无法及时得到宝贵的血液而危及生命安 全，还会由于血液在保质期内未能用于临床而造成巨大的浪费，美国统计由此原因 造成的浪费达6%之多，这对本来就不充裕的血源来说无疑是雪上加霜。因此，如 何解决上述两大难题已成为输血医学研究的重要课题。人类红细胞血型系统至少有29种，以ABO和Rh血型系统对输血安全最为重要。 O型红细胞不含A或B抗原，在RhD血型匹配的前提下，可安全地输给A、 B、 AB 或O型的受血者，因此又被称为"通用型红细胞"。应用通用型红细胞可以极大的 降低因ABO血型不合所致输血反应的可能性，提高输血的安全性；能够有效解决血 液偏型难题，减少血液的浪费；简化血液采集、储存和配型程序，提高血站和医院 输血科的工作效率，可降低输血成本近9%，据报道美国每年可节约7亿美元，保 守估计我国每年可节约3亿元。美国红十字会血液中心科学主管Garratty预计未 来几年内有望将A、 B或AB型红细胞转变成O型，届时只储存和使用O型红细胞， 这将是输血医学的一场革命。此外，在战争、恐怖袭击、巨大灾难和其它突发事件 中，及时安全的输血是救治伤员的一个关键因素。应用通用型红细胞时，无需检查 受血者的ABO血型，使用简便、迅速、安全，可增强应急输血保障能力，提高伤员 的存活率。ABH血型抗原的本质为糖蛋白和糖脂，血型是由其末端糖链的种类及排列顺序决定的。O型红细胞仅表达H抗原；B型红细胞含B抗原和H抗原，B抗原非还原端 比H抗原多一个a -1, 3半乳糖；A型红细胞较为复杂，主要分为Al和A2两种亚型。 在Al亚型红细胞上含有A、 Al和H抗原，而A2亚型红细胞上仅含有A抗原和H抗 原。A2亚型红细胞表面的A抗原比H抗原多一个a-1,3-N-乙酰半乳糖胺，而Al 亚型红细胞表面的A1抗原比A抗原多一个N-乙酰半乳糖胺a 1—3(岩藻糖a 1—2) 半乳糖的三糖结构，我国A1亚型占A型99X以上；AB型红细胞则含有A、 B两种 抗原。糖苷水解酶酶解法是目前实现通用型红细胞最有前途的方法。糖苷水解酶存在 广泛，种类丰富。国际生物化学和分子生物学联合会根据作用机制和酶切底物分类， 己正式命名了 150多类糖苷水解酶。这些糖苷水解酶部分来自高等动物、酵母、黑 曲霉等，这些酶都是溶酶体酶，最适pH在3.5 4.5之间，酶比活性一般不超过50 U/mg，反应需要高浓度的酶蛋白(〉3 mg/rnL)和低pH值，酶解不完全，不能满足 血型改造要求。部分糖苷水解酶来源于产气荚膜梭菌、沙门氏菌、肺炎球菌、双歧 杆菌、空肠弯曲杆菌、黄杆菌、粪球菌等微生物中。a-N-乙酰半乳糖胺酶(ct -N-acetylgalactosaminidase)可分别将A抗原、Al抗原非还原端的N-乙酰半乳 糖胺酶切，生成O型红细胞表面的H抗原。 发明内容本发明的目的是提供一种红细胞血型的体外改造方法。本发明所提供的红细胞血型的体外改造方法，是用a -N-乙酰半乳糖胺酶处理 离体A型或AB型红细胞，使A型红细胞改造为O型红细胞，使AB型红细胞改造为 B型红细胞；所述a-N-乙酰半乳糖胺酶，是如下(a)或(b)的蛋白质(a) 由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b) 将序列表中序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加且具有a-N-乙酰半乳糖胺酶活性的由(a)衍生的蛋白质；所述用a -N-乙酰半乳糖胺酶处理离体A型或AB型红细胞的方法为将A型红 细胞和AB型红细胞中的任一种红细胞和所述a -N-乙酰半乳糖胺酶加入缓冲溶液 中，使所述a-N-乙酰半乳糖胺酶的终浓度为5 20U/ml、所述红细胞的压积为40 % 20%;在20。C 26。C,反应30 120 min， A型红细胞改造为0型红细胞，AB 型红细胞改造为B型红细胞；所述缓冲溶液为由如下终浓度的物质组成的水溶液200 400mM甘氨酸，0 10 mM NaCl;所述缓冲溶液的pH值为6. 6 7. 2。所述a -N-乙酰半乳糖胺酶(a -N-acetylgalactosaminidase)，名称为a NAGA， 来源于脑膜脓毒性金黄杆菌(C力JTseofecferj'咖/z e/w'y^ose; "c咖)ZYP01 CGMCC No.2198。脑膜脓毒性金黄杆菌(C7zo^eo6acfen.ww mem."gayep"cwm) ZYP01 CGMCC No.2198已于2007年10月17日保藏于位于中国北京市朝阳区大屯路的中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。其中，序列表中的序列3由427个氨基酸残基组成。为了使(a)中的aNAGA便于纯化，可在由序列表中序列3所示的氨基 酸序列组成的蛋白质的N端或C端连接上如表l所示的标签。表1.标签的序列标签残基序列Poly-Arg5-6 (通常为5个)RRRRRPoly-His2-10 (通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tag II8WSHPQFEKc一myc10EQKLISEEDL上述(b)中的aNAGA可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表 达得到。上述(b)中的aNAGA的编码基因可通过将序列表中SEQ ID Nq: l的自 5'末端第52至1332位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子， 和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表1所示 的标签的编码序列得到。为了便于蛋白的可溶表达，还可在所述aNAGA的氨基末端添加上信号肽序 列。如添加由序列表中2的自氨基末端第1至17位氨基酸残基组成的多肽，得到 由序列表中2所示的氨基酸序列组成的蛋白。序列表中的序列2由444个氨基酸残基组成。自氨基末端(N端)第1-17位氨 基酸残基为信号肽(signal p印tide)序列。上述a -N-乙酰半乳糖胺酶(a -N-acetylgalactosaminidase)可按照下述方 法表达得到将含有上述a-N-乙酰半乳糖胺酶(a-N-acetylgalactosaminidase) 编码基因的重组表达载体导入宿主细胞，表达得到a-N-乙酰半乳糖胺酶(a-N-acetylgalactosaminidase)。所述a-N-乙酰半乳糖胺酶(a-N-acetylgalactosaminidase)的编码基因，具体 可为如下l)或2)或3)的基因1) 其编码序列是序列表中的序列1的自5'末端第52-1332位脱氧核糖核苷酸 所示的DNA分子；2) 其核苷酸序列是序列表中的序列1所示的DNA分子；3) 在严格条件下与l)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述a-N-乙酰半乳 糖胺酶(a -N-acetylgalactosaminidase)的DNA分子。上述严格条件可为在O. 1XSSPE (或0. 1XSSC)， 0.1% SDS的溶液中，在65 "C下与NC膜或PVDF膜杂交并洗涤。序列表中的序列1由1335个脱氧核糖核苷酸组成，自5，末端的第52至1332 位核苷酸为序列3的aNAGA的编码序列，自5'末端的第1-51位核苷酸为信号肽 的编码序列。所述宿主可为大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或枯草杆菌等，优 选为大肠杆菌。所述大肠杆菌具体可为BL21(DE3)、 E. coliJM109， E. coli HB101或E. coli T叩IO等。当所述宿主为大肠杆菌时，用于构建所述重组表达载体的出发载体可为现有的 在上述大肠杆菌中表达外源基因的表达载体。所述重组表达载体具体可为将核苷酸序列是序列1的自5'末端的第52至1332 位核苷酸插入pET-22b ( + )的多克隆位点得到的重组表达载体pET-22b-aNAGA。上述重组表达载体均可按照常规方法构建。培养含有所述a-N-乙酰半乳糖胺酶(a-N-acetylgalactosaminidase)编码 基因的宿主细胞的培养基和培养条件，均可为培养出发!k主的培养基和培养条件。上述方法适合于离体Al型或A2型红细胞向0型红细胞的改造。为了对红细胞改造效果进行鉴定，所述方法还包括用抗A抗原抗体、抗A1抗 原抗体和抗H抗原抗体鉴定改造得到的0型红细胞或B型红细胞的步骤。所述方法还可包括用生理盐水和200 400 raM甘氨酸溶液清洗待测红细胞的步骤。本发明还提供了一种体外改造红细胞血型的配套试剂，包括a-N-乙酰半乳糖 胺酶和缓冲溶液；所述a-N-乙酰半乳糖胺酶，是如下(a)或(b)的蛋白质(a) 由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b) 将序列表中序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加且具有a-N-乙酰半乳糖胺酶活性的由(a)衍生的蛋白质；所述缓冲溶液为由如下终浓度的物质组成的水溶液200 400mM甘氨酸，0 10 mM NaCl;所述缓冲溶液的pH值为6. 6 7. 2。其中，所述配套试剂还包括下述l)和/或2)的物质1) 用于清洗待测红细胞的生理盐水和200 400 raM甘氨酸溶液；2) 用于检测红细胞血型的抗A抗原抗体、抗A1抗原抗体和抗H抗原抗体，所 述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。实验证明，脑膜脓毒性金黄杆菌来源的ct-N-乙酰半乳糖胺酶能够在中性pH、 室温下高效、完全酶解人红细胞表面的A抗原和A1抗原，使之改造为H抗原，说 明a NAGA将Al亚型RBC表面的A抗原和Al抗原最外侧的a 1,3GalNAc糖苷键 断裂，将a-N-乙酰半乳糖胺降解掉，使A1和A抗原均转化为H抗原。本发明的 方法酶用量低，用血型定型试剂、人源O型血清和流式细胞仪检测血型改造的结果 证明红细胞血型由A型变为O型。本方法可用于脑膜脓毒性金黄杆菌来源的ci-N-乙酰半乳糖胺酶对全单位红细胞A型到O型的改造，制备通用型红细胞。该方法具 有重要的临床意义和广阔的市场前景，还可成为糖生物学和酶学研究的一个工具。


图1为a NAGA的全长基因和基因片段(序列1的自5'末端第52-1332位脱 氧核糖核苷酸)的PCR产物电泳图谱M: 500 bp DNA Marker, 1: 。NAGA的全长基因，2: aNAGA基因片段(序 列1的自5'末端第52-1332位脱氧核糖核苷酸)图2为pMD-18T- a NAGA和pET-22b- a NAGA的PCR鉴定图谱。M: 500 bp DNA Marker; 1:质粒pMD-18T- a NAGA的PCR结果；2:质粒pET-22b-aNAGA的PCR结果。图3为SDS-PAGE电泳图M:蛋白质分子量标准；1: pET-22b-a NAGA/大肠杆菌BL21 (DE3)经0. 4mM IPTG 诱导后的总蛋白；2: pET-22b-aNAGA/大肠杆菌BL21 (DE3)未加IPTG诱导的总蛋 白；3: PET-22b-a NAGA/大肠杆菌BL21 (DE3)经0.4mM IPTG诱导后的细菌上清蛋白经Ni2+鳌合亲合层析柱纯化所得的蛋白；4:将Ni2+鳌合亲合层析柱纯化的蛋白 再用阴离子交换层析柱Hitrap Q FF纯化所得的蛋白。 图4为缓冲溶液对酶解效果的影响。纵坐标l-ll分别表示生理盐水、PBS、 50 mM磷酸钠缓冲液、ACD-A红细胞 保养液、ACD-B红细胞保养液、CPD红细胞保养液、CPDA-1红细胞保养液、缓冲液 1 (200raM甘氨酸，0 raM NaCl ; pH 6. 8)、缓冲液2 (250 mM甘氨酸，2 mM NaCl ; pH 6.8)、缓冲液3 (300 mM甘氨酸，5 mM NaCl ; pH 6.8)、缓冲液4 (400 mM甘 氨酸，lOmM NaCl ; pH 6. 8)。图5为温度和反应时间对酶解效果的影响。图6为pH值对酶解效果的影响。图7为红细胞压积对酶解效果的影响。图8为酶量和反应时间对酶解效果的影响。图9为血型定型试剂检测酶解红细胞的结果。A:肉眼法观测；B:显微镜下观测。a,—a4:酶解前；a5-a8:酶解后。ai、 a5:抗A单克隆抗体检测结果；a2、 a6:抗Al单克隆抗体检测结果； a3、 a7:抗H单克隆抗体检测结果；a4、 a8:抗A单克隆抗体检测结果。 图10为血清法检测酶解红细胞血型的结果。 A:酶解前；B:酶解后。图11为流式细胞仪检测酶解红细胞血型的结果。A: O型红细胞A抗原水平；B:酶解前A型红细胞A抗原水平；C:酶解后A 型红细胞A抗原水平；D: O型红细胞H抗原水平；E:酶解前A型红细胞H抗原水 平；F:酶解后A型红细胞H抗原水平。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人所编《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照 制造厂商所建议的条件。实施例1、 a-N-乙酰半乳糖胺酶aNAGA编码基因的克隆与表达1、 a -N-乙酰半乳糖胺酶a NAGA编码基因的克隆将脑膜脓毒性金黄杆菌(C力iTseoZ acfarz.鹏历e/ i/7gose;7"c鹏)ZYP01 CGMCC No. 2198菌株接种到培养基(5g/L酵母提取物，5g/L蛋白胨，5g/L NaCl， 3g/L K2HP04，其余为水。pH7， 2)中，200rpm， 30。C培养过夜。按照Promega基因组DNA 提取试剂盒说明书提取基因组DNA。以提取的基因组DNA为模板，利用上游引物(序 列为5' -ATGGGCGCCTTAATTCCC-3，)和下游引物(序列为: 5， -TTAGTAGTCGTCATTTATTGC-3，)进行PCR。
PCR条件为先95。C预变性5 min; 然后95。C变性30s， 5(TC退火30s， 72。C延伸90s,共30个循环；最后72。C延伸 10min。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，得到分子量约为1335 bp的条带(图 l中，泳道l)。用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收该片段。将该回收片段与pMD18-T 质粒(Takara公司)连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞，根据pMD18-T 载体上的羧卞青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。以该 重组质粒载体上的T7和T7终止子序列为引物对其进行核苷酸序列测定，测序结果 表明扩增到的基因由1335个脱氧核糖核苷酸组成(序列表中的序列1)，其开放阅 读框(ORF)为序列表中序列1的自5'末端第1至1335位脱氧核糖核苷酸，编码氨 基酸序列是序列表中序列2的蛋白质，自序列表中序列1的5'末端的第1-51位核 苷酸为信号肽的编码序列。序列表中序列1的自5'末端第52至1335位脱氧核糖 核苷酸，编码氨基酸序列是序列表中序列3的蛋白质。将含有序列表中序列1的自5'末端第1-1335位脱氧核糖核苷酸的a NAGA 基因的重组载体命名为PTE- a NAGA。2、 含有a NAGA编码基因的表达载体pET-22b- a NAGA的构建以pTE-aNAGA为模板，用上游引物(序列为 5' -ATCATATGCCAAAAAAAGTAAGAATTGC-3，(具有NdeI酶切位点))，和下游引物 (序列为5， -TGCTCGAGGTAGTCGTCATTTATTGC-3，(具有Xho I酶切位点)PCR扩 增核苷酸序列是序列表中序列1的自5'末端第52-1332位脱氧核糖核苷酸的a NAGA基因片段。PCR条件为先95。C预变性5 min;然后95。C变性30s, 43。C退 火30s， 72-C延伸90s,共30个循环；最后72。C延伸10 min。对PCR产物进行琼 脂糖凝胶电泳检测，得到分子量约为1300 bp的条带(图1中，泳道2)。按照TAKARA公司的操作指南，将PCR产物与pMD-18T载体连接，转化大肠杆 菌DH5a。挑选阳性克隆，提取质粒，用酶切法、PCR法和测序鉴定构建的质粒， 将含有核苷酸序列是序列表中序列1的自5'末端第52-1332位脱氧核糖核苷酸的a NAGA基因片段的重组载体命名为pMD-18T- a NAGA。其中，pMD-18T- a NAGA 的PCR鉴定结果如图2中泳道1所示，得到约为1300bp的条带。按照TAKARA公司的操作指南，用Nde I和Xho I双酶切质粒pMD_18T- a NAGA， 得到约1300 bp的片段；用Nde I和Xho I双酶切质粒pET-22b ( + ) (Novagen公 司)，得到长为5364bp的线性质粒，分别切下包含1300 bp和5364bp DNA的琼脂 糖胶，回收DNA，连接所得产物，转化大肠杆菌DH5a，挑选阳性克隆，提取质粒， 用酶切法、PCR法和测序鉴定构建的质粒，将含有核苷酸序列是序列表中序列1的 自5'末端第52-1332位脱氧核糖核苷酸的ciNAGA基因片段的重组载体命名为 pET-22b- a NAGA。其中，pET-22b- a NAGA的PCR鉴定结果如图2中泳道2所示， 得到约为1300 bp的条带。3、 aNAGA的表达和纯化将质粒pET-22b-aNAGA转化大肠杆菌BL21 (DE3)，通过酶切法、PCR法和 测序鉴定，筛选得到转入pET-22b-aNAGA的阳性细胞，所得的阳性细胞即为可以 表达目的蛋白的遗传工程宿主细胞。将该阳性菌称为pET-22b-a NAGA/大肠杆菌 BL21 (DE3)。将pET-22b- a NAGA/大肠杆菌BL21 (DE3)划线接种于LB固体培养基(含氨苄 青霉素100吗/ml)培养过夜，挑取单个菌落接种于3mlLB液体培养基(含氨苄青霉 素100吗/ml)培养过夜，以1 : 100的体积比稀释过夜培养菌液于LB液体培养基(含 氨苄青霉素100ug/ml)中，于37"C 250转/分钟培养至菌液0D600达到0.8时，加 异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度0.4腿ol/L，于30。C诱导表达12h。 4。C离心收 集菌体。每克湿菌体加入10ml结合缓冲液(20mM磷酸钠缓冲液，500raM NaCl， 20raM 咪唑，pH 7.4)，加入0. 2mg/ml溶菌酶，20ug/ml DNAse， lmM MgCl2， lmM PMSF， 室温下搅动30min，反复冻融5次。10000rpm离心20min，取上清液。将上清液上 样至已经平衡的N:^+鳌合亲合层析柱(Histrap FF crude层析柱，lmL， Pharmacia 公司，11一0004—58)，用IO倍柱体积的结合缓冲液洗涤，用洗脱缓冲液(20raM 磷酸钠缓冲液，0.5MNaCl， 500 mM咪唑，pH7.4)洗脱目的蛋白。将洗脱蛋白上样 至阴离子交换层析柱Hitrap Q FF (Hitrap Q FF层析柱，5mL， Pharmacia公司， 17-5156-01)上，洗涤缓冲液为20mMTris缓冲液，pH 8. 2;洗脱缓冲液为20mMTris 缓冲液，1MNaCl， pH8.2。洗脱产物进行SDS-PAGE电泳，电泳结果如图3所示，表明得到50 kDa的aNAGA。洗脱下的目的蛋白用酶解缓冲液(200mM甘氨酸，3mM NaCl， p服.8)用超滤管超滤(AmiconUltra—15离心管，15ml，截留分子量50 kDa， 货号UFC900508， Millipore公司)，用HPLC检测酶溶液纯度为98%，使用BCA 蛋白定量试剂盒(pierce公司，货号23225)确定浓度为800吗/ml。将经该超滤纯化得到的蛋白溶液按照如下方法测定酶活在25'C， pH6.8时， 每分钟酶解1 pmol对硝基苯酚-N-乙酰-a -D-半乳糖胺(Sigraa，货号N0257)生成1 umol对硝基苯酚的酶量定义为1 U。结果表明，该超滤纯化得到的蛋白溶液的比 活力为3.36 U/吗。实施例2、 a -N-乙酰半乳糖胺酶最佳酶解条件的确定1.适宜缓冲溶液的确定取IO份新鲜的Al型红细胞(储血号分别为0776961X、 0764948 X、 0776950 X、 0776945X、 0764949X、 0777879X、 0777878X、 0777867X、 0776967X、 0776960X，陕 西省血液中心)，用0.9%氯化钠洗涤1次，每份A1型红细胞分别用下述ll种中的 任一种缓冲溶液洗涤2次并在下述任一种缓冲溶液中进行酶解反应，其中酶解用缓 冲液与洗涤用缓冲溶液相同生理盐水、PBS、 50raM磷酸钠缓冲液、ACD-A红细胞 保养液、ACD-B红细胞保养液、CPD红细胞保养液、CPDA-1红细胞保养液、缓冲液 1 (200 mM甘氨酸，OmM NaCl ; pH 6.8)、缓冲液2 (250 mM甘氨酸，2mM NaCl ; pH 6.8)、缓冲液3 (300 mM甘氨酸，5raM NaCl ; pH 6.8)、缓冲液4 (400 mM甘 氨酸，lOraM NaCl ; pH 6.8)。酶解反应体系共1 mL:红细胞压积40%，实施例1 的a -N-乙酰半乳糖胺酶的终浓度为10 U/ml反应体系，溶剂为上述任一种缓冲溶 液。在25'C下进行酶解，期间每隔15 min摇匀1次，酶解1 h后用0. 9%氯化钠 洗涤2次，用抗A血型定型试剂(长春博德生物技术公司，目录号sl0960081，批号 20060809)检测不同缓冲溶液的酶解效果。结果表明在缓冲液l、缓冲液2、缓冲液 3和缓冲液4这4组缓冲溶液中酶解的10份Al型红细胞均和抗A抗体混合后不凝 集，而在生理盐水、PBS、 50慮磷酸钠缓冲液、ACD-A红细胞保养液、ACD-B红细 胞保养液、CPD红细胞保养液和CPDA-1红细胞保养液这7组缓冲溶液中酶解的10 份A1型红细胞均和抗A抗体混合后强凝集(结果见图4)。图4中的凝集程度为10 份A1型红细胞的平均凝集程度。其判别标准参考李勇、马学严主编《实用血液免 疫学血型理论和实验技术》(2006年10月科学出版社出版)第19章"红细胞输血 血型相容性试验"(第345页)。4:红细胞凝集成一个结实的凝集块，无游离红细胞，背景清晰透明。 3:红细胞凝集成几个大凝块，无游离红细胞，背景尚清晰。 2:红细胞大凝块处于小凝块之间，无游离红细胞。 1:肉眼可见许多小凝块，以游离红细胞为背景。0.5:细胞悬液中有几个肉眼可见的弱凝集颗粒，显微镜下见无数凝集。 镜下可见肉眼观察阴性，镜下可见多数视野中有6 8个细胞凝集 可疑镜下观察，偶有凝集。 0:红细胞全部游离，无细胞凝集。2. 适宜温度和时间的确定取10份新鲜的Al型红细胞(储血号分别为0776961X、 0764948 X、 0776950 X、 0776945X、 0764949X、 0777879X、 0777878X、 0777867X、 0776967X、 0776960X，陕 西省血液中心)，用0.9%氯化钠洗漆1次，用缓冲液2 (250mM甘氨酸，2mMNaCl ; pH 6.8)洗涤2次后在缓冲液2 (250 raM甘氨酸，2mM NaCl ; pH 6. 8)中进行酶解 反应，酶解反应体系共lmL:红细胞压积40%，实施例l的a-N-乙酰半乳糖胺酶 的终浓度为IO U/ml反应体系，溶剂为缓冲液2。分别在4。C、 15°C、 25匸和37°C 酶解，期间每隔15 min摇匀l次。酶解适当时间后取样用0.9%氯化钠洗涤2次， 用抗A血型定型试剂(长春博德生物技术公司，目录号s10960081，批号20060809) 检测不同温度下的酶解效果。检测结果显示，25'C和37'C组酶解10 min时10份 Al型红细胞均和抗A抗体混合后不凝集，15。C组红细胞酶解60 rain时10份Al型 红细胞均和抗A抗体混合后才不凝集，4"C组红细胞酶解120 min时10份Al型红 细胞均和抗A抗体混合后才不凝集。说明25。C和37t:酶解效果好。室温条件(20 26'C)既能有效酶解，又具有对实验环境要求低的优点，是酶解的理想温度(图5)。 图5中纵坐标的0-4表示凝集程度，其判别标准同步骤1。图5中的凝集程度为10 份A1型红细胞的平均凝集程度。3. 适宜pH值的确定取10份新鲜的Al型红细胞(储血号分别为0776961X、 0764948 X、 0776950 X、 0776945X、 0764949X、 0777879X、 0777878X、 0777867X、 0776967X、 0776960X，陕 西省血液中心)，分别用0.9%氯化钠洗涤1次，再分别用下述七种缓冲溶液中的任 一种缓冲溶液洗涤2次并在下述任一种缓冲溶液中进行酶解反应，其中酶解用缓冲 液与洗涤用缓冲溶液相同缓冲液2-l (250 mM甘氨酸，2mM NaCl ; pH 6. 0)，缓冲液2-2 (250 mM甘氨酸，2mM NaCl ; pH 6. 3)，缓冲液2-3 (250 mM甘氨酸，2mM NaCl ; pH 6.6)，缓冲液2-4 (250 mM甘氨酸，2raM NaCl ; pH 6.9)，缓冲液2-5 (250 mM甘氨酸，2mM NaCl ; pH 7.2)，缓冲液2-6 (250 mM甘氨酸，2mM NaCl ; pH7.5)，缓冲液2-7 (250mM廿氨酸，2mMNaCl ; pH 7. 8)。酶解反应体系共1 mL: 红细胞压积40%，实施例1的a -N-乙酰半乳糖胺酶的终浓度为10 U/ml反应体系， 溶剂为上述任一种缓冲溶液。在25。C酶解10 min后取样，用0. 9%氯化钠洗涤2次， 用抗A血型定型试剂(长春博德生物技术公司，目录号sl0960081，批号20060809) 检测不同pH下的酶解效果。检测结果显示，p朋.6、 pH 6. 9和pH7. 2组酶解的10 份A1型红细胞均和抗A抗体混合后不凝集，而pH 6.0、 6.3、 7.5、 7. 8组酶解的 IO份AI型红细胞均和抗A抗体混合后弱凝集，凝集程度均为0.5。说明pH7.0左 右(pH 6.6 7.2)是酶解的最适pH(图6)。图6中纵坐标的0-4表示凝集程度，其 判别标准同步骤1。图6中的凝集程度为IO份AI型红细胞的平均凝集程度。4. 适宜的红细胞压积取10份新鲜的Al型红细胞(储血号分别为0776961X、 0764948 X、 0776950 X、 0776945X、 0764949X、 0777879X、 0777878X、 0777867X、 0776967X、 0776960X，陕 西省血液中心)，分别用0. 9%氯化钠洗涤1次，再分别用缓冲液2 (250 mM甘氨酸， 2raM NaCl ; pH 6. 8)洗涤2次后在缓冲液2 (250 mM甘氨酸，2mM NaCl ; pH 6.8) 中进行酶解反应。酶解反应体系共l mL:红细胞压积分别为10。％、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%和90%，实施例1的a -N-乙酰半乳糖胺酶的终浓 度为IO U/ml反应体系，溶剂为缓冲液2。在25。C酶解1 h后取样用0.9X氯化钠 洗涤2次，用抗A血型定型试剂(长春博德生物技术公司，目录号sl0960081，批号 20060809)检测不同红细胞压积下的酶解效果。检测结果显示，压积等于或低于40 %组的10份Al型红细胞均和抗A抗体混合后不凝集，而压积等于或大于50%组的 IO份AI型红细胞均和抗A抗体混合后凝集。20% 40%压积时既能够使红细胞有 效酶解，又有利于节约试剂和简化操作，是酶解的最佳红细胞压积(图7)。图7 中纵坐标的0-4表示凝集程度，其判别标准同步骤l。图7中的凝集程度为10份 Al型红细胞的平均凝集程度。5. 适宜酶量和反应时间的确定取IO份新鲜的Al型红细胞(储血号分别为0776961X、 0764948 X、 0776950 X、 0776945X、 0764949X、 0777879X、 0777878X、 0777867X、 0776967X、 0776960X，陕西省血液中心)，用0. 9%氯化钠洗涤1次，再分别用缓冲液2 (250 mM甘氨酸，2mM NaCl ; pH 6.8)洗涤2次后在缓冲液2 (250 mM甘氨酸，2mM NaCl ; pH 6.8)中进 行酶解反应。酶解反应体系共lmL:红细胞压积40%，实施例l的a-N-乙酰半乳 糖胺酶的终浓度分别为5U/ml、 10U/ml、 20 U/ml反应体系，溶剂为缓冲液2。在 25'C酶解适当时间后取样，用0.9%氯化钠洗涤2次，用抗A血型定型试剂(长春博 德生物技术公司，目录号sl0960081，批号20060809)检测不同酶量和不同时间下 的酶解效果。检测结果显示，5 U/ml、 10 U/ml、 20 U/ml组各酶解5 min时10份 Al型红细胞均和抗A抗体混合后凝集程度依次为1、 0.5、 0.5;各组酶解IO min 后10份Al型红细胞和抗A抗体混合后凝集程度依次为0. 5、 0、 0;各组酶解30 min 后10份Al型红细胞和抗A抗体混合后各组均不凝集(图8)。说明5 U/ml、 10 U/ml、 20 U/ml等组酶解30 min可使A型红细胞呈现0型红细胞的免疫学特征，为了更加 充分的酶解可能剩余的痕量A抗原，同时不影响红细胞的功能，也可以将酶解时间 延长到120 min。图8中纵坐标的0-4表示凝集程度，其判别标准同步骤1。图8 中的凝集程度为IO份AI型红细胞的平均凝集程度。实施例3、用a-N-乙酰半乳糖胺酶将A型红细胞改造为O型红细胞以下实验操作除特殊说明外，均在室温(25°C)进行。一、酶解1. 取l个单位(100ml)Al型浓縮红细胞(储血号0768424X，陕西省血液中心)， 加入150 ml生理盐水，轻轻颠倒混匀，2000转/分离心8 min，弃尽上清；2. 加入150ml 250 mM甘氨酸(pH 6.8)溶液，轻轻颠倒混匀，2000转/分离心 8 min，弃尽上清；3. 重复步骤2—次；4. 加入150 ml 250 raM甘氨酸(pH 6.8)溶液，总体积约为250 mL，轻轻颠倒 混匀，再加入1. 86 ml实施例1中浓度为2688 U/ml的a -N-乙酰半乳糖胺酶溶液， 轻轻颠倒混匀，使红细胞压积为40%左右，a -N-乙酰半乳糖胺酶的终浓度约为20 U/ml。室温酶解lh，期间每隔15 min混匀一次；5. 2000转/分离心8 min，弃尽上清；6. 加入150ml生理盐水，轻轻颠倒混匀，2000转/分离心8 min，弃尽上清；7. 重复步骤6三次；8. 加入25mlMAP红细胞保养液，混匀后4"C放置备用，得到酶解后的红细胞。二、酶解后的全单位浓縮红细胞血型鉴定1. 用血型定型试剂检测红细胞血型取步骤一中酶解前的新鲜Al型红细胞(储血号0768424X，陕西省血液中心)禾口 酶解后红细胞各40 |il，分别加入等量(40 pl)的抗A单克隆抗体(长春博德生物技 术公司，目录号s10960081，批号20060809)、抗Al单克隆抗体(加拿大DBL公司， 货号0131—0015，批号AL18001A)和抗H单克隆抗体(加拿大DBL公司，货号0141， 批号HL13701)，充分混匀，5min后肉眼观察结果，结果表明未酶解的Al型红细 胞和抗A抗体、抗A1抗体混匀后强凝集(凝集程度为4),未酶解的A1型红细胞 和抗H抗体凝集程度为1;酶解后的红细胞和抗A抗体、抗A1抗体混匀后不凝集， 和抗H抗体凝集增强(凝集程度为3)(图9A)。取步骤一中酶解前的新鲜Al型红细胞(储血号0768424X，陕西省血液中心)和 酶解后红细胞各20 ^，与20 pl抗A抗体混合，1500转/分离心1 min后用手指将 细胞轻轻弹散，显微镜下观察，结果表明酶解前的A1型红细胞强凝集(凝集程度 为4)，酶解后的红细胞不凝集，细胞形态正常(图9B)。2. 用人源O型血清检测红细胞血型取步骤一中酶解前的新鲜A1型红细胞(储血号0768424X，陕西省血液中心)和 酶解后红细胞各40 nl，分别加入5份等量(40 ul)的人源O型血清(储血号 0778381X， 0783386X， 0778626X、 0767277X、 0778618X,陕西省血液中心)，参考 李勇、马学严主编《实用血液免疫学血型理论和实验技术》(2006年10月科学出 版社出版)第30章"血型血清学实验方法"(第586 701页)，采用盐水法、聚 凝胺法和抗人球蛋白法进行主侧配血试验，显微镜下观察，结果表明酶解前的A1 型红细胞与上述5份人源0型血清凝集(凝集程度为l)(图10A)，酶解后的红细 胞与上述5份人源0型血清不凝集(凝集程度为O)，细胞形态正常(图IOB)。3. 用流式细胞仪检测红细胞血型分别取步骤一中酶解前的新鲜Al型红细胞(储血号0768424X，陕西省血液中心) 和酶解后红细胞200， 000个，用生理盐水洗涤2次，加入1 : 50稀释的FITC标记 的抗A单抗(美国BD公司，货号550807)或抗H单抗(美国sigma，目录号L9006) 100 UL， 25X:避光放置l h，生理盐水洗涤4次，用流式细胞仪(Facscalibur，美国 BD)检测，每次检测分选10，000个细胞。结果表明，酶解后，A1型红细胞A抗原基 本消失，H抗原增加，免疫学特征和O型红细胞一致(图11)。序列表<160>3<210〉1<211〉1335<212〉DNA〈213〉月亩膜胺毒'性金黄杆菌(CAr7se。Z 3cte_r_z'MZ7 /He"2y7gose/ ticw历) <400〉1atgggcgccttaattccctcgagctcattattcaacattttcgattttaatccaaaaaaa60gta_ag3a_ttgcttttatagcagttggtttacgcggacagactcacgt3ga_3Mcatggcg120卿CgCg3tgacgt卿ggttgtggcttttgc鄉tccgg3tccgt3catggt鄉ccgt180gcgcaggaaatcctgaaaaag感ggc卿aaacctgct3aagtttttggaaacggaaat240tacgactacataaagataaaaatatcgatgctgtttttgtatcctctcca300tgggaatggcaccatgaacatggtgtagcagccatgaaagctggtaaaattgtcggaatg360geiggtttgtggtgctttaac肌tgg3tg2lgtgctgggattatgtaaaagtttccgagcag420acaggagttccgttaatggctttgg33犯tgtatgttacagacgcg3tattatggctgtc480cttaacatggtaagaaaagacatgttcggagaattaattcgcggaacgggaggctaccag540cacgatctcagaccagttcttttcaatagcggaatcaacggtaaaaacgg卿tggtgtt600gagtttggtgacaaagccttC3gtg犯gCga^3tggagei3ccaaccattataaaaacaga660aacgggg肌ctctaccctactcacggtttaggcccattacacacaatgatggatattaac720cgcggg肌cagattattaagattatcatcttttgcttcca肌gca卿ggtttacataaa780tatgtcgtgg3t犯gggCggggaaagccatccaaatgcaaaagtagaatggaaac肌gg3840gat3ttgt朋ccactcagatccagtgt犯cctattgtattaaccc3cgait■accagcctgcaaagaccatataacctgggattcaaagttcagggtactgaaggtctttgg960g33g3ttttggctgggg卿tgC3gC3C犯ggatttatttacttcgsg3a1020cattctcacagatgggatggttcsga^aa^tggatgaaagcccgatgtgg1080aacagaaagctgttggtgCElggtcatggcggaatggattacttccttgat1140aatacttttatcgagtgtatcaaacgaaatgaagcattcccgctggatgtttacgertctg1200gcgacgtggtattccattacacctcttagtgaa^gtct3ttgctgaaaacggtgccgtt1260caggaaerttcctgattctacaaacggtaaatggaaaactgctaaaaatacatttgcaata1320aatgacgact actaa 1335<210〉 2<211〉 444<212> PRT<213〉 脑膜脓毒性金黄杆菌(CAr7seo/ sct6Tii/迈/z e/7i77《ose/^'c鹏)<400> 2 Met Gly AlaLeu lie Pro Ser Ser Ser Leu Phe Asn lie Phe Asp Phe 5 10 15Asn Pro Lys Lys Val Arg lie Ala Phe lie Ala Val Gly Leu Arg Gly 20 25 30Gin Thr His Val Glu Asn Met Ala Arg Arg Asp Asp Val Glu Val Val3540 45Ala Phe Ala Asp Pro Asp Pro Tyr Met Val Gly Arg Ala Gin Glu lie5055 60Leu Lys Lys Asn Gly Arg Lys Pro Ala Lys Val Phe Gly Asn Gly Asn6570 75 80Tyr Asp Tyr Lys Asn Met Leu Lys Asp Lys Asn lie Asp Ala Val Phe 85 90 95Val Ser Ser Pro Trp Glu T卬His His Glu His Gly Val Ala Ala Met 100 105 110Lys Ala Gly Lys lie Val Gly Met Glu Val Cys Gly Ala Leu Thr Met115120 125Asp Glu Cys Trp Asp Tyr Val Lys Val Ser Glu Gin Thr Gly Val Pro130135140Leu Met Ala Leu Glu Asn Val Cys Tyr Arg Arg Asp lie Met Ala Val 145 150 155 160Leu Asn Met Val Arg Lys Asp Met Phe Gly Glu Leu lie Arg Gly Thr 165 170 175Gly Gly Tyr Gin His Asp Leu Arg Pro Val Leu Phe Asn Ser Gly lie 180 185 190Asn Gly Lys Asn Gly Asp Gly Val Glu Phe Gly Asp Lys Ala Phe Ser 195 200 205Glu Ala Lys Trp Arg Thr Asn His Tyr Lys Asn Arg Asn Gly Glu Leu 210 215 220Tyr Pro Thr His Gly Leu Gly Pro Leu His Thr Met Met Asp lie Asn 225 230 235 240Arg Gly Asn Arg Leu Leu Arg Leu Ser Ser Phe Ala Ser Lys Ala Arg 245 250 255Gly Leu His Lys Tyr Val Val Asp Lys Gly Gly Glu Ser His Pro Asn 260 265 270Ala Lys Val Glu Trp Lys Gin Gly Asp lie Val Thr Thr Gin lie Gin 275 280 285Cys Asn Asn Gly Glu Thr lie Val Leu Thr His Asp Thr Ser Leu Gin 290 295 300Arg Pro Tyr Asn Leu Gly Phe Lys Val Gin Gly Thr Glu Gly Leu Trp 305 310 315 320<formula>formula see original document page 20</formula>Thr His Val Glu Asn Met Ala Arg Arg Asp Asp Val Glu Val Val Ala 20 25 30Phe Ala Asp Pro Asp Pro Tyr Met Val Gly Arg Ala Gin Glu lie Leu 35 40 45Lys Lys Asn Gly Arg Lys Pro Ala Lys Val Phe Gly Asn Gly Asn Tyr 50 55 60Asp Tyr Lys Asn Met Leu Lys Asp Lys Asn lie Asp Ala Val Phe Val 65 70 75 80Ser Ser Pro Trp Glu Trp His His Glu His Gly Val Ala Ala Met Lys 85 90 95Ala Gly Lys lie Val Gly Met Glu Val Cys Gly Ala Leu Thr Met Asp 100 105 110Glu Cys Trp A印Tyr Val Lys Val Ser Glu Gin Thr Gly Val Pro Leu 115 120 125Met Ala Leu Glu Asn Val Cys Tyr Arg Arg Asp lie Met Ala Val Leu 130 135 140Asn Met Val Arg Lys Asp Met Phe Gly Glu Leu lie Arg Gly Thr Gly 145 150 155 160Gly Tyr Gin His Asp Leu Arg Pro Val Leu Phe Asn Ser Gly lie Asn 165 170 175Gly Lys Asn Gly Asp Gly Val Glu Phe Gly Asp Lys Ala Phe Ser Glu 180 185 190Ala Lys Trp Arg Thr Asn His Tyr Lys Asn Arg Asn Gly Glu Leu Tyr195200205Pro Thr His Gly Leu Gly Pro Leu His Thr Met Met Asp lie Asn Arg 210 215 220Gly Asn Arg Leu Leu Arg Leu Ser Ser Phe Ala Ser Lys Ala Arg Gly 225 230 235 240Leu His Lys Tyr Val Val Asp Lys Gly Gly Glu Ser His Pro Asn Ala 245 250 255Lys Val Glu Trp Lys Gin Gly Asp lie Val Thr Thr Gin lie Gin Cys 260 265 270Asn Asn Gly Glu Thr lie Val Leu Thr His Asp Thr Ser Leu Gin Arg 275 280 285Pro Tyr Asn Leu Gly Phe Lys Val Gin Gly Thr Glu Gly Leu Trp Glu 290 295 300Asp Phe Gly Trp Gly Asp Ala Ala Gin Gly Phe lie Tyr Phe Glu Lys 305 310 315 320lie Met Asn His Ser His Arg Trp Asp Gly Ser Glu Lys Trp Met Lys 325 330 335Glu Tyr Asp His Pro Met Trp Lys Lys His Glu Gin Lys Ala Val Gly 340 345 350Ala Gly His Gly Gly Met Asp Tyr Phe Leu Asp Asn Thr Phe lie Glu 355 360 365Cys lie Lys Arg Asn Glu Ala Phe Pro Leu Asp Val Tyr Asp Leu Ala 370 375 380Thr Trp Tyr Ser lie Thr Pro Leu Ser Glu Lys Ser lie Ala Glu Asn 385 390 395 400Gly Ala Val Gin Glu lie Pro Asp Ser Thr Asn Gly Lys Trp Lys Thr 405 410 415Ala Lys Asn Thr Phe Ala lie Asn Asp Asp Tyr 420 42权利要求
1、一种红细胞血型的体外改造方法，是用α-N-乙酰半乳糖胺酶处理离体A型或AB型红细胞，使A型红细胞改造为O型红细胞，使AB型红细胞改造为B型红细胞；所述α-N-乙酰半乳糖胺酶，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有α-N-乙酰半乳糖胺酶活性的由(a)衍生的蛋白质；所述用α-N-乙酰半乳糖胺酶处理离体A型或AB型红细胞的方法为将A型红细胞和AB型红细胞中的任一种红细胞和所述α-N-乙酰半乳糖胺酶加入缓冲溶液中，使所述α-N-乙酰半乳糖胺酶的终浓度为5～20U/ml、所述红细胞的压积为40％～20％；在20℃～26℃，反应30～120min，A型红细胞改造为O型红细胞，AB型红细胞改造为B型红细胞；所述缓冲溶液为由如下终浓度的物质组成的水溶液200～400mM甘氨酸，0～10mM NaCl；所述缓冲溶液的pH值为6.6～7.2。
2、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的ct-N-乙酰半乳糖胺酶， 是由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
3、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述离体A型红细胞为A1型或A2 型红细胞。
4、 根据权利要求l、 2或3所述的方法，其特征在于所述方法还包括用抗A抗 原抗体、抗Al抗原抗体和抗H抗原抗体鉴定改造得到的0型红细胞或B型红细胞的 步骤。
5、 根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述抗体为多克隆抗体或单克隆 抗体°
6、 一种体外改造红细胞血型的配套试剂，包括a -N-乙酰半乳糖胺酶和缓冲溶液; 所述a-N-乙酰半乳糖胺酶，是如下U)或(b)的蛋白质(a) 由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b) 将序列表中序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺 失和/或添加且具有a-N-乙酰半乳糖胺酶活性的由(a)衍生的蛋白质；所述缓冲溶液为由如下终浓度的物质组成的水溶液200 400 mM甘氨酸，0 10 mM NaCl;所述缓冲溶液的pH值为6. 6 7. 2。
7、 根据权利要求6所述的配套试剂，其特征在于所述配套试剂中还包括生理盐水和200 400 mM甘氨酸溶液。
8、 根据权利要求6或7所述的配套试剂，其特征在于所述配套试剂中还包括 抗A抗原抗体、抗A1抗原抗体和抗H抗原抗体。
9、 根据权利要求8所述的配套试剂，其特征在于所述抗体为多克隆抗体或单 克隆抗体。
全文摘要
本发明公开了一种红细胞血型的体外改造方法及其专用配套试剂。该红细胞血型的体外改造方法是用α-N-乙酰半乳糖胺酶处理离体A型或AB型红细胞，使A型红细胞改造为O型红细胞，使AB型红细胞改造为B型红细胞；用α-N-乙酰半乳糖胺酶处理离体A型或AB型红细胞的方法为将A型红细胞和AB型红细胞中的任一种红细胞和α-N-乙酰半乳糖胺酶加入缓冲溶液中，使α-N-乙酰半乳糖胺酶的终浓度为5～20U/ml、红细胞的压积为40％～20％；在20℃～26℃，反应30～120min，A型红细胞改造为O型红细胞，AB型红细胞改造为B型红细胞；缓冲溶液为由如下终浓度的物质组成的水溶液200～400mm甘氨酸，0～10mm NaCl；缓冲溶液的pH值为6.6～7.2。该方法可用于制备通用型红细胞。
文档编号C12N5/08GK101215549SQ20081005646
公开日2008年7月9日 申请日期2008年1月18日 优先权日2008年1月18日
发明者华 徐, 章扬培, 郁成雨 申请人:中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所