专利名称：：一种阿魏酸酯酶的提取方法
技术领域：
：本发明涉及一种阿魏酸酯酶的提取方法，具体的说，是一种从瘤胃液或产阿魏酸酯酶菌培养液中提取阿魏酸酯酶的方法。
背景技术：
：阿魏酸酯酶(E.C.3丄1.73,也被称为肉桂酸酯酶，肉桂酸水解酶)是水解植物细胞壁中羟基肉桂酸和糖之间酯键的一类酶，其催化的主要反应为多糖-阿魏酸酯+1120—阿魏酸+多糖(包括阿魏酸的一些衍生物)。近年来，阿魏酸酯酶在饲料消化中的作用日益引起人们的关注。秸秆和饲草干物质中约30%~80%为细胞壁成分，然而，反刍动物对这些细胞壁的消化利用率不超过50%。因此，细胞壁成为反刍动物消化秸秆和饲草的瓶颈因素。阿魏酸酯酶可以打开饲料细胞壁木质素中阿魏酸、对香豆酸及二聚阿魏酸等分子与半纤维素支链形成的致密网状交联结构，从空间上增加瘤胃微生物对细胞壁中纤维素和半纤维素的有效降解，因此阿魏酸酯酶已被推测为消除细胞壁降解限制因子的关键酶之一。人们发现不仅微生物可以向胞外分泌阿魏酸酯酶，哺乳动物和植物细胞也可产生阿魏酸酯酶。在此基础上，人们对这些酯酶的纯化和酶学特性进行了一定的研究，获得了相应的基因、蛋白质序列和三维结构。目前，对阿魏酸酯酶的纯化研究多集中于从单菌培养液中提取，分离提取处理过程与其它酶制剂相似，即通过离心除去菌体，然后对上清液进行超滤、硫酸铵沉淀及各种层析等处理，得到阿魏酸酯酶。单菌培养液中组分比较单一，阿魏酸酯酶的种类较少，提取过程较为简单。但对于成分较为复杂、阿魏酸酯酶种类较多的培养液或瘤胃液，则需要更为全面有效的分离步骤。
发明内容本发明的目的是提供一种可从瘤胃液或阿魏酸酯酶菌培养液中分离纯化阿魏酸酯酶的方法，该方法可以全面有效地从成分较为复杂、阿魏酸酯酶种类较多的培养液或瘤胃液中分离出各种阿魏酸酯酶。本发明通过各种分离纯化步骤地有机结合，从瘤胃液或培养液中分离阿魏酸酯酶。具体的说，瘤胃液或阿魏酸酯酶菌培养液经过滤离心、超滤浓缩、加热、离子交换层析、疏水层析及分子筛层析得到阿魏酸酯酶。本发明所提供的方法，其具体操作步骤如下1)过滤离心将新鲜的瘤胃液或培养液样品经四层医用纱布过滤，滤液经20，000xg4'C离心30分钟，去除菌体沉淀，收集上清液备用。2)超滤浓缩取上清液通过超滤膜进行超滤浓缩。首先通过截留分子量为100KDa的超滤膜超滤，收集〈00KDa的部分过10KDa的超滤膜超滤，弃去〈OKDa的部分，10-100KDa和"00KDa部分浓缩10倍，制得较高纯度的酶液，用冰块控制该酶液温度在4-l(TC之间，酶回收率可高达55%。3)加热根据不同阿魏酸酯酶的热稳定性不同，将超滤得到分子量在10-100KDa之间的浓缩液在50-70。C加热20-40分钟，10,000xg4'C离心10分钟，去除沉淀的变性蛋白。4)离子交换层析将分子量MOOKDa的浓缩液和分子量在10-100KDa之间的去除变性蛋白的浓縮液透析，浓缩，加入适量200mM磷酸钠缓冲液(pH7)和适量去离子水，混句，用强阴离子交换层析柱QSepharoseFastFlowcolumn进行分离，其上柱速度为0.5mL/min-5mL/min,优选为2mL/min。未结合的物质用50mM磷酸钠缓冲液(pH7)洗提，结合的蛋白质用梯度NaCl(O-lM)的50mM磷酸钠缓冲液(pH7)溶液洗提，收集有阿魏酸酯酶活性的部分，透析，浓缩，溶于适量lM(NH4)2SO450mM的磷酸钠缓冲液(pH7)。5)疏水层析将离子交换层析后制得的酶液先经0.45)am滤膜过滤，取适量用强疏水性预装柱HiTrapPhenylFFcolumn分离，其上柱速度为0.5mL/min-4mL/min，优选为0.5mL/min。未结合的部分用含1M(NH4)2SO450mM的磷酸钠缓冲液(pH7)洗脱。结合的部分用下降的梯度(NH4)2SO4(l-0M)的50mM磷酸钠缓冲液(pH7)溶液洗脱。收集有活性的部分，透析，浓缩，溶于适量50mM的磷酸钠缓冲液(pH7)。6)分子筛层析将疏水层析后制得的酶液经凝胶过滤柱SephacrylS-200HR16/60column层析，用50mM碟酸钠缓冲液(pH7)等度洗脱，速度为0.5111171^11-lmL/min，优选为0.7mL/min。收集有活性的部分，浓缩，制得高纯度的阿魏酸酯酶。本发明所提供的方法中，加热过程是否进行，可根据样品中阿魏酸酯酶的热稳定性来决定，加热温度及时间优选为6(TC、30分钟。本发明所提供的方法中，可根据蛋白质的纯化情况，选择性地进行疏水层析或分子筛层析分离过程。本发明所提供的方法中，离子交换层析和疏水层析的梯度洗脱过程可根据阿魏酸酯酶的出峰时间进行调整。本发明所提供的方法，可以从成分较为复杂、阿魏酸酯酶种类较多的培养液或瘤胃液中提取各种具有阿魏酸酯酶活性的蛋白质，有利于了解复杂体系中阿魏酸酯酶的概况，获得高活性酯酶。本发明在饲料工业中具有较高的实际应用价值。图l为利用本发明的方法在从肉牛瘤胃液中提取阿魏酸酯酶的过程中，分子量大于100KDa的样品经过离子交换层析后的分离图谱。图2为图1中阿魏酸酯酶II峰经透析浓缩后进行疏水层析的分离图谱。图3为利用本发明的方法在从肉牛瘤胃液中提取阿魏酸酯酶的过程中，分子量为10-100KDa的样品经过离子交换层析后的分离图谱。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例l肉牛瘤胃液的处理于清晨牛空腹时，通过牛的瘤胃瘘管从瘤胃中抽取瘤胃液1200mL，经四层医用纱布过滤，滤液经20,000xg4。C离心30分钟，去除菌体沉淀，收集1000mL上清液以备超滤等下道工序。取上清液首先通过截留分子量为100KDa的超滤膜超滤，收集〈00KDa的部分过10KDa的超滤膜超滤，弃去〈10KDa的部分，10-100KDa和M00KDa部分浓缩10倍，制得较高纯度的酶液，用冰块控制该酶液温度在5'C，酶回收率可高达55%。然后将超滤得到的分子量在10-100KDa之间的100mL浓缩液样品在60。C加热30分钟，10，000xg4。C离心10分钟，去除沉淀的变性蛋白。实施例2浓缩液样品的处理将分子量M00KDa的浓缩液和分子量在10-100KDa之间的去除变性蛋白的浓缩液100mL透析，浓缩，加入等体积200mM磷酸钠缓冲液(pH7)和2倍体积去离子水，混勻。取0.8mL分子量〉100KDa的样品用强阴离子交换层析柱QSepharoseFastFlowcolumn进行分离，速度为2mL/min，以50mM磷酸钠缓冲液(pH7)为A液，含lMNaCl的50mM磷酸钠缓冲液(pH7)为B液。未结合的物质用30mLA液洗脱，结合的蛋白质用一个五步梯度30mL10。/。B液，30mL25。/。B液，30mL50。/。B液，30mL75n/。B液，100mLB液洗提结合蛋白质，收集有阿魏酸酯酶活性的部分，透析，浓缩，溶于3mLlM(NH4)2S0450mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)。取4mL分子量为10-100KDa的样品用强阴离子交换层析柱QSepharoseFastFlowcolu證进行分离,速度为4mL/min,以50mM嫌酸钠缓冲液(pH7)为A液，含1MNaCl的50mM磷酸钠缓冲液(pH7)为B液。未结合的物质用30mlA液洗脱，结合的蛋白质按以下程序进行洗脱10mL0-25。/。B液，30mL25。/。B液，10mL25-50。/。B液，30mL50n/。B液，100mLB液，收集有阿魏酸酯酶活性的部分，透析，浓缩，溶于2mL1M(NH4)2SO450mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)。将离子交换层析后制得的分子量〉100KDa的酶液先经0.45pm滤膜过滤，取2mL用疏水柱HiTrapPhenylFFcolumn分离，其上柱速度为0.5mL/min，洗脱速度为1mL/min,以50mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)为A液，含1M(NH4)2S04的50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)为B液。未结合的部分用24mLB液洗脱。结合的部分用一个四步梯度20mL50n/。B液，20mL10°/必液，20mLA液，20mL去离子水洗提结合蛋白质。收集有活性的部分，透析，浓缩，溶于lmL50mM的磷酸钠(pH7.0)缓冲液。瘤胃液中阿魏酸酯酶初步提取中的总蛋白质、总活性、比活以及纯化倍数和具体的产率见下表l表1<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>权利要求1、一种提取阿魏酸酯酶的方法，其特征在于，包括以下步骤1)过滤离心对瘤胃液或产阿魏酸酯酶菌培养液进行过滤、离心，除去菌体沉淀，收集上清液；2)超滤浓缩通过超滤膜对1)中获得的上清液进行超滤浓缩；3)加热加热浓缩液，然后离心去除沉淀的变性蛋白；4)离子交换层析用离子交换层析柱分离浓缩液，收集有阿魏酸酯酶活性的部分，透析，浓缩，加入适当的缓冲液；5)疏水层析用疏水层析柱分离，收集有阿魏酸酯酶活性的部分，透析，浓缩，加入适当的缓冲液；6)分子筛层析用分子筛层析柱分离收集有阿魏酸酯酶活性的部分，浓缩。2、如权利要求1所述的提取阿魏酸酯酶的方法，其特征在于，包括以下步骤1)过滤离心将新鲜的瘤胃液或培养液样品经四层医用纱布过滤，滤液经20,000xg4'C离心30分钟，去除菌体沉淀，收集上清液备用，2)超滤浓缩取上清液通过超滤膜进行超滤浓缩。首先通过截留分子量为100KDa的超滤膜超滤，收集〈00KDa的部分过10KDa的超滤膜超滤，弃去〈10KDa的部分，10-100KDa和〉100KDa部分浓缩10倍，制得较高纯度的酶液，用冰块控制该酶液温度在4-l(TC之间；3)加热根据不同阿魏酸酯酶的热稳定性不同，将超滤得到分子量在10-100KDa之间的浓缩液在50-70。C加热20-40分钟，10,000xg4'C离心10分钟，去除沉淀的变性蛋白；4)离子交换层析对分子量〉100KDa的浓缩液和分子量在10-100KDa之间的去除变性蛋白的浓缩液进行透析，浓缩，过离子交换柱，未结合的物质用50mMpH7磷酸钠缓冲液洗提，结合的蛋白质用梯度0-lMNaCl的50mMpH7磷酸钠缓冲液洗提，收集有阿魏酸酯酶活性的部分，透析，浓缩，溶于适量lM(NH4)2SO4的50mMpH7磷酸钠缓冲液；5)疏水层析将离子交换层析后制得的酶液经柱分离，未结合的部分用1M(NH4)2S04的50mMpH7磷酸钠缓冲液洗脱。结合的部分用梯度l-0M(NH4)2S04的50mMpH7磷酸盐缓冲液洗脱。收集有活性的部分，透析，浓缩，溶于适量50mM的pH7磷酸钠缓冲液；6)分子筛层析将疏水层析后制得的酶液再通过分子筛层析柱层析，用50mM的pH7磷酸钠缓冲液等度洗脱，收集活性部分，浓缩，制得高纯度的阿魏酸酯酶。3、如权利要求1或2所述的提取阿魏酸酯酶的方法，其特征在于步骤3)中为在60'C下加热30分钟。4、如权利要求3所述的提取阿魏酸酯酶的方法，其特征在于，步骤4)中所使用的离子交换层析柱为强阴离子交换层析柱QSepharoseFastFlowcolumn,上柱速度为0.5mL/min-5mL/min。5、如权利要求4所述的提取阿魏酸酯酶的方法，其特征在于，上柱速度为2mL/min。6、如权利要求4所述的提取阿魏酸酯酶的方法，其特征在于，步骤5)中所使用的疏水层析柱为HiTrapPhenylFFcolumn,上柱速度为0.5mL/min一4mL/min。7、如权利要求6所述的提取阿魏酸酯酶的方法，其特征在于，上柱速度为0.5mL/min。8、如权利要求4或6所述的提取阿魏酸酯酶的方法，其特征在于，步骤6)中所使用的分子筛层析柱为SephacrylS-200HR16/60column,上柱速度为0.5mL/min-lmL/min。9、如权利要求8所述的提取阿魏酸酯酶的方法，其特征在于，上柱速度为0.7mL/min。全文摘要本发明涉及一种从瘤胃液或产阿魏酸酯酶菌培养液中提取阿魏酸酯酶的方法，该方法包括以下步骤1)过滤离心；2)超滤浓缩；3)加热；4)离子交换层析；5)疏水层析；6)分子筛层析。本发明根据不同种类阿魏酸酯酶的不同理化性质，通过各种分离纯化步骤的有机结合，从成分较为复杂、阿魏酸酯酶种类较多的培养液或瘤胃液中提取各种具有阿魏酸酯酶活性的蛋白质，获得了高活性酯酶。利用本发明的方法，可提取得到多种阿魏酸酯酶，从而达到了较好的生产效果，在饲料工业中具有较高的实际应用价值。文档编号C12N9/18GK101215553SQ20081005647公开日2008年7月9日申请日期2008年1月18日优先权日2008年1月18日发明者群岳,杨红建申请人:中国农业大学