专利名称：：具有肾保护作用的阿魏酸和黄芪甲苷组合物及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及制药领域。具体来说，是涉及一种具有肾保护作用的化学成分组合物及其制备方法和用途。
背景技术：
：许多肾脏疾病发展到一定阶段，无论原发疾患是否存在，肾脏损伤都会不断进展，其肾脏病理改变均表现为进行性加重的肾小球硬化和/或肾间质纤维化，正常肾组织结构被大量聚集的细胞外基质(ECM)所替代，最终导致终末期肾衰竭。已经公认，肾脏纤维化的程度也与肾功能恶化的进展速度密切相关。因此，延缓和阻断慢性进展性肾损害是防治终末期肾脏病的关键，也是国内外肾脏病界研究的热点。虽然对慢性进展性肾损害的防治研究从未中断，但迄今经循证医学证实并得到国际公认的肾保护作用药物仅有血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)和血管紧张素II的I型受体拮抗剂(ARB)。肾脏纤维化的发生机制主要涉及肾脏固有细胞的增殖活化、细胞转分化和细胞的凋亡，肾组织炎症细胞浸润导致的炎症介质和细胞因子释放，以及组织局部缺血缺氧等过程，最终导致肾组织中ECM大量积聚及纤维化的不断加重。我们的研究提示阿魏酸和黄芪甲苷组合物具有多途径、多环节、多重作用的特点O抑制肾组织转化生长因子(TGF-P,)的表达，抑制肾间质成纤维细胞的增殖活化及肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞的转分化，进而抑制肌成纤维细胞的增生和ECM的聚积；②减少肾间质内单核/巨噬细胞的浸润，减轻肾脏局部炎症反应；③增加肾脏局部一氧化氮(NO)生成，改善肾脏缺血缺氧状态。由此可见，阿魏酸和黄芪甲苷组合物具有减轻肾组织损伤、预防和/或治疗肾脏纤维化、延缓肾功能慢性进行性损伤等多重功能，具有推广到临床使用的意义。本发明旨在提供具有肾保护作用的组合物。发明创造内容本发明的目的是提供一种具有肾保护作用的组合物。本发明的又一目的是提供了具有肾保护作用组合物的制备方法。本发明的另外一目的是提供了该组合物的制药用途。本发明所述的具有肾保护作用的组合物的药效组分组成为1:5~5:1重量比的阿魏酸与黄芪甲苷；优选1:1.5~1:2.5重量比的阿魏酸与黄芪甲苷。制备本发明所述的具有肾保护作用的组合物的一种方法，是直接按1:55:1重量比混合阿魏酸与黄芪甲苷而获得该组合物的药效组分。优选1:1.5~1:2.5重量比混合阿魏酸与黄茛甲苷而获得该组合物的药效组分。本发明的发明人利用单侧输尿管结扎所致大鼠肾间质纤维化模型(UUO)进行的研究表明，阿魏酸和黄芪甲苷组合物具有防治肾间质纤维化的肾保护作用，其作用与ACEI类药物的肾保护作用相似，此保护作用表现为对肾间质纤维化的抑制作用，并且减轻肾间质纤维化的疗效机制可能与抑制TGF-(3t表达、减少肾间质肌成纤维细胞的数量并进而减少ECM合成有关。本发明人利用体外培养的肾脏固有细胞的研究表明，该组合物能够通过抑制肾脏间质成纤维细胞活化及肾小管上皮细胞转分化，从而抑制肌成纤维细胞的增生和ECM的合成；其抑制肾小管上皮细胞转分化的作用可能与阻断c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路的激活有关。本发明所述的组合物可以在制备具有肾保护作用的药物中应用，其中具有肾保护作用的药物是指预防和/或治疗肾脏纤维化的药物或延缓肾功能的慢性进行性损伤的药物。本发明所述组合物还可以在制备作为肾保护及预防和/或治疗进行性肾损害药物辅剂中应用。本发明所述组合物还可以在制备具有减轻肾小管上皮细胞病理损伤、促进细胞再生、减少肾间质炎性细胞浸润、减轻肾间质纤维化病变、降低肾小管间质损伤指数及减轻肾小管间质病变功效药物中应用。需要的时候，在该组合物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等，必要时还可以加入香味剂、甜味剂等，可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。图1梗阻性肾病模型各组肾组织病理照片(Masson,x200)图2梗阻性肾病模型各组肾组织层粘连蛋白表达的免疫组化照片(x200)图3梗阻性肾病模型各组肾组织纤粘连蛋白表达的免疫组化照片(x200)图4梗阻性肾病模型各组肾组织a-平滑肌肌动蛋白表达的免疫组化照片(x200)图5梗阻性肾病模型各组肾组织TGF-(31表达的的免疫组化照片(x200)图6组合物及其组分对梗阻性肾病模型肾组织NO生成的影响图7组合物及其组分对IL-lp诱导肾小管上皮细胞a-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)表达的影响(WestemBlot)。管家基因三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内参照。*P<0.05,与对照组相比；SP0.05,与IL-ip组相比。图8组合物及其组分对IL-ip诱导肾小管上皮细胞纤粘连蛋白(FN)表达的影响(WestemBlot)。*P<0.05，与对照组相比；#P<0.05与IL-ip组相比。图9组合物对IL-lp诱导肾小管上皮细胞JNK活化的影响(WesternBlot)。*P<0.05,与对照组相比；#P<0.05与IL-ip组相比。图IO组合物及其组分对TGF-(3,诱导成纤维细胞a-平滑肌肌动蚩白表达的影响(WesternBlot)。叩0.05,与对照组相比；#P<0.05与TGF-p!组相比。图ll组合物及其组分对TGF-A诱导成纤维细胞纤粘连蛋白表达的影响(WesternBlot)。*P<0.05,与对照组相比；#P<0.05与TGF-^组相比。图12组合物对TGF-p,诱导成纤维细胞a-平滑肌肌动蛋白mRNA表达的影响(RT-PCR)。叩<0.05,与对照组相比；#P<0.05与TGF-p,组相比。图13组合物对TGF-P,诱导成纤维细胞纤粘连蛋白mRNA表达的影响(RT-PCR)。*P<0.05,与对照组相比；#P<0.05与TGF-(3,组相比。具体实施例方式实施例1、组合物的制备方法分别称取化学纯品阿魏酸和黄芪甲苷，以l:1.5的比例混合得到混合物，此成分组合物具有肾保护作用。实施例2、组合物的制备方法分别称取化学纯品阿魏酸和黄芪甲苷，以l:2.25的比例混合得到混合物，此成分组合物具有肾保护作用。实施例3、组合物的制备方法分别称取化学纯品阿魏酸和黄芪甲苷，以l:1.7的比例混合得到混合物，此成分组合物具有肾保护作用。实施例4、组合物的制备方法分别称取化学纯品阿魏酸和黄芪甲苷，以黄芪甲苷18.9pg/ml，阿魏酸8.4pg/mr..........的比例混合得到混合物，此成分组合物具有肾保护作用。实施例5、组合物的制备方法分别称取化学纯品阿魏酸和黄芪甲苷，以5:l的比例混合得到混合物，此成分组合物具有肾保护作用。实施例6、组合物的制备方法分别称取化学纯品阿魏酸和黄芪甲苷，以l:5的比例混合得到混合物，此成分组合物具有肾保护作用。实验例l、组合物的肾保护作用1、组合物对肾间质纤维化模型一单侧输尿管梗阻模型(uuo)肾组织病理改变和功能损伤的保护作用采用雄性Wistar大鼠，按常规方法制备成单侧输尿管梗阻(UUO)模型，随机分成4组，即假手术(sham)对照组、模型组(UUO)、模型+血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)治疗组、模型+组合物治疗组、模型+阿魏酸治疗组和模型+黄芪甲苷治疗组；进行10天灌胃给药治疗。ACEI治疗组每只动物给予阳性药物依那普利(Enarapril)4mg/kg体重/天；组合物组每只动物给予上述组合物，低剂量组(实施例2):阿魏酸4.8mg/kg体重/天、黄宾甲苷10.8mg/kg体重/天，高剂量组(实施例3):阿魏酸12mg/kg体重/天、黄芪甲苷20.4mg/kg体重/天；黄芪甲苷组每只动物给予黄芪甲苷10.8mg/kg体重/天，阿魏酸组每只动物给予阿魏酸4.8mg/kg体重/天。正常组和模型组给自来水3ml/天。于第10天时结束实验，腹腔麻醉下经腹主动脉留取全血，随后切除左肾，留取肾门处横断面的肾组织。所留全血经常温下1500rpm离心IO分钟，留取血清立即送检测定血肌酐(Scr)、血尿素(Urea)。所留肾组织常规制备病理标本，分别行HE和Masson染色，用于肾脏病理学观察并评定肾小管间质损伤指数。结果如表1和图1所示，表1表明UUO模型组肾功能明显受损，疗效阳性对照药物依那普利治疗后可减轻肾功能损伤，组合物具有和依那普利相似的治疗作用。图1中肾脏病理学检查可见sham组仅偶有肾小管上皮细胞空泡变性，灶状单核细胞浸润；UUO模型组呈弥漫性肾小管上皮细胞空泡变性，多数肾小管扩张、萎縮，偶见坏死，肾间质水肿伴有多灶状炎性细胞浸润，多灶状肾间质纤维化；与模型组相比，依那普利治疗组可见肾小管上皮病理改变有所减轻，细胞出现再生现象，其肾间质炎性细胞浸润减少，肾间质纤维化病变减轻，仅呈局灶状分布；组合物治疗后的肾脏的组织形态学改变与依那普利组相似；上述各组的肾小球基本正常。对上述肾小管间质病变进行半定量分析显示(表l)，依那普利组和组合物治疗组肾小管间质损伤指数均较模型组下降(PO.05),表明组合物的治疗可有效减轻肾小管间质损伤，以上肾保护作用与依那普利治疗组的结果相似。而黄芪甲苷治疗组和阿魏酸治疗组均未显示出明显的肾脏保护作用，仅在阿魏酸治疗组的血尿素水平较UUO组有所下降。表l组合物及其组分对UUO大鼠肾功能和肾小管损伤指数的影响(^fcs)组别n血肌酐(Hmol/L)血尿素(mmol/L)肾小管间质损伤指数sham组335.44±2.175.80±0.491.12±0.24UUO组370.68土5.49'8.72士1.34'9.02±1.11*依那普利治疗组859.63±7.37*#7.81±1.39*#4.98±0.88*#组合物低剂量治疗组848.50±3.42*#6.70士0.56"5.97±1.07*#组合物高剂量治疗组849.00±6.87*#6.30±0.80*#5.62士1.23"黄贫甲苷治疗组863.87±10.45'8.67±1.32*7.95±1.61*阿魏酸治疗组862.25±5.87*7.51±0.42*#8條1.45'注*P<0.05:UUO组及各治疗组与sham组比较；#P<0.05:各治疗组与UUO组比较。2、组合物肾保护作用的机制6方法制成UUO模型，随机分成4组，即假手术(sham)对照组、模型组、模型+ACEI(依那普利)治疗组、模型+实施例1组合治疗组。进行10天灌胃给药治疗(各组所用剂量同前)。于第IO天时结束实验，腹腔麻醉下经腹主动脉留全血，随后切除左肾，留取肾门处横断面肾组织进行免疫组化检测。(1)对肾组织内纤粘连蛋白(FN)和层粘连蛋白(LN)表达及分布的影响FN和LN是肾间质纤维化过程中沉积于肾间质的重要的ECM蛋白成分。sham组肾小球及肾小管基底膜呈弱阳性，肾间质无着色；UUO组中FN和LN在肾间质及萎縮的肾小管周围表达，肾小球及肾小管基底膜呈中度或强阳性；依那普利组和组合物治疗组FN和LN在肾间质表达部位与UUO组一致，但表达量明显减少，肾小球及肾小管基底膜呈弱至中度阳性(图2所示为LN染色；图3所示为FN染色)。半定量分析结果(表2)显示，UUO组的FN和LN表达均较sham组明显上调(P<0.01);依那普利组和组合物治疗组肾间质FN和LN表达明显减少，与UUO组相比均有显著差异(P<0.01);组合物治疗组抑制FN和LN上调表达的作用与依那普利基本相同，二组间无显著性差异(P>0.05)，表明组合物可减少ECM积聚，减缓肾间质纤维化。(2)对肾脏固有细胞转分化的影响肾脏病进展过程时浸润至肾间质中的中性粒细胞和单核/巨噬细胞可分泌多种致肾纤维化细胞因子如TGF-P,、血小板源性生长因子(PDGF)等促进间质成纤维细胞活化及肾小管上皮细胞转分化为合成ECM的肌成纤维细胞，而平滑肌细胞骨架蛋白oc-平滑肌肌动蛋白(cc-SMA)是肌成纤维细胞的细胞标志物。研究发现sham组的血管壁平滑肌细胞a-SMA呈强阳性，肾小球和肾小管上皮细胞无明显着色，肾髓质稀疏散在分布呈弱阳性;UUO组cc-SMA表达部位以肾间质为主，尤其是在萎縮或扩张的肾小管周围及纤维化的肾间质中其表达明显增加；依那普利治疗组和组合物治疗组的a-SMA仅表达在少数肾小囊周围，在肾小管基底膜周围和间质细胞浸润处的表达明显减少〔图4)。半定量分析比较表明(表2)，UUO组的a-SMA表达较sham组明显上调(P<0.01);依那普利组和组合物治疗组a-SMA表达量均较UUO组明显减少(P<0.05);组合物治疗组抑制a-SMA表达的作用与依那普利组基本相同，组间差异不显著(P>0.05)。表明组合物可通过抑制间质成纤维细胞活化和肾小管上皮细胞转分化，起到减轻缓间质纤维化的作用。(3)对肾内TGF-P!和ECM积聚的影响TGF-^是一种多功能的细胞因子，在ECM的合成和积聚中起重要作用。组化结果显示sham组肾小管仅偶有TGF-卩!着色且不明显；UUO组TGF-^的表达主要位于萎縮和扩张的肾小管上皮细胞内，尤其在肾间质有单核/巨噬细胞浸润的远端和近端肾小管上皮细胞内表达7明显。在依那普利组和组合物组中的表达部位主要位于扩张的小管上皮细胞内，仅少量散在表达(结果如图5所示)。半定量分析比较表明(表2)，UUO组的TGF-Pi表达较sham组明显上调(P〈0.01)，依那普利组和组合物治疗组TGF-(3!表达量均较UUO组明显减少(P〈0.05)，与上述的FN、LN及a-SMA的表达变化一致。尽管组合物抑制UUO鼠肾小管TGF-(3,上调的作用稍弱于依那普利(P<0.05)，但在抑制a-SMA和ECM成分的表达方面组合物组与依那普利组并无显著差异。对TGF-p!与a-SMA、FN、LN表达及各组肾小管间质损伤指数分别进行相关分析，结果显示TGF-Pi分别与肾小管间质损伤指数(r=0.834，P<0.01)、a-SMA(r=0.934，P<0.01)、FN(r-0.927，P<0.01)禾BLN(r=0.926,P<0.01)均呈显著正相关。上述结果证实组合物可抑制TGF-p,在肾小管的生成上调，并可抑制与之密切相关的细胞表型标志物表达和ECM分泌，提示组合物对TGF-^的抑制作用可能是其抗肾间质纤维化的关键环节之一。表2各组大鼠肾小管间质表达FN、LN、a-SMA和TGF-Pi的比较(its)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注承PO.05，"P〈0.01，与sham组相比#P<0.05;，与UUO组相比*P<0.05,与依那普利组相比(4)对肾组织一氧化氮生成的影响在慢性肾脏病的早期中，即可出现以肾血管的内皮细胞中一氧化氮(NO)生成减少为标志的内皮细胞功能紊乱，促使血管功能和结构的改变及组织局部缺血缺氧，促进炎症细胞浸润及氧自由基产生，加重肾脏损伤。酶联免疫吸附试验(ELISA)结果显示UUO组肾组织中NO表达与sham相比，没有明显差异；而阿魏酸和黄芪甲苷及其组合物治疗后，均可明显增加梗阻肾组织中NO的表达(P<0.01，见图6)，提示组合物有助于改善病变肾组织内皮细胞功能紊乱，这可能是其抗肾间质纤维化作用的机制之一。实验例2、组合物对肾脏固有细胞产生ECM的抑制作用1、组合物对人肾小管上皮细胞系(HK-2)转分化标志物(a-SMA表达)及细胞外基质(FN)分泌和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)活性的影响肾小管上皮细胞转分化为分泌ECM的肌成纤维细胞是肾脏纤维化的发生机制之一，细胞中a-SMA表达是细胞发生转分化的判断依据之一，丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的激活在其过程中起到重要的调控作用。本实验在培养的人肾小管上皮细胞系(HK-2)中，以白介，采用免疫印记或酶联免疫吸咐试验(ELISA)方法，观察动物实验浓度的1%剂量的组合物(实施例4组合物黄芪甲苷18.9吗/ml，阿魏酸8.4昭/ml)对a-SMA表达、FN分泌和MAPK的JNK亚类激酶活性的影响。结果(图7、图8)显示IL-1(3可刺激HK-2细胞a-SMA表达和FN分泌(PO.05),而组合物可明显抑制IL-lp导致的a-SMA表达和FN分泌(P<0.05)。实验还发现IL-1(3可诱导HK-2细胞的JNK活性增高(P<0.05)，且JNK通路阻断剂SP600125可明显抑制IL-ip刺激的a-SMA表达；而组合物预处理24小时或30分钟均可显著抑制IL-l卩对JNK的活化作用(P<0.05，附图9)。以上结果表明组合物能够抑制肾小管上皮细胞JNK活性和a-SMA表达以及FN的分泌，提示组合物通过阻断JNK信号通路的激活而抑制肾小管上皮细胞转分化，减轻ECM合成，可能是其抑制肾脏纤维化的机制之一。2.组合物对大鼠肾间质成纤维细胞活化标志物(a-SMA和FN表达)的影响肾间质成纤维细胞的增殖活化是肾脏纤维化的发生机制之一，而活化标志物(a-SMA和FN表达)是细胞活化的重要判断依据。本实验选用正常大鼠肾间质成纤维细胞系(NRK-49F),以TGF^为刺激物，应用Western蛋白印迹法和逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法观察动物实验浓度的1%剂量的组合物(实施例4组合物黄芪甲苷18.9吗/ml，阿魏酸8.4pg/ml)对TGF-P,上调细胞a-SMA和FN蛋白及其mRNA表达变化的影响。结果显示，TGF-(3！刺激24小时后，细胞a-SMA和FN蛋白表达较对照组显著升高(P<0.05)，而组合物可明显抑制细胞a-SMA和FN蛋白表达的升高(PO.05;图10，图ll)，而单独加入组合物的单体组分阿魏酸或黄芪甲苷不影响a-SMA和FN的表达(P>0.05)。同时组合物还可抑制TGF-(3i对a-SMA和FNmRNA水平的上调(PO.05;图12，图13)。以上结果表明组合物可以抑制TGF-Pt诱导的肾间质成纤维细胞a-SMA表达和FN高表达，提示组合物通过抑制肾间质成纤维细胞的增殖活化及ECM合成，可能是其抑制肾脏纤维化的机制之一。9权利要求1.一种具有肾保护作用的组合物，其特征在于它的药效组分为1:5～5:1重量比的阿魏酸与黄芪甲苷。优选重量比为。2.根据权利要求1的组合物，其中它的药效组分为1:1.51:2.5重量比的阿魏酸与黄芪甲苷。3.制备权利要求1具有肾保护作用的组合物的方法，它包括按1:5~5:1重量比混合阿魏酸与黄丧甲苷而获得药效组分。4.根据权利要求3的制备方法，它包括按1:1.5~1:2.5重量比混合阿魏酸与黄氏甲苷而获得药效组分。5.权利要求1或2所述组合物在制备具有肾保护作用的药物中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其中具有肾保护作用的药物是指预防和/或治疗肾间质纤维化的药物。7.根据权利要求5所述的应用，其中具有肾保护作用的药物是指延缓肾功能的慢性进行性损伤的药物。8.权利要求1或2所述组合物在制备作为肾保护及预防和/或治疗进行性肾损害药物辅剂中的应用。9.权利要求1或2所述组合物在制备具有减轻肾小管上皮病理改变、促进细胞再生、减少其肾间质炎性细胞浸润、减轻肾间质纤维化病变、降低肾小管间质损伤指数或减轻肾小管间质损伤功效药物的应用。全文摘要本发明公开了一种具有肾保护作用的组合物，它的组分为1∶5～5∶1重量比的阿魏酸与黄芪甲苷。它可由化学成分阿魏酸和黄芪甲苷混合得到。该组合物具有与血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)相似的防治肾间质纤维化的肾保护作用，可用于制备肾保护药物，也可用于制备预防和/或治疗肾间质纤维化药物，还可作为肾保护及预防和/或治疗进行性肾损害药物辅剂。文档编号A61K31/7042GK101455675SQ20081011543公开日2009年6月17日申请日期2008年6月24日优先权日2008年6月24日发明者孟立强,尚明英,李晓玫,王海燕,蔡少青申请人:北京大学