一种深绿木霉制备耐热耐酸阿魏酸酯酶的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种深绿木霉制备耐热耐酸阿魏酸酯 酶的方法。
【背景技术】
[0002] 阿魏酸醋酶（E. C13. I. L 73, feruloyl esterase，FAE)是近来研宄较热的一种羧 酸酯酶，它是一种胞外酶，可以水解阿魏酸甲酯、多糖阿魏酸酯等中的酯键，将释放出游离 的阿魏酸单体或二聚体。在食品和医药领域中，利用阿魏酸酯酶来降解植物细胞壁中的阿 魏酸酯键，可以得到有药用价值和保健功能的游离阿魏酸。阿魏酸是桂皮酸的一种衍生物， 其化学名称为4-羟基-3-甲氧基肉桂酸，也是一种天然的抗氧化剂，对心血管疾病、糖尿 病、老年痴呆症和肿瘤等疾病有治疗作用。
[0003] 在饲料工业中，农作物秸杆等饲料细胞壁中阿魏酸、对香豆酸及二聚阿魏酸等木 质素分子以醋键方式与半纤维素支链形成的致密网状交联结构，从空间上限制了瘤胃微生 物对细胞壁中纤维素和半纤维素的有效降解。经阿魏酸酯酶处理后，饲料原料变得较为疏 松，能加快植物细胞壁等成分在瘤胃的降解速度，提高反刍动物对饲料的消化程度。在造纸 工业中，经阿魏酸酯酶处理的原料，木质素更容易脱除，因而可以减少制浆工序中化学药品 的使用量。
[0004] 作用深绿木霉阿魏酸酯酶作为耐热性耐酸阿魏酸酯酶，可以弥补阿魏酸酯酶应用 上的不足，其最适PH为6. 5-7. 5,可适用于一些消化道程酸性的家畜。同时，该酶具有良好 的耐热性，可有效抵御饲料制粒膨化过程中高温引起的酶失活。因此耐热性耐酸阿魏酸酯 酶具有重要的应用价值。
[0005] 目前阿魏酸的生产方法主要包括化学合成法和碱解法，但这两种方法均存在一定 的缺陷。化学合成法反应步骤多、周期长；碱解法的原料谷维素在米糠中含量低，产量受限； 此外，这两种方法都具有污染性，因此酶法生产阿魏酸成为近年来研宄的热点。固态发酵生 产酶制剂作为酶制剂工业一个重要发展方向，以其发酵周期短、能耗少、水的消耗量较低、 对环境污染程度低、单位产量大等优点受到广泛的重视。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是克服现有技术的不足，以深绿木霉为生产菌株，通过发酵菌种的 准备、三角瓶固态发酵、曲盘固态发酵、粗酶制剂制备、粗酶制剂纯化的工艺步骤制备耐热 阿魏酸酯酶，所得酶制剂不仅耐酸性好，而且具有较强的耐热能力。
[0007] 所述的深绿木霉（Trichoderma atroviride)AWS26,已于2014年1月2日保藏于 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC)，地址：中国北京市朝阳区 北辰西路1号院3号，邮编100101，保藏编号：CGMCC No. 8673。
[0008] 所述深绿木霉制备耐热耐酸阿魏酸酯酶的方法，包括以下步骤：
[0009] 步骤1，菌种制备：挑取菌种孢子接种于活化斜面培养基上活化，30-35?培养箱 培养3-5天，用生理盐水将活化好的深绿木霉稀释至孢子浓度为IO7个/mL，再接种所得孢 子悬浮液2mL到50g固态孢子培养基中，30-40°C培养箱培养3-4天，用生理盐水将孢子浓 度稀释至I. 2-1. 6X 108cfu/mL，然后接种2mL孢子悬液到IOOmL液体种子培养基，置于摇床 30-40°C培养 l-2d，摇床转速 160-250r/min ;
[0010] 步骤2,深绿木霉三角瓶固态发酵：将步骤1所得深绿木霉液体种子2mL接种到固 态培养基50g，35-40°C培养2-3d，将温度提高至40-45°C继续培养2天，添加补料液体营养 液10-20mL，再将温度降至30-37°C下培养7-8d ;
[0011] 步骤3,深绿木霉曲盘固态发酵：在三角瓶固态发酵的基础上进行曲盘放大试验， 曲盘大小为36cmX20cmX6cm，装料量为180克培养基/曲盘，固液比1.2:1，初始？册.5， 33-35 °C下静止培养72h，期间翻曲3-4次，然后添加补料液体营养液20mL，温度调至 35-40°C，继续培养24h，中间翻曲2次，最后将温度降至28-32°C，再培养24h，得粗酶液；
[0012] 步骤4,阿魏酸酯酶粗酶制剂制备：将步骤3所得粗酶液依次经过浸提、超滤、旋转 蒸发，得粗酶浓缩液；
[0013] 步骤5,粗酶制剂纯化：将步骤4所得粗酶浓缩液依次经过硫酸铵分级沉淀、脱盐、 脱色、超滤、离子交换层析、疏水柱层析和凝胶过滤层析后，冷冻干燥，得纯品。
[0014] 作为上述发明的进一步改进，步骤1中活化斜面培养基配方：土豆浸出液100mL， 麸皮浸出液100mL，无机盐液lmL，鹿糖lg，琼脂粉3g，pH5. 0-6. 0,121°C灭菌15min ;固态孢 子培养基配方：麸皮5g，玉米粉lg，谷糠 lg，豆饼粉2g，无机盐溶液lmL，土豆浸出液8mL， 121°C灭菌15min ;液体种子培养基配方：麸皮浸出液100mL，土豆浸出液100mL，蔗糖lg，无 机盐溶液 lmL，ρΗ5· 0,121°C 灭菌 20min。
[0015] 作为上述发明的进一步改进，步骤2中固态发酵培养基配方：玉米秸杆粉lg，大豆 秸杆粉2g，地瓜秧草粉lg，麸皮4g，玉米粉lg，豆饼粉2g，蛹虫草栽培后废弃培养基2g，无 机盐液 10mL，121°C 灭菌 20min。
[0016] 作为上述发明的进一步改进，步骤3中曲盘固态培养基配方为：大豆秸杆粉2g，地 瓜秧草粉lg，麸皮4g，玉米粉lg，豆饼粉2g，蛹虫草栽培后废弃培养基2g，无机盐液10mL， 121°C 灭菌 20min。
[0017] 作为上述发明的进一步改进，步骤3中所述补料液体营养液的制备方法为：玉米 秸杆、黄豆秸杆、地瓜秧均粉碎至40目，按照质量比1:1:1混合，然后向固体混合物中加入 去离子水至浓度为1〇?七％，煮沸3〇!1^11，过滤去除深褐色滤液，向滤渣中加入浓度为1 ￥八％ 的稀硫酸，固体混合物和稀硫酸的质量体积比为1:10,于121°C水解2h，冷却至60°C并在该 温度下用Ca (OH) 2调节水解液至pH10. 0,60°C水浴保温30-40min，冷却至室温，过滤除去滤 渣并保留水解液，再用HCl调节pH至6. 0,即得到补料液体营养液。
[0018] 本发明与现有技术相比，其显著优点在于：第一，本发明采用营养液补料法，在原 发酵的基础上，进一步发酵产酶，显著提高了单位培养基产酶量，酶活高达：17. 92U/g ;第 二，该方法所得阿魏酸酯酶，不仅耐酸性好，而且具有较强的耐热能力，特别适合用作饲用 酶制剂；第三，粗酶制剂经过硫酸铵沉淀、阴离子交换层析、疏水柱层析以及凝胶过滤层析 等纯化步骤后，阿魏酸酯酶纯化了 219倍，活性回收率为27% ;第四，发酵周期短、能耗少、 水的消耗量低、对环境污染程度低、单位产量大。
【附图说明】
[0019] 图1为实施例2中阿魏酸酯酶离子交换层析后洗脱图谱；
[0020] 图2为实施例2中阿魏酸酯酶分子筛凝胶过滤层析后洗脱图谱；
[0021] 图3为实施例2中阿魏酸酯酶纯化电泳图。
【具体实施方式】
[0022] 实施例1
[0023] 本实施例说明深绿木霉AWS26的筛选方法，具体步骤如下：
[0024] 步骤1，采样及样品处理：
[0025] 从江苏省徐州市云龙区大韩村正处于高温发酵的堆肥中取土样10份。称取固体 土样5g，放入装有玻璃珠及50mL已灭菌生理盐水的三角瓶中，160r/min振荡30min，制成悬 液，然后将此三角瓶放入60-70°C恒温震荡水浴锅中，lOOr/min震荡处理20-30min，得土样 浑浊液。
[0026] 步骤2,富集培养