一株深绿木霉ta-9菌株及其在水稻病害防控中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物领域，设及一株深绿木霉菌（Trichoderma atrovi;ride)TA-9及 其在水稻病害防控中的应用。 技术背景
[0002] 目前，使用化学农药是农作物病害防治的主要措施之一。化学农药在提高农产品 产量和品质方面起到了重要作用，但大量使用化学农药也导致了如环境污染、生态破坏、农 产品农药残留和病原菌产生抗药性等一系列问题。充分利用综合防控措施对植物病害进行 防治，减少化学农药使用，已成为植保工作者的共识。利用环境中的有益微生物防控植物病 害是热点研究方向之一。木霉作为植物病害生防因子一直收到普遍关注。木霉常见于±壤 中，是±壤微生物的重要群落，对多种植物病原真菌，如立枯丝核菌、腐霉、疫霉、轮枝菌、镶 刀菌等具有括抗和寄生作用，目前已形成商业化木霉生防制剂，如，美国的Topshield(哈 茨木霉T22)、W色列的Trichodex (哈茨木霉T39)、新西兰的木霉制剂Tricho化y和 Trichoflow等。鉴于木霉菌来源广泛，对不同植物病原菌的括抗和寄生能力有不同，其应用 植物对象也有差异，因此仍需针对某些重要植物病害进行木霉菌株的筛选和开发应用。
[0003] 水稻在其生长季受多种真菌病害的威胁。如，随着优质高产水稻品种在我国大面 积推广种植，为水稻纹枯病和稻曲病等真菌病害提供了较好的流行发生条件，病害发生呈 现上升趋势。其中水稻纹枯病为我国水稻上的主要病害之一，目前抗病育种中尚缺乏有效 的抗病基因。水稻纹枯病为上传病害，病原菌为立枯丝核菌巧hizoctonia solani)，病原菌 先侵入茎基部叶銷随后扩展。生产上主要使用微生物源杀菌剂井冈霉素和=挫类化学杀菌 剂如丙环挫、苯離甲环挫、己挫醇等进行防治。其中，井冈霉素长期超量单一使用防治水稻 纹枯病，已有部分地区水稻纹枯病菌产生抗药性且防治效果有所下降的报道。
[0004] 稻曲病在我国各大稻区均有发生，已成为水稻上的重要病害之一，其病原菌为稻 绿核菌扣Stilaginoidea Virens),可侵入谷粒形成稻曲球，并产生对人畜有毒的毒素，降 低水稻产量和品质，影响食品安全。稻曲病防治最佳时期为水稻破口前5~7天，目前水稻 生产上也长期主要使用井冈霉素进行防治。
[0005] 生物防治作为一项重要的病害防控措施已得到社会的广泛认可和关注。在水稻病 害防治领域，生防制剂仍较缺乏，更多高效、安全、稳定的生物农药亟需开发，而木霉菌作为 一类公认的具有生防潜力的真菌具有较好的应用开发前景。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种深绿木霉，它可W作为生物农药防治多种水稻病害。
[0007] 本发明的目的是通过下列技术措施实现的：本发明深绿木霉（Tr i choderma atroviride)TA-9菌株是从南京市200份被真菌寄生的水稻稻曲球样品中分离获得，已于 2014年9月23日被中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中屯、（CGMCC)保藏，其保藏 编号为CGMCC No. 9698, W上所述木霉菌菌株的ITS序列如SEQ ID No. 1所示。拉了学名 为；Trichoderma atroviride TA-9。
[000引菌株培养特性记载为：在PDA培养基上最适生长温度为25-30°C，最高生长温度为 37°C。30°C培养2d，菌落直径可达到6. 1cm。在PDA上培养4山中央可形成绿色的分生抱子 产抱区域，有挪子气味。
[0009] 菌株形态特征包括；分生抱子梗的可育延伸物没有或很少产生，没有不育的菌 毛；分生抱子梗典型分枝方式为单侧分枝，分枝角度近似90°。瓶梗直或弯曲，常为单生， 2-4个则呈旋祸状排列。分生抱子绿色，表面光滑，球形或亚球形，3. 0~5. 0 ymX 2. 3~ 4. 0 ym，长宽比值为0. 8~1. 6,无明显的脱落痕迹。
[0010] 本发明采集江苏省散落稻田中的稻曲球，半埋于湿润的石英砂中，28 °C培养 15-20d，分离稻曲球上的寄生真菌，分离纯化菌株，然后依次与立枯丝核病菌（化izoctonia solani)和稻绿核菌化stilaginoidea virens)进行离体对時病原菌抑制试验。经过反复 筛选，最终选出对立枯丝核菌和稻绿核菌具有强寄生作用、可高产厚垣抱子和分生抱子的 木霉菌菌株，编号为TA-9。通过菌落、分生抱子梗、瓶梗、分生抱子等形态特征W及内转录基 因间区核巧酸序列（口巧的检测，确定该菌株为深绿木霉（Trichoderma atroviride)。
[0011] 深绿木霉TA-9的厚垣抱子和分生抱子液体发酵物的获得，包括如下步骤： (1) 菌株活化；将深绿木霉TA-9移至PDA斜面培养基上，在28-30°C下培养7d ; (2) 用无菌水洗下PDA斜面培养基上的分生抱子，用血球计数板计数后将抱子液浓度 调节至1. 〇Xl〇6个/血； (3) 配制液体发酵培养基，每200mL培养基装入1L S角培养瓶中，121°C湿热灭菌 30min ； (4) 每200mL液体发酵培养基中加入步骤（2)中所述木霉分生抱子液2mL; (5) 在黑暗条件下，30°C，160r/min摇培7-9d，将发酵培养物用组织捣碎机打碎后获得 含有5. 4X 107个/血的厚垣抱子和1. 6 X 10 8个/血分生抱子的发酵混合液；
[0012] 步骤（1)中，PSA培养基组分；200g马铃馨煮液、20g葡萄糖，琼脂20g，用水定容至 1L。分装后121°C湿热灭菌备用。 步骤（2)中，液体发酵培养基组分；15g玉米粉、20g燕麦粉，调节抑至5.0,用水定容 11。
[00巧]本发明有益效果： (1) 本发明提供一种新的生防菌株一-深绿木霉TA-9菌株，该木霉菌株对立枯丝核菌 (Miizoctonia solani)和稻绿核菌OJstilaginoidea virens)具有较强的寄生能力；该菌 株的液体发酵物可作为生防菌剂用于防治由立枯丝核菌巧hizoctonia solani)引起的水 稻纹枯病和由稻绿核菌扣stilaginoidea virens)引起的稻曲病。 (2) 该菌株发酵工艺简单易行，其中厚垣抱子含量高，将有利于长时间贬藏。
【附图说明】
[0016] 图1为深绿木霉菌株TA-9在菌落对時培养中重寄生立枯丝核菌和稻绿核菌的照 片。
[0017] 图2为深绿木霉菌株TA-9对水稻纹枯病的防效。
[001引图3为深绿木霉菌株TA-9对稻曲病的防效。
【具体实施方式】
[0019] W下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不W任何形式限制 本发明。在不脱离本发明构思的前提下，还可W做出若干变形和改进。该些都属于本发明 的保护范围。
[0020] 实施例1 ;分离获得深绿木霉（Trichoderma atroviride)TA-9菌株的方法。
[0021] PDA培养基配方为；马铃馨200g/l，葡萄糖20g/l，水比，琼脂20g/L(固体培养 基）。将马铃馨去皮后切成小块，加1L水后煮沸30min，用2层纱布过滤，滤液加葡萄糖，加 水补足至比，如制作固体培养基需加入琼脂后并煮沸，分装后121°C湿热灭菌。
[00巧包括W下步骤： (1) 菌株分离、纯化和保存。在南京市多处水稻田中的收集水稻采收后7-10天散落在