一种吡嗪酰胺水解酶与其编码基因和应用的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，具体而言，涉及一种吡嗪酰胺水解酶及其编码基因和应用。
背景技术：
：吡嗪酰胺是世界卫生组织推荐用于治疗结核病的一线药物之一。该药物本身没有抗菌活性，而是在病原菌体内被水解成吡嗪酸，从而在酸性ph环境中持续杀死存在于人群中结核杆菌的能力，可将治疗时间由9-12个月缩短至6个月。尽管吡嗪酰胺在治疗结核病方面的重要性已经被人们认可，但其作用机制可能是所有抗结核药物中最不了解的。目前，越来越多的耐药结核菌株的出现已经对吡嗪酰胺的抗菌活性构成主要挑战，吡嗪酰胺是没有显著抗菌活性的前体药物，被代谢为其活性形式——吡嗪酸，通过由吡嗪酰胺水解酶基因编码的水解酶活性水解生成吡嗪酸，用于杀死结核分枝杆菌。吡嗪酰胺水解酶中的突变是目前结核分枝杆菌中吡嗪酰胺抗性的主要机制。吡嗪酰胺水解酶已经在许多微生物中发现，例如大肠杆菌，酿酒酵母。该酶可将吡嗪酰胺转化为吡嗪酰酸。人们研究了某些细菌吡嗪酰胺水解酶的生物化学特征，并且已经很好地表征了结核分枝杆菌吡嗪酰胺水解酶mtpnca，但是在假诺卡氏菌(pseudonocardiacarboxydivorans)中吡嗪酰胺水解酶没并没有得到表征。技术实现要素：本发明人在pseudonocardiacarboxydivorans中发现了一个开放阅读框架(orf)，与mtpnca具有62％的序列同源性。发明人克隆并表达了该基因，意外发现其是一种活性较高的吡嗪酰胺水解酶，特别适合治疗已产生吡嗪酰胺耐药性的患结核病的人群。因此，本发明的主要目的在于提供一种新的吡嗪酰胺水解酶及其编码基因和应用。为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验研究并不懈努力，最终获得了如下技术方案：一种吡嗪酰胺水解酶，该水解酶具有seqidno.1所示的氨基酸序列；或该水解酶是在seqidno.1所示的氨基酸序列基础上缺失、替换、插入或/和添加一个至几个氨基酸的保守性突变而获得的具有水解吡嗪酰胺活性的保守性变异体。需要说明的是，本发明所提供的吡嗪酰胺水解酶属于半胱氨酸水解酶超家族中的一员。seqidno.1所示的氨基酸序列由191个氨基酸残基组成。为了使上述蛋白质便于纯化，可在上述的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1标签的序列标签残基氨基酸序列poly-arg5-6(通常为5个)rrrrrpoly-his2-10(通常为6个)hhhhhhflag8dykddddkstrep-tagii8wshpqfekc-myc10eqkliseedl上述吡嗪酰胺水解酶蛋白质可以人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述中的蛋白质的编码基因还可通过将seqidno.1所示的氨基酸序列中，缺失、置换、插入或添加一个至几个并保持原有酶活性，或者连上表1所示的标签的编码序列得到。本发明还提供了一种吡嗪酰胺水解酶的编码基因，该基因编码：(a)具有seqidno.1所示的氨基酸序列的蛋白质；或(b)具有衍生自缺失、置换、插入或添加一个至几个氨基酸的seqidno.1所示的氨基酸序列并具有吡嗪酰胺水解酶活性的蛋白质。进一步地，所述吡嗪酰胺水解酶的编码基因为(i)、(ii)或(iii)的dna分子：(i)具有seqidno.2所示的核苷酸序列的dna分子；(ii)在严格条件下与(i)所述的核苷酸序列杂交且编码具有水解吡嗪酰胺活性的蛋白质的dna分子；(iii)与(i)或(ii)所述dna分子的核苷酸序列具有90％以上同源性的核苷酸序列的dna分子。进一步，所述严格条件为钠离子浓度为50-300mm的溶液中，反应温度为50-68℃。例如：在进行分子杂交的过程中，可以为在6×ssc、质量分数为0.5％的sds的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×ssc，质量分数为0.1％的sds和1×ssc、质量分数为0.1％的sds各洗膜一次。其中sds的中文名称为十二烷基硫酸钠，1×ssc包括0.15mol/lnacl和0.015mol/l柠檬酸；sds以及不同浓度倍数的ssc均为本领域的常用试剂。含有上述任一所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。本发明提供一种重组载体，包括上述的吡嗪酰胺水解酶的编码基因。所述重组载体为将上述编码基因插入出发载体(例如：pet28a)的多克隆位点得到的重组表达载体。可用现有的表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。本发明还提供一种转化体，包含上述的重组载体。转化体可以为重组菌，例如，将上述任一所述编码基因插入出发载体(例如：pet28a载体)的多克隆位点得到的重组表达载体转化至大肠杆菌bl21(de3)，得到重组菌。本发明还提供一种引物对，用于扩增上述的吡嗪酰胺水解酶的编码基因全长及其任意片段。例如：引物对的序列如seqidno.3和seqidno.4所示。上述所述蛋白质、上述所述编码基因、上述所述重组表达载体、所述表达盒、转基因细胞系或重组菌中任一种在降解吡嗪酰胺和烟酰胺中的应用也属于本发明的保护范围。另外，本发明还可以将吡嗪酰胺与吡嗪酰胺水解酶联合用于治疗结核病，特别是对于已产生吡嗪酰胺耐药性的患结核病的人群。因此，本发明还提供一种治疗结核病的药物组合物，该药物组合物包含上述的吡嗪酰胺水解酶。进一步优选地，该药物组合物除含有上述的吡嗪酰胺水解酶外，还包含吡嗪酰胺。一种上述的吡嗪酰胺水解酶在水解酰胺键中的应用。例如：用于水解吡嗪酰胺，烟酰胺等。在具体应用的过程中，可以采用下面的方法：以吡嗪酰胺，烟酰胺为底物，在中性ph8.5条件，利用吡嗪酰胺水解酶对吡嗪酰胺，烟酰胺进行酶解。所述的降解条件包括：反应体系的温度35-50℃，优选为45℃，反应体系的ph值为7.5-9.0，优选为8.5。本发明还提供一种生产吡嗪酰胺水解酶的方法，该方法包括培养上述述的转化体并由培养产物中收集吡嗪酰胺水解酶。收集的吡嗪酰胺水解酶可以进一步进行纯化。本发明的有益效果是：本发明所述的蛋白具有水解吡嗪酰胺的活性，属于一种酰胺水解酶。并且该蛋白与其他已表征的吡嗪酰胺水解酶的氨基酸序列相比，相似性不大于65％，属于半胱氨酸水解酶超家族中一员。本发明所述吡嗪酰胺水解酶最适天然底物为烟酰胺，且具有在中性及偏碱性ph条件下活性高的特性。本发明对吡嗪酰胺(pza)也有很好的酶活，实验表明：本发明所述吡嗪酰胺水解酶，以pza为底物，在45℃、ph为8.5的条件下具有最高的酶活性，为17.20u/mg蛋白,一个酶活单位为每分钟生成1μmol产物所需的酶量；该酶在35-50℃温度范围内，酶活均较高；在ph6.5至ph10.0的ph值范围内，酶活均较高。该酶在ph7.5-10.0的条件下保持12h，依然有80％以上的酶活性，具有很好的ph耐受性。附图说明图1为pnca-pse蛋白纯化前后的sds-page电泳图。图2为吡嗪酰胺水解酶的活性随温度的变化的结果。图3为吡嗪酰胺水解酶的活性随ph的变化的结果。具体实施方式以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、蛋白及基因的制备与功能1、pseudonocardiacarboxydivorans总dna的提取：采用pseudonocardiacarboxydivorans取其新鲜湿菌体20克，悬于10毫升50mmtris缓冲液中(ph8.0)，加入少量溶菌酶和8毫升0.25mmedta(ph8.0)，混匀后37℃放置20min；之后加入2毫升质量分数为10％的sds，55℃放置5min，分别用等体积酚、氯仿各抽提一次；取最后一次的上清溶液，加入2倍体积无水乙醇，回收dna，分别用70％无水乙醇洗2次；沉淀真空干燥，溶于0.5毫升te缓冲液(ph8.0，10mmtris，1mmedta)。2、合成seqidno.2所示的核苷酸序列根据seqidno.2所示的核苷酸序列设计引物对如下：正向引物：5′-cgcggatccatggcacgagcgttgatcgtcgtc-3′，如seqidno.3所示；反向引物：5′-gggttcgaatcaggcggtgcggagctccacgc-3′，如seqidno.4所示；正向引物的下划线部分为bamhi的酶切位点，反向引物的下划线部分为hindш酶切位点。以pseudonocardiacarboxydivorans总dna为模板，用设计的引物对进行pcr扩增。pcr反应体系：10×缓冲液5μldntp4μlextaqdna聚合酶0.5μl正向引物1μl反向引物1μl模板0.5μl水38μlpcr反应条件：95℃预变性5min，然后95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，最后72℃延伸10min。pcr产物用质量分数为0.7％的琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并用dna纯化试剂盒(超薄离心柱型，天根公司生产)纯化。将纯化的pcr产物进行测序，结果表明pcr产物的序列包括seqidno.2所示1-576位，并将其命名为pnca-psedna片段。3、重组表达载体的构建1)将上述测序正确的pcr产物或人工合成的片段用bamhi和hindш双酶切，琼脂糖电泳回收酶切产物。2)将质粒pet28a(cat.n069864-3,novogen)用bamhi和hindш双酶切，琼脂糖电泳回收酶切产物。3)将步骤1)的酶切产物和步骤2)的酶切产物进行连接，连接产物电击转化大肠杆菌dh5α后涂布于含有50μg/ml卡那霉素的lb平板，37℃过夜培养，将得到的转化子用上述的正向引物和反向引物进行菌落pcr，筛选到含有pnca-pse基因的重组菌，提取重组菌的质粒，进行测序验证，结果表明，在pet28a的bamhi和hindш酶切位点之间插入了pnca-pse片段，该片段包括seqidno.2的自5′端起第1至576位的核苷酸，插入方向正确，将该重组质粒命名为(pet28a-pnca-pse)。4、工程菌的制备将质粒pet28a-pnca-pse电击转化大肠杆菌transetta(de3)(cat.n0cd801,全式金公司)后涂布于含有50μg/ml卡那霉素的lb平板，37℃过夜培养，得到含有pet28a-pnca-pse质粒的工程菌，记作transetta/pet28a-pnca-pse。用pet28a代替pet28a-pnca-pse，转化大肠杆菌transetta(de3)，步骤同上，得到含有pet28a的重组菌，作为对照菌。将转入pet28a的阳性重组菌记作transetta/pet28a。5、吡嗪酰胺水解酶的制备和纯化his60nisuperflowresin纯化柱购自takara公司，产品目录号为635660。gehitrapdesalting纯化柱购自gehealthcare公司，产品目录号分别为17-1408-01。将上述步骤4制备的transetta/pet28a-pnca-pse阳性重组菌培养于含有50μg/ml卡那霉素的lb培养基中，37℃培养3h；od600＝0.7时，加入iptg至其在lb培养基中的终浓度0.2mm，转至18℃继续培养16h。在3800rpm、15min条件下离心收集菌体，悬浮于pbs溶液(50mmtris-hcl，ph8.0，0.5mnacl，5mm咪唑)中，于冰浴中超声破碎(60w，10min；超声1s，停止2s)，之后12000rpm离心10min除去细胞碎片，取上清液；将上清液过his60nisuperflowresin纯化柱，用5ml超纯水冲洗，再用10ml溶液a(50mmtris-hcl，ph8.0，0.5mnacl，25mm咪唑)漂洗，最后用5ml溶液b(50mmtris-hcl，ph8.0，0.5mnacl，500mm咪唑)洗脱，收集洗脱液。然后将洗脱液用脱盐柱gehitrapdesalting进行脱盐处理，用溶液c(50mmtris-hcl，ph8.5)进行洗脱，得到pnca-pse纯酶液。将步骤4制备的对照菌采用相同的步骤进行培养和纯化，得到的溶液作为对照酶液。sds-page电泳显示纯化的pnca-pse蛋白的分子量约为23kda，符合理论推断的23kda。结果如图1所示，图1中，泳道m表示蛋白分子量标准(100,75,50,37,25kda)；泳道1表示大肠杆菌transetta/pet28a-pnca-pse破菌后的上清液；泳道2表示ni-nta柱纯化后的pnca-pse蛋白；泳道3表示gedesalting脱盐柱纯化后的pnca-pse蛋白。可以看出已经获得了pnca-pse蛋白。同时进行了对照组的实验，但对照菌并没有得到目的蛋白。实施例2、以吡嗪酰胺为底物验证蛋白功能酶活单位定义为1min内催化产生1μmol吡嗪酸所需的酶量。(一)最适温度用ph8.5的50mmtris-hcl缓冲液稀释实施例1的步骤5中的pnca-pse纯酶液，用稀释后的酶液进行酶活测定。将稀释后的酶液记作稀释酶液。溶液a组成：由50mm，ph8.5的50mmtris-hcl缓冲液和吡嗪酰胺溶液组成；吡嗪酰胺在溶液a中的浓度为100μm。实验组：活性测定反应体系为0.5ml，由0.475ml溶液a和0.025ml稀释酶液；反应体系的ph值为8.5；反应体系在特定温度范围(25-60℃)内温育10min后，加入0.05ml10％三氯乙酸终止反应，过0.22μm的有机滤膜，然后上样20μl于hplc,检测产物吡嗪酸的量。液相条件：c18色谱柱；检测波长：268nm柱温：30℃流速：0.5ml/min流动相：甲醇：水(10:90)结果如图2a所示。图2a表明，吡嗪酰胺水解酶具有酰胺酶活性。在45℃条件下，吡嗪酰胺水解酶具有最高的酶活性；将此温度下的酶活反应体系吡嗪酸产物的峰面积作为相对活性100％，其他温度下酶活反应体系吡嗪酸产物的峰面积与此最高酶活体系吡嗪酸产物的峰面积的比值作为相对活性。在30-50℃条件下均具有50％以上的活性。对照组：以对照菌transetta/pet28a获得的蛋白(记作对照酶液)进行上述实验，结果不管在哪个温度条件下，对照酶液都没有水解吡嗪酰胺的活性。实验设3次重复，结果一致。(二)最适ph如下各组中的稀释酶液均是用各组中的缓冲液稀释实施例1的步骤5中的pnca-pse纯酶液得到的。实验组：活性测定反应体系为0.5ml，分别由0.475ml溶液b(b1、b2、b3、b4、b5、b6、b7、b8或b9)和0.025ml稀释酶液组成；溶液b1的组成：50nah2po4-na2hpo4缓冲液和吡嗪酰胺(pza)；吡嗪酰胺在溶液b1中的浓度为100μm；溶液b1的ph值为5.5。溶液b2的组成：与溶液b1的组成相同，溶液b2的ph值为6.0。溶液b3的组成：与溶液b1的组成相同，溶液b3的ph值为6.5。溶液b4的组成：与溶液b1的组成相同，溶液b4的ph值为7.0。溶液b5的组成：与溶液b1的组成相同，溶液b5的ph值为7.5。溶液b6的组成：与溶液b1的组成相同，不同的是将50mmnah2po4-na2hpo4缓冲液替换为50mmtris-hcl缓冲液。溶液b6的ph值为7.5。溶液b7的组成：与溶液b1的组成相同，不同的是将50mmnah2po4-na2hpo4缓冲液替换为50mmtris-hcl缓冲液。溶液b7的ph值为8.0。溶液b8的组成：与溶液b1的组成相同，不同的是将50mmnah2po4-na2hpo4缓冲液替换为50mmtris-hcl缓冲液。溶液b8的ph值为8.5。溶液b9的组成：与溶液b1的组成相同，不同的是将50mmnah2po4-na2hpo4缓冲液替换为50mmtris-hcl缓冲液。溶液b9的ph值为9.0。溶液b10的组成：与溶液b1的组成相同，不同的是将50mmnah2po4-na2hpo4缓冲液替换为50mmglycine-naoh缓冲液。溶液b10的ph值为9.0。溶液b11的组成：与溶液b1的组成相同，不同的是将50mmnah2po4-na2hpo4缓冲液替换为50mmglycine-naoh缓冲液。与溶液b11的ph值为9.5。溶液b12的组成：与溶液b1的组成相同，不同的是将50mmnah2po4-na2hpo4缓冲液替换为50mmglycine-naoh缓冲液。溶液b12的ph值为10.0。溶液b13的组成：与溶液b1的组成相同，不同的是将50mmnah2po4-na2hpo4缓冲液替换为50mmglycine-naoh缓冲液。溶液b13的ph值为10.5。溶液b13的组成：与溶液b1的组成相同，不同的是将50mmnah2po4-na2hpo4缓冲液替换为50mmglycine-naoh缓冲液。溶液b13的ph值为11.0。将反应体系在45℃，温育10min后，加入0.05ml10％三氯乙酸终止反应，过0.22μm的有机滤膜，然后上样20μl于hplc,在268nm处检测产物吡嗪酸的量。实验设三次重复。结果如图3a所示。吡嗪酰胺水解酶在ph为6.5至10.0之间的条件下均具有不错的吡嗪酰胺水解酶的活性，即可以降解吡嗪酰胺。表明吡嗪酰胺水解酶在ph8.5条件下具有最高酶活性。以此最高酶活反应体系吡嗪酸产物的峰面积作为相对活性100％，其他ph下酶活反应体系吡嗪酸产物的峰面积与此最高酶活体系吡嗪酸产物的峰面积的比值作为相对活性。对照组：以对照菌transetta/pet28a获得的蛋白(记作对照酶液)进行上述实验，结果不管在哪个ph条件下，对照酶液都没有降解吡嗪酰胺的活性。实验设3次重复，结果一致。(三)酶热稳定性用ph8.5的50mmtris-hcl缓冲液稀释实施例1的步骤5中的pnca-pse纯酶液，用稀释后的酶液以吡嗪酰胺为底物进行酶活测定。将稀释后的酶液记作稀释酶液。将稀释酶液在37℃水浴放置孵育，每隔5分钟取样，测定酶的残余活性。结果显示，酶在37℃10min任可以保持50％残余酶活。本发明测定了pnca-pse在37℃的热稳定性。结果如图2b所示。(四)ph耐受性将稀释酶液分别在ph7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5.10.0、10.5、11.0条件下放置12h后，以吡嗪酰胺为底物测定残余酶活。结果显示ph7.5-10.0条件下仍然具有60％以上的相对酶活。说明该酶具有良好的ph耐受性。结果如图3b所示。(五)底物特异性将稀释酶液分别在相同浓度(摩尔浓度为100μm)的不同底物条件下进行酶活测定，底物分别为吡嗪酰胺、烟酰胺、异烟酰胺、丙酰胺、异丁酰胺、苯甲酰胺。以不同酰胺底物测得酶活，仅吡嗪酰胺与烟酰胺测出酶活，其中对烟酰胺的酶活最高，为36.25u/mg，对吡嗪酰胺的酶活为17.20u/mg。因此，该吡嗪酰胺水解酶对吡嗪酰胺、烟酰胺具有很强的底物特异性，并对这两种杂环酰胺类底物具有较高的催化活性。以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。sequencelisting<110>湖北大学<120>一种吡嗪酰胺水解酶与其编码基因和应用<160>4<170>patentinversion3.5<210>1<211>191<212>prt<213>pseudonocardiacarboxydivoranswsc1212<400>1metalaargalaleuilevalvalaspvalglnasnaspphecysglu151015glyglyalaleualavalalaglyglyalaalavalalaalaglyile202530glyproleualathrglyglyargaspglyargvaltyrasphisval354045valalathrargaspvalhisvalaspproglyprohispheserasp505560thrproaspphevalaspsertrpproprohiscysargalaglythr65707580proglyalaserphehisproalaleuaspvalalaproileglucys859095valpheasplysglyalatyrthrseralatyrserglypheglugly100105110alaseralaasngluserglyalaproleuglyasptrpleuthrglu115120125hisglyvalthrgluvalaspvalvalglyleualathrasphiscys130135140valargalathralaleuaspalaalaargleuglyleualathrthr145150155160valleuleuhishiscysalaglyvalalaprogluthrthrgluarg165170175alaleualaalaleuthrglualaglyvalgluleuargthrala180185190<210>2<211>576<212>dna<213>pseudonocardiacarboxydivoranswsc1212<400>2atggcacgagcgttgatcgtcgtcgacgtccagaacgacttctgcgagggcggcgccctc60gcggtggccggcggggccgccgtggccgccgggatcgggccgctcgcgaccggtggccgc120gacgggcgggtctacgaccacgtcgtcgccacccgggacgtgcacgtggacccggggccg180cacttctccgacaccccggacttcgtcgactcctggccgccgcactgccgcgcggggacg240ccgggcgcgtcgttccacccggcactggacgtggcgccgatcgagtgcgtcttcgacaag300ggcgcctacaccagcgcctactccgggttcgagggcgcgagcgcgaacgagtcgggcgcc360ccgctgggcgactggctcaccgagcacggggtgaccgaggtcgacgtcgtcggcctggcg420accgaccactgcgtccgggcgaccgcgctcgacgcggcccggctcgggctggcgacgacg480gtgctgctgcaccactgcgccggggtggcaccggagacgacggagcgggcgctcgccgcg540ctgaccgaggccggcgtggagctccgcaccgcctga576<210>3<211>33<212>dna<213>人工序列<400>3cgcggatccatggcacgagcgttgatcgtcgtc33<210>4<211>32<212>dna<213>人工序列<400>4gggttcgaatcaggcggtgcggagctccacgc32当前第1页12