一种内生真菌菌株nyn8c05及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物及微生物应用领域，尤其涉及一种内生真菌菌株NYN8C05,其在 降低烟草吸收重金属方面的用途。
【背景技术】
[0002] 我国是全球最大的烟草生产国和消费国，吸烟人口超过3. 2亿人。烟叶中的重金 属主要来自于土壤，烟草生长过程中，根系不断地从土壤中吸收重金属，传输至茎和叶片 中，并逐渐累积（杨欣等，2010)。在抽吸过程中，烟叶中的重金属元素以气溶胶的形式进 入呼吸道，被人体吸收，而重金属从人体内排出非常缓慢，因此会在人体内造成累积，，每年 有上百万人死于相关疾病（Ronco et al.，2005)。近年来，由于大量的工业重金属废弃物 排入土壤和水生生态环境，重金属污染问题日趋突出，2010年国际烟草控制政策评估项目 (ITC)组织公布的科研报告显示，13个中国国产卷烟品牌检测出含有Pb、Cd、Cr等重金属， 其含量与加拿大产香烟相比，最高超出3倍以上。吸烟与健康成为国内外广泛关注的热点 问题，降低烟草制品有害成分是烟草行业科技发展的焦点。烟叶和烟气中的重金属是最重 要的有害成分之一，另外烟草病害也严重影响烟草产量和烤烟品质。而烟草农业对烟叶有 害成分和烟叶品质具有重要影响，利用农业生物技术进行调控，尽量减少烟叶有害成分的 本底含量，以达到降低烟草制品对人类健康危害的目的。
[0003] 烟草中含有多种重金属元素，如砷、镉、铅、汞等，在抽吸过程中，这些重金属可通 过主流烟气进入人体，对人体造成潜在的危害。烟草是对镉转移能力极强的作物，烟草中镉 含量比其生长的土壤高出许多倍，镉在成熟烟株的不同叶位含量几乎相当，而在根中最低， 烟叶中镉的积累量占总吸收量的79-96%。
[0004] 内生真菌（endophytic fungi)即至少生活史的一部分能侵染定殖在健康植 物组织中，宿主无明显病症的一类真菌（Petrini，1991 ;Wilson，1995)，与菌根真菌只 存在于植物根系不同，内生真菌在植株的地下和地上部分的任何组织器官都能存在 (Faeth&Fagan，2002)。内生真菌广泛存在于植物组织内，不受外界环境的影响，对植物生长 发育、抵抗病虫害等具有广泛的生物学作用，同时在一些植物及农作物的广泛应用具有重 要意义。随着环境问题的持续恶化，植物资源经受着严峻的考验，而内生真菌对植物的影响 是多方面的，已经成为当今国内外研究的热点问题之一。在农业生产、生态保护、中药资源 开发、医药卫生的发展都有重要的现实意义。近年来，人们发现在植物体存在有益的内生细 菌和内生真菌，内源性菌株对植物病害的防治作用及生物开发应用已引起科学家的广泛关 注。植物内生真菌主要分布于植物的种子、花、茎、叶和根系中，与植物的关系是互惠共生 的，而且植物内生真菌可以提供光合产物及矿物质，内生真菌代谢产物能够刺激寄主植物 的生长发育，提高寄主植物的生物应激和非生物胁迫抗性能力，即两者之间存在物质与能 量的循环交流，植物内生真菌对寄主植物的积极地促生效应，部分是通过植物内生真菌分 泌的活性物质或者次级代谢产物对植物的生长作用的结果。目前研究较多的是根瘤共生 体和菌根共生体，内生真菌与植物的共生体是高等植物与微生物共生关系的又一种表现形 式。
[0005] 内生真菌与植物的互作研究已日益受到研究者的关注，并成为内生真菌研究领域 的国际热点。烟草作为我国重要的经济作物，在国民经济中占据着不可替代的地位，烟草产 量和品质的提高，是烟草产业健康发展的基础。通过研究内生真菌与烟草的互作关系，对研 究内生真菌与烟草的共生体系具有重大意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种内生真菌菌株（Rhizopycnis sp. )NYN8C05及其用途。
[0007] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种内生真菌菌株（Rhizopycnis sp.) NYN8C05,保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号： CCTCC N0:M2015219,保藏时间 2015 年 4 月 10 日。
[0008] 内生真菌菌株（Rhizopycnis sp. )NYN8C05的特征为：菌落生长较慢，呈灰黑色， 表生绒毛状灰色菌丝。菌落背面灰色至灰黑色，间淡色轮纹，明显轮纹状。菌丝暗色有隔且 多分支，厚垣孢子形态球形、表面不光滑，多个厚垣孢子串联成链状。ITS rDNA区的序列分 析鉴定为Rhizopycnis sp.，ITS序列见序列2。
[0009] 菌株（Rhizopycnis sp. )NYN8C05来源于烟草的内生真菌，该菌株属于真菌界 Fungi，子囊菌门 Ascomycota，盘菌亚 Pezizomycotina，座囊菌纲 Dothideomycet，格孢腔菌 目 Pleosporales ;根盘菌属 Rhizopycnis。
[0010] 本发明还提供上述内生真菌菌株（Rhizopycnis sp. )NYN8C05的用途：降低烟叶 中锦、砷、铅的含量。
[0011] 上述的内生真菌菌株（Rhizopycnis sp. )NYN8C05的用途：降低烟叶中锦、砷或铅 的含量。
[0012] -种内生真菌菌肥制剂，该内生真菌菌肥制剂包括所述的内生真菌菌株NYN8C05。
[0013] -种上述的内生真菌菌肥制剂的制备方法，该方法包括以下的步骤：
[0014] 1)菌株活化、一级种子培养、二级种子培养
[0015] 菌株活化：用灭菌的牙签挑取PDA斜面保存管中的少许菌丝，接种于PDA培养基 上，封口后置于恒温培养箱中，24h黑暗，25°C，活化培养；
[0016] -级种子液培养：将10块直径5mm的菌饼，接种于在200ml液体种子培养基中，于 150以11^11，25°(：培养7211;
[0017] 二级种子液培养：200ml -级种子液用搅拌器打碎并摇晃混勾，吸取20ml接种于 200ml液体种子培养基，于150r/min，25°C培养72h ;
[0018] 2)固态培养：
[0019] 200ml二级种子培养液打碎并摇晃混勾，吸取2ml接种于10g固态培养基质中，于 25°C条件下黑暗培养7d ;
[0020] 3)内生真菌菌肥制剂的制备
[0021] 称取200g麸皮，添加100ml水，拌匀后置于1000ml锥形瓶内，8层纱布4层报纸封 口后，121°C，0. 15Mpa 灭菌 30min，冷却备用；
[0022] 每个灭菌待的麸皮培养基，接种二级培养液40ml，置于恒温培养箱中，24h黑暗， 25°C，培养。
【附图说明】
[0023] 图1为Rhizopycnis sp. NYN8G01在PDA培养基上的菌落形态。
[0024] 图2为Rhizopycnis sp. NYN8G01在显微镜下的形态观察，可见菌丝上着生单瓶梗 和分生孢子（左）以及镰刀状分生孢子（右）。
[0025] 图3为Rhizopycnis sp. NYN8C05在PDA培养基上的菌落形态。
[0026] 图4为Rhizopycnis sp. NYN8C05在显微镜下的形态观察，可见菌丝上着生单瓶梗 和分生孢子（左）以及镰刀状分生孢子（右）。
[0027] 图5为Lecanicillium sp. NYN771C06在PDA培养基上的菌落形态。
[0028] 图6为Lecanicillium sp. NYN771C06在显微镜下的形态观察，可见菌丝上着生单 瓶梗和分生孢子（左）以及镰刀状分生孢子（右）。
【具体实施方式】
[0029] 参照上述附图，对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。
[0030] 备注说明：下述所有的培养基使用前均需要按照常规方式进行高温高压的灭菌处 理（121°C、0· 24MPa、20 分钟）。
[0031] 实施例1、内生真菌菌株分离获得
[0032] 2%麦芽汁琼脂培养基（malt extract agar，MEA):在麦芽浸出粉20g、琼脂20g中 加蒸馏水定容至l〇〇〇mL ;然后进行常规的高温灭菌（1. 1个大气压，121°C下灭菌20min)。
[0033] 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar, PDA):在马铃薯200g、葡萄糖 20g、琼脂20g中加蒸馏水定容至1000mL ;然后进行常规的高温灭菌（1. 1个大气压，121°C 下灭菌20min)。
[0034] 以河南南阳烟区采集烟草为植物材料，将采集的烟草用自来水漂洗干净，烟草根 茎在75% (v/v)酒精溶液中消毒30秒，然后在1% (v/v)次氯酸钠溶液中消毒10分种，无 菌水漂洗3次。用无菌刀片将根切成约0. 6cm长的片段，置于含50 μ g · ml-1氨苄青霉素 和50 μ g ·πι1-1链霉素的2%麦芽汁琼脂培养基（MEA)平皿上，25°C暗培养，待菌丝长出后， 将菌丝顶端移接到PDA培养基；分离得到菌落，25 °C暗培养，在PDA培养基上连续三次接种， 确认为单菌落，没有其他真菌或者细菌共同生长，认为是获得纯培养，获得的三株内生真菌 分别为 NYN8G01、NYN8C05 和 NYN771C06。
[0035] 菌株编号为Rhizopycnis s