p. NYN8G01,保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保 藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCC Ν0:Μ 2015218,保藏时间2015年4月10日。
[0036] 菌株编号为（Rhizopycnis sp. )NYN8C05,保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保 藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCC Ν0:Μ 2015219,保藏时间2015年4月10日。
[0037] 菌株编号为Lecanicillium sp. NYN771C06,保藏单位：中国典型培养物保藏中心， 保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCC Ν0:Μ 2015220,保藏时间2015年4月10 曰。
[0038] 实施例2、内生真菌菌株的形态鉴定
[0039] 本发明的 Rhizopycnis sp.NYN8G01 (即 Rhizopycnis sp.NYN8G01CCTCC Ν0:Μ 2015218)具有如下特性：Rhizopycnis sp. NYN8G01在PDA培养基上的形态如图1所示。 该内生真菌在PDA培养基上的适宜生长温度为25°C，具有以下特征：该菌株属于真菌界 Fungi，子囊菌门 Ascomycota，盘菌亚门 Pezizomycotina，座囊菌纲 Dothideomycetes，格抱 腔菌目Pleosporales;根盘菌属Rhizopycnis。菌落灰色，表面灰白色菌丝呈绒毛状，菌落 背面中央灰色、放射状开裂，外圈变黑色，边缘灰色，呈明显的轮纹状，见附图1。菌丝暗色 有隔且多分支，厚垣孢子形态球形、表面不光滑，多个厚垣孢子串联成链状，见附图2。ITS rDNA区的序列分析鉴定为Rhizopycnis sp.，ITS序列见序列1。
[0040] 本发明的（Rhizopycnis sp. )NYN8C05(即（Rhizopycnis sp. )NYN8C05CCTCC N0:M2015219)具有如下特性：（Rhizopycnis sp. )NYN8C05在PDA培养基上的形态如图3所 示。该内生真菌在PDA培养基上的适宜生长温度为25°C，具有以下特征：该菌株属于真菌 界Fungi，子囊菌门 Ascomycota，盘菌亚门 Pezizomycotina，座囊菌纲 Dothideomycetes，格 孢腔菌目Pleosporales;根盘菌属Rhizopycnis。菌落生长较慢，呈灰黑色，表生绒毛状灰 色菌丝。菌落背面灰色至灰黑色，间淡色轮纹，明显轮纹状。菌丝暗色有隔且多分支，厚垣 孢子形态球形、表面不光滑，多个厚垣孢子串联成链状，见附图4。ITS rDNA区的序列分析 鉴定为Rhizopycnis sp.，ITS序列见序列2。
[0041] 本发明的 Lecanicillium sp. NYN771C06(即 Lecanicillium sp. NYN771C06CCTCC N0:M2015220)具有如下特性：Lecanicillium sp. NYN771C06在PDA培养基上的形态如图5 所示。该内生真菌在PDA培养基上的适宜生长温度为25°C，具有以下特征：真菌界Fungi， 子囊菌门Ascomycota，盘菌亚门Pezizomycotina，奠壳菌纲Sordariomycetes，肉座菌目 Hypocreales，虫草菌科Cordycipitaceae，錯蚁轮枝菌属Lecanicillium。落菌初白色，后 变淡黄色，正面绒毛状，背面淡黄色，见附图5。气生菌丝分枝丝状，分生孢子梗呈锥形瓶状， 在气生菌丝上单生。分生孢子在瓶梗未端粘结成头状，分生孢子多为卵圆形、椭圆形至桔瓣 形，两端圆或一端稍尖，单孢、无色，缺少厚坦抱子，见附图6。ITS rDNA区的序列分析鉴定 为 Lecanicillium sp.，ITS 序列见序列 3〇
[0042] 实施例3、内生真菌菌株的分子鉴定
[0043] 用真菌基因的快速提取法提取DNA。采用ITS扩增的通用引物 ITS-4( '-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）和 ITS1(5' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）进行 PCR 扩增，？0?扩增反应采用5〇111的反应体系：(1(1!12039.5111、10扑0?81^€61^行11]\%2+)5111、 10mmol/L dNTP 0· 4ul、20 μ mol/L Primer-F 0· 8ul、20 μ mol/L Primer-R 0· 5ul、DNA 模板 3ul、5U/ul Taq聚合酶0. 8ul。PCR体系为：PCR反应条件为：94°C预变性4min，94°C变性 3〇8,59°(：退火4〇8,72°(：延伸6〇8,35个循环后，72°(：延伸1〇1^11。反应结束后用1.0%琼脂 糖凝胶分析扩增产物。PCR产物回收后经上海生工生物工程有限公司测序，分别得到三条 ITS序列（序列1、序列2和序列3)。测序结果在GenBank数据库中进行同源序列搜索以 进一步确定其分类地位，序列1的ITS rDNA区的序列分析鉴定为Rhizopycnis sp.;序列2 的ITS rDNA区的序列分析鉴定为Rhizopycnis sp.;序列3的ITS rDNA区的序列分析鉴 定为 Lecanicillium sp. 〇
[0044] 实施例4、内生真菌菌株在降低烟草烟叶重金属含量的作用
[0045] ⑴烟草育苗
[0046] 取适量云烟87烟草种子，75%酒精浸泡3〇8，1%似(：10浸泡1〇1^11;温水浸泡置于 28°C培养箱中12h ;取出纱布包裹并轻轻揉搓边清水冲洗，以去掉种皮的角质与胶质；室温 催芽至种子冒白；撒播于育苗穴盘；出苗长至十字期，移栽值50目穴盘，培育待用。
[0047] (2)菌株活化、一级种子培养、二级种子培养
[0048] 菌株活化：用灭菌的牙签挑取PDA斜面保存管中的少许菌丝，接种于PDA培养基 上，封口后置于恒温培养箱中（24h黑暗，25°C)活化培养。本发明中涉及的菌株有3种，分 别为：
[0049] NYN8G01，即Rhizopycnis sp.NYN8G01，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保 藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCC Ν0:Μ 2015218,保藏时间2015年4月10日；
[0050] NYN8C05,即（Rhizopycnis sp. )NYN8C05,保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保 藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCC Ν0:Μ 2015219,保藏时间2015年4月10日；
[0051] NYN771C06,即Lecanicillium sp. NYN771C06,保藏单位：中国典型培养物保藏中 心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCC Ν0:Μ 2015220,保藏时间2015年4月 10日。
[0052] -级种子液培养：将10块直径5mm的菌饼，接种于在200ml液体种子培养基中，于 150以11^11，25°(：培养7211。
[0053] 二级种子液培养：200ml -级种子液用搅拌器打碎并摇晃混勾，吸取20ml接种于 200ml液体种子培养基，于150r/min，25°C培养72h。
[0054] 固态培养：200ml二级种子培养液打碎并摇晃混勾，吸取2ml接种于10g固态培养 基质中，于25°C条件下黑暗培养7d。
[0055] (3)内生真菌菌肥制剂的制备
[0056] 称取200g麸皮，添加100ml水，拌勾后置于1000ml锥形瓶内，8层纱布4层报纸封 口后，121°C，0. 15Mpa 灭菌 30min。冷却备用。
[0057] 每个灭菌待的麸皮培养基，接种二级培养液40ml，置于恒温培养箱中（24h黑暗， 25°C )培养。
[0058] (4)菌肥制剂施用
[0059] 花盆按"三明治法"（刘宏玉，2013)填入100g 土壤和菌剂（10g左右），花盆放入 盛满水的托盘中吸水，水分吸透后，将50目穴盘云烟87幼苗移栽至花盆中，温室中（25°C、 16h光照80 ymm-2sec-l与22°C、8h黑暗交替）培养。
[0060] (5)烟草盆栽的镉Cd2+、砷As3+、铅Pb 2+胁迫处理
[0061] 烟苗移入盆栽，在植物生长室中培育60天后，便可对盆栽进行重金属镉胁迫处 理。
[0062] 处理方式：镉Cd2+、砷As3+、铅Pb2+混合处理
[0063] 处理浓度（mg/kg):锦 Cd2+:5mg/kg ;砷 As 3+:4mg/kg ;铅 Pb 2+:200mg/kg
[0064] (6)样品采集及处理
[0065] 烟叶：重金属胁迫处理后30d，选择生长状况类似、个体差异较小的实验组，进行 全株取样（去除下部黄化衰老严重的叶片）。采集的样品置于烘箱中，设置l〇5°C，lh，而后， 65 °C烘干至恒重，待用。
[0066] 根系：在水中去除花盆中的营养土保留根系，将根系在-80°C下冻干，备用。
[0067] (7)烟草叶片中重金属含量的测定
[0068] 采用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS)测定烟叶中重金属的含量。
[0069] 所涉及溶液：10ng/mL Mg，Cu，Rh，Cd，In，Ba，Ce，Pb，U 调谐溶液、lOn