一种产高活力酸性蛋白酶的宇佐美曲霉及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物发酵技术领域，具体是一种产高活力酸性蛋白酶的宇佐美曲霉及其应用。
【背景技术】
[0002]酸性蛋白酶是一类最适pH值为2.5-5.0的天冬氨酸蛋白酶，相对分子质量为30000—40000。酸性蛋白酶主要来源于动物的脏器和微生物分泌物，包括胃蛋白酶、凝乳酶和一些微生物蛋白酶。根据其产生菌的不同，微生物蛋白酶可分为霉菌酸性蛋白酶、酵母菌酸性蛋白酶和担子菌酸性蛋白酶。根据作用方式可分为两类:一类是与胃蛋白酶相似，主要产酶微生物是曲霉、青霉和根霉等；另一类是与凝乳酶相似，主要产酶微生物是毛霉等。由于酸性蛋白酶具有较好的耐酸性，因此被广泛地应用于食品、医药、轻工、皮革工艺以及饲料加工工业中。国外关于酸性蛋白酶的研究和生产从20世纪初就开始了。乞今为止，已发现不少微生物可以产生酸性蛋白酶，如黑曲霉(Aspergillus niger)、大孢子黑曲霉突变株(A.niger var.microsporus)、根霉(Rhizopus sp.)、微小毛霉(M.pusillus)、粘红酵母(Rhdotorula glutinis)、粟疫霉(Endothia parasitica)、血红色陀螺孔菌(Trametessanguinca)、芽枝霉(Cladosporium sp.)等。1903年,德国科学家从动物的胰脏中提取出胰蛋白酶，并将其用于皮革的柔制。1911年美国科学家从木瓜中提取木瓜蛋白酶，并将木瓜蛋白酶用于除去啤酒中的蛋白浑浊物。自1954年吉田首次发现黑曲霉可产生酸性蛋白酶以来，国内外开始对微生物发酵生产酸性蛋白酶进行了广泛的研究。1964年国外科学家发现大孢子黑曲霉突变体能产生两种不同的酸性蛋白酶。1965年又从血红色陀螺孔菌产酸性蛋白酶，并对该酶进行了纯化和结晶。1968年从微小毛霉发酵物中筛选出一种酸性蛋白酶，并对其进行了纯化和酶学性质分析。1995年国外科学家对烟曲霉酸性蛋白酶的基因进行了克隆和测序。2001年又从假丝酵母中筛选出一种酸性蛋白酶菌株，并对该酶进行了核苷酸序列分析和功能分析。到目前为止，国外科学家对酸性蛋白酶的结构和功能等已经进行了广泛系统的研究。
[0003]微生物产酸性蛋白酶我国从上世纪60年代就开始研制，1970年上海工业微生物研究所首先从黑曲霉筛选一株3.350产酸性蛋白酶菌株，填补了我国酸性蛋白酶制剂的空白。但3.350酸性蛋白酶菌种发酵活力较低，生产工艺较繁杂。1977年中国科学院微生物研究所和新疆生物土壤沙漠研究所共同研制的由宇佐美曲霉经诱变、筛选的537高产酸性蛋白酶菌种。近年来国内在酸性蛋白酶方面的研究大多致力于选育产酶活力高、抗逆性好的菌种。目前用于酸性蛋白酶生产的菌种主要是黑曲霉、宇佐美曲霉和青霉以及它们突变株。钱玉英等(1994年)用60Co γ射线诱变处理黑曲霉CPu菌株，获得突变菌株6042，产酶活力比出发菌株提高近4倍。章剑林等(1995年)以黑曲霉为出发菌株，采用高温、超剂量常规诱变方法，获得了产耐高温酸性白酶的菌株S3-15，其所产酸性蛋白酶最适pH值为
2.5，最适温度为50°C，90°C下恒温4h的酶活比出发菌株高64.2%。黄遵锡等(1999年)以黑曲霉YM3019为出发菌株，经紫外线和亚硝基胍诱变处理，获得高产酶菌株A-1-1，产酶活力约是原始出发菌株的4倍。李永泉等(1999年)，对宇佐美曲霉所产的酸性蛋白酶进行了发酵过程动力学研究。戚淑威等(2006年)对青霉产酸性蛋白酶的适宜条件和酶学性质进行了分析。谢必峰等(2007)采用硫酸铵盐析法和离子交换层析法分离纯化了黑曲霉产酸性蛋白酶，并对其氨基酸组分进行了分析。王云(2008年)通过质谱指纹法对黑曲霉发酵液中所产蛋白进行了分析比对和鉴定酸性蛋白酶分子生物学方面的研究。
[0004]国内生产酸性蛋白酶的厂家，基本上都是用537酸性蛋白酶菌种生产。早期生产的微生物酸性蛋白酶，只是工业级的，主要用于皮毛软化。微生物菌种通过液体通风发酵，成熟发酵醪再经硫酸铵盐析、板框压滤、气流(沸腾)干燥、粉碎、化验、包装制成工业级酸性蛋白酶。随着现代超滤膜浓缩技术在酶制剂行业上的应用，近几年生产了食品级酸性蛋白酶制剂。食品酸性蛋白酶发酵与工业级相同，只是后提取不同，成熟发酵醪进入絮凝罐，加入絮凝剂絮凝沉淀再经板框压滤机压滤，滤清液经超滤膜浓缩器浓缩经化验合格，加入防腐剂、稳定剂就是成品的浓缩酸性蛋白酶制剂。
[0005]中国专利CN 102676395A公开了一株宇佐美曲霉突变菌株及其在制备酸性蛋白酶中的应用，所述宇佐美曲霉突变菌株(Aspergillus sp.)M1223采用液体深层发酵，发酵液粗酶以酪蛋白为作用底物，该酶最适作用温度为40°C，最适作用pH为3.0，最适作用条件下，酶活性达到5600U/ml。该酶分子量在45KD左右。中国专利CN 101948820A公开了一种酸性蛋白酶及其制备方法，以黑曲霉(Aspergillus niger)保藏于CICC编号2238为产酶菌种，采用固体发酵工艺制备，发酵产酶能力> 47000u/g(以干曲计)，液体酶收率> 85%,固体酶收率彡80%，最适ρΗ2.5-3.5，稳定ρΗ2.5-6.0 ;最适作用温度为40_50°C，温度稳定性范围为30°C?50°C。
[0006]综上所述，无论酸性蛋白酶的制备方法如何，酶活及其作用条件仍是本行业技术人员最为关注的问题之一，进一步优化选育产高活力酸性蛋白酶的菌株对酸性蛋白酶的工业化生产具有十分重要的意义。
【发明内容】
[0007]本发明的首要目的是提供一种产高活力酸性蛋白酶的宇佐美曲霉(Aspergillususamil)801-2。
[0008]本发明提供的宇佐美曲霉801-2是由实验室保藏的一株产酸性蛋白酶的宇佐美曲霉801依次经紫外线复合氯化锂诱变、亚硝基胍诱变、硫酸二乙酯诱变，并对突变株分离、筛选，最后对优良菌株经发酵性能测试筛选得到产高活力酸性蛋白酶的宇佐美曲霉801-2。
[0009]本发明提供的产高活力酸性蛋白酶的菌株具体为宇佐美曲霉(Aspergillususamil)801-2。该菌株已于2013年11月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为:中国.武汉.武汉大学邮编:430072)，保藏号为CCTCC NO:M 2013601，分类命名为宇佐美曲霉 801-2 Aspergillus usamil 801-2。
[0010]本发明宇佐美曲霉(Aspergillususamil) 801-2 (CCTCC NO:M 2013601)具有以下微生物学特征:
[0011]1、形态学特征:
[0012]宇佐美曲霉(Aspergillus usamil) 801-2,生物学形态为包括分生孢子、胞梗、顶囊、产胞结构等几部分。分生孢子头球形至辐射形，直径150-450 μ m，分生孢子梗发生于基质。胞梗茎1000-3000 (长度)X 12-20 (直径)μ m，黄色或黄褐色，壁平滑；顶囊球形或近似球形，直径35-50 μ m,表面全面可育；产胞结构双层，梗基15-20 (长度)X 3-4.0 (直径)μ m，瓶梗6-8 (长度)X 2-4 (直径)μ m,分生孢子球形或近球形，较小，直径3.5-5.0 μ m，褐色，壁粗糙。
[0013]2、培养学特征:
[0014]宇佐美曲霉(Aspergillus usamil)801-2菌株在麦芽汁琼脂培养基上生长迅速，32°C 4天菌落直径82_ ;质地丝绒状或稍带絮状；分生孢子结构大量，褐黑色，有少量渗出液；菌落反面略带黄色。
[0015]3、生理生化特征:
[0016]宇佐美曲霉(Aspergillus usamil)801-2可在马铃薯、玉米粉、可溶性淀粉，糖蜜等上生长，最适PH值5-6，最适生长温度31-32°C，最适产酶温度23_25°C。
[0017]本发明菌株宇佐美曲霉(Aspergillus usamil)801-2的筛选技术路线为:出发菌株一斜面培养一孢子悬液的制备一诱变处理一平板分离一初筛一复筛一再复筛一扩大实验(发酵性能测定)。
[0018]按诱变筛选方案，对突变株