专利名称：一种β-1,4-内切葡聚糖酶基因的克隆及重组酶的制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001菌株的一种糖苷水解酶 12家族的β-1，4-内切葡聚糖酶基因完整mRNA和DNA序列的克隆，β-1，4-内切葡聚糖酶 工程菌的构建以及重组β_1，4-内切葡聚糖酶的高效表达和纯化的方法，属于生物工程技 术领域。
背景技术：
纤维素是植物细胞壁最主要的结构成分，连同半纤维素占据了地球上可再生有 机碳源的一半以上。纤维素酶是指能水解纤维素β _1，4葡萄糖苷键生成纤维二糖和葡 萄糖的一组酶的总称，主要包括内切葡聚糖(end0-l，4-i3-gluCanase，EC 3. 2. 1. 4，简称 EG)、外切葡聚糖酶(exo-l,4-^-glucanase, EC 3. 2. 1. 91，简称CBH)和β -葡萄糖苷酶 (β -glucosidase,EC 3. 2. 1. 21，简称BG) 3大类，在该3种酶的协同作用下可以把纤维素水 解成葡萄糖。目前纤维素酶已被广泛的应用于食品、饲料、纺织、造纸、生物燃料和发酵等工 业领域。纤维素酶的种类繁多，在糖苷水解酶(Glycoside Hydrolases,GH)第3、5、7、8、9、 12等家族中都有分布，其中多数属于糖苷水解酶第5家族(GH5)和12家族(GH12)；纤维素 酶的来源也很广，大多数纤维素酶主要来自微生物，自20世纪60年代以来，据不完全统计， 国内外共记录了产纤维素酶的菌株大约已有53个属的几千个菌株，主要包括细菌、真菌和 放线菌。真菌是工业用纤维素酶的重要来源，主要有里氏木霉(Trichoderma reesei)、绿 色木霄(Trichoderma viride)、康宁木霄(Trichoderma koningii)、黑( (Aspergillus niger)、斜臣卜青霉(Penicillium decumbens)、嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophile)禾口嗜 热子囊菌(Thermoascusaurantiacus)等，目前研究最多且最清楚的是里氏木霉T. reesei。 但有关来源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)GH12的β-内切葡聚糖酶基因(Aus cell2A)的克隆和表达等的研究未见有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种宇佐美曲霉EOOl菌株新型β-1，4_内切葡聚糖酶基因 完整mRNA和DNA序列克隆，β -内切葡聚糖酶工程菌的构建以及重组β -内切葡聚糖酶的 高效表达和纯化的方法。生物信息学分析表明，来源于宇佐美曲霉EOOl菌株的一种新型 β -内切葡聚糖酶属于糖苷水解酶第12家族，命名为Aus Cel 12Α，其相应的基因命名为Aus cell2A。Aus Cell2A具有较高的催化活性和热稳定性，有较大的工业化生产和应用潜力及 经济价值。本发明的技术方案一种源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001菌株新型 Aus Cel 12A基因完整mRNA和DNA的核苷酸序列分别为SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2。获 取完整mRNA和DNA序列的流程如图1所示。A. usamii E001菌株由江南大学筛选和保藏，已于2005年在《食品与发酵工业》杂志的Vol. 31，No. 4，Pg. 50公开，本发明人承诺该菌株在20年内向公众发放。所述的由完整mRNA序列推导的Aus Cell2A氨基酸序列为SEQ ID NO :3。所述的重组Aus Cell2A的活性测定方法于25mL具塞试管A和B中，各加入用pH 5. 0、柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液配制的 质量浓度为0.5%的β-葡聚糖(Sigma，USA)溶液2. 4mL，50°C预热lOmin，在A管中加入 0. ImL适当稀释的酶液，50°C准确反应20min ；立即各加入2. 5mL 3'，5' - 二硝基水杨酸 (DNS)试剂，在B管中再补加0. ImL酶液，A和B管均煮沸7min ；冷却后各加去离子水5mL， 摇勻；540nm处以B管为空白对照测定A管吸光度值，并从葡萄糖标准曲线上查出相应的还 原糖(以葡萄糖计)含量并折算成酶活性单位。酶活性单位定义在本测定条件下，以每分 钟产生1 μ mol还原糖所需的酶量定义为1个β -1,4-葡聚糖酶活性单位(U)。所述的Aus cell2A完整mRNA和DNA序列的克隆和表达方法(I)Aus cell2A 3'端mRNA序列的克隆首先对Aspergillus kawachii (GenBank D12901)、Aspergillus niger(GenBank AJ224451)禾口 Aspergillus terreus (GenBank XM_001214697)GH12的β -内切葡聚糖酶序列进行同源比对，找出两段约10个氨基酸的保 守序列；再对该两段氨基酸序列的mRNA进行同源比对，设计两条正向简并引物Cell2A-3Fl 和 Cell2A-3F2。Cell2A-3Fl 5' -TA(T/C)GACAG(T/C)GC(G/C)TCGAGCCC-3‘Cell2A-3F2 5‘ -GTGAA(A/G)AGCTACTC(T/G)AACTC-3‘提取A.usamii EOOl 的总 RNA，按照 TaKaRa RNA PCR Kit (Ver. 3. 0)说明书进行 RT-PCR扩增。将两轮PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与 pUCm-T载体连接(pUCm-T-ce112A3')，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序，得 至Ij Aus cell2A3'端 mRNA 序列。(2)Aus cell2A 5'端mRNA序列的克隆基于上述得到的Aus cell2A 3'端mRNA 序列，设计两条反向引物Cell2A-5Rl和Cell2A_5R2。Cell2A-5Rl 5' TTGTCCTGCTTCCATTCCAC-3‘Cell2A-5R2 5' ACATCACTCACGAGCTTCTT-3‘按照TaKaRa 5' -Full RACE Kit说明书进行5' -RACE。将两轮PCR产物用1 %琼 脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与PUCm-T连接(pUCm-T-Cell2A5')，转化JM109， 经酶切鉴定正确后送上海生工测序，得到Aus cell2A 5'端mRNA序列。(3)Aus cell2A 5'端启动子序列的克隆采用先前我们发明的一种T载体介导 的PCR方法，以经处理的A. usamii EOOl基因组DNA为模板，第一轮PCR以T-PrimerF和 Cell2A-5Rl为引物，第二轮PCR以T-PrimerF ^P Cell2A_5R2为引物。将两轮PCR产物用 1 %琼脂糖凝胶电泳分析，回收目的条带并与PUCm-T连接(pUCm-T-Cell2AP)，转化JM109， 经酶切鉴定正确后送上海生工测序，得到Aus cell2A 5'端启动子序列。(4)Aus cell2A 3'端转录终止区的克隆基于上述得到的Aus cell2A 3'端 mRNA序列，设计两条正向引物Cell2A-3F3和Cell2A_3F4。Cell2A-3F3 5' -GTGTCAGAAAGCCCTATCAA-3‘Ge112A-3F4 5‘ -CAGCTATCTCACTCAGAACC-3‘采用先前我们发明的一种T载体介导的PCR方法，以经处理的A. usamii EOOl基因
5组DNA为模板，第一轮PCR以Cell2A-3F3和T-PrimerR为引物，第二轮PCR以Cell2A_3F4 和T-PrimerR为引物。将两轮PCR产物用1 %琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与 pUCm-Τ连接(pUCm-T-ce112A3T)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序，得到Aus cell2A 3'端转录终止区序列。(5) Aus eel 12A的生物信息学分析将Aus eel 12A的5 ‘和3 ‘端mRNA序列进行 拼接，得到自转录起始位点至Poly(A)完整的mRNA序列；在NCBI上对开放阅读框架(Open ReadingFrame)进行分析，进而推导出Aus Cell2A的氨基酸序列；进行信号肽预测。将Aus cell2A的编码区DNA序列与其两侧序列进行拼接，获得完整DNA序列，并对其5'端启动子 区域和3'端转录终止区的功能进行预测。(6) Aus cell2A内含子序列的测定基于上述得到的Aus eel 12A完整mRNA序列， 设计一对引物 Cell2A-Fl 和 Cell2A_R。Cell2A-Fl 5' GAATTCATGAAGCTCCCTGTGACAC-3 ’，含 EcoR I 酶切位点Cell2A-R 5' GCGGCCGCCTAGTTGACACTGGCGGTC-3 ’，含 Not I 酶切位点以 A. usamii EOOl 基因组 DNA 为模板，Cell2A_Fl 和 Cell2A_R 为引物进行 PCR，将 其产物用琼脂糖凝胶电泳分析，回收目的条带并与PUCm-T连接(pUCm-T-Cell2A-DNA)， 转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序，得到Aus eel 12A的编码区DNA序列。将编 码区DNA序列与mRNA序列用DNAMAN 6. O进行序列比对，得出Aus cell2A的2个内含子序 列。(7)含编码Aus Cell2A成熟肽基因的表达质粒的构建基于上述得到的Aus cell2A完整mRNA序列以及预测的信号肽序列，设计一条正向引物Cel 12A-F。Cell2A-F 5' -GAATTCCAGACGATGTGCTCTCAAT-3 ‘，含 EcoR I 酶切位点按照TaKaRa RNA PCR Kit(Ver. 3. 0)使用说明书进行 RT-PCR。以 Oligo dT-Adaptor I^rimer为引物进行反转录合成cDNA的第一条链；以M13 Primer M4和 Cell2A-F为引物进行第一轮PCR;以Cell2A_F和Cell2A_R为引物进行第二轮PCR。 将两轮PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pUCm-Τ连接 (pUCm-T-ce112A)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序。将测序结果正确的pUCm-T-cel 12A与pPIC9K质粒均用EcoR I和Not I进 行双酶切，割胶回收的酶切产物在T4 DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒 pPIC9K-cell2A(图2)，并对重组质粒进行序列测定。(8)GS115/cell2A的构建、表达、产物纯化及活性测定用Ml I对pPIC9K_cell2A 进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/ cell2A ；按照手册上的标准流程进行诱导表达，用DNS法测定β -1,4-内切葡聚糖酶活性； 发酵液经冷冻离心、超滤、离子交换层析和凝胶过滤层析，得到电泳纯的重组β_1，4-内切 葡聚糖酶。本发明的有益效果本发明提供了一种宇佐美曲霉EOOl菌株新型β-1，4-内切葡 聚糖酶基因完整mRNA和DNA序列克隆，β -内切葡聚糖酶工程菌的构建以及重组β _内切 葡聚糖酶的高效表达和纯化的方法，并对序列进行生物信息学分析。生物信息学分析表明 来源于宇佐美曲霉EOOl的一种新型β -内切葡聚糖酶属于糖苷水解酶的第12家族，命名 为Aus Cell2A，其相应的基因命名为Aus cell2A0 Aus Cell2A具有较高的催化活性和热稳定性，有较大的工业化生产、应用潜力和经济价值。
图1 获取A. usamii EOOl Cell2A基因完整mRNA和DNA序列的流程2 重组质粒pPIC9K_cell2A的构建示意图
具体实施例方式以下结合具体实施例，进一步阐述本发明的操作方法。但是这些实施例仅用于详 细说明本发明，而不用于限制本发明的范围。实施例IAus cell2A 3'端mRNA序列的克隆以Oligo dT-Adaptor Primer为引物反转录合成cDNA的第一条链；以M13 Primer M4和Cell2A-3Fl为引物进行第一轮PCR，其反应条件为94°C 2min，30个循环(94°C 30s， 52°C 30s, 72°C 90s) ,72°C IOmin ；以 M13 Primer M4 和 Cell2A_3F2 为引物进行第二轮 PCR， 其反应条件为:94°C 2min, 30 个循环(94°C 30s, 52°C 30s, 72°C 90s)，72°C lOmin。将两轮PCR 产物用琼脂糖凝胶电泳分析，回收目的条带并与PUCm-T连接(pUCm-T-Cell2A3')，转 化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序。实施例2Aus ce 112A 5'端mRNA序列的克隆以 5 ‘ -Full RACE Kit 的 Outer Primer 和 Cell2A_5Rl 为引物进行第一轮 PCR，其反应条件为94°C 3min，30 个循环(94 °C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 60s), 72 °C IOmin ；以 Inner Primer和Cell2A_5R2为引物进行第二轮PCR，其反应条件为94°C 3min,30个循环 (94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 60s)，72°C IOmin0将两轮PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分析， 回收目的条带并与PUCm-T连接(pUCm-T-Cell2A5')，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上 海生工测序。实施例3Aus cell2A 5'端启动子序列的克隆以经处理的A. usamii EOOl基因组DNA为模板，第一轮PCR以T-PrimerF和 Cell2A-5Rl 为引物，反应条件为94°C 4min，30 个循环(94 °C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 60s)， 72°C IOmin ；第二轮PCR 以 T-PrimerF和 Cell2A_5R2 为引物，反应条件为94°C，4min，30 个 循环(94 °C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 60s), 72 °C IOmin。将两轮PCR产物用琼脂糖凝胶电泳 分析，割胶回收目的条带并与PUCm-T连接(pUCm-T-Cell2AP)，转化JM109，经酶切鉴定正确 后送上海生工测序。实施例4Aus cell2A 3'端转录终止区的克隆以经处理的A. usamii EOOl基因组DNA为模板，第一轮PCR以Cell2A_3F3和 T-PrimerR 为引物，反应条件为94°C 4min，30 个循环(94 °C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 60s), 72°C IOmin ；第二轮 PCR 以 Cell2A_3F4 和 T-PrimerR 为引物，反应条件为94°C 4min，30 个 循环(94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 60s)，72°C IOmin0将两轮PCR产物用琼脂糖凝胶电泳 分析，割胶回收目的条带并与PUCm-T连接(pUCm-T-Cell2A3T)，转化JM109，经酶切鉴定正 确后送上海生工测序。实施例5含编码Aus Cel 12A成熟肽基因的表达质粒的构建以Oligo dT-Adaptor I^rimer为引物进行反转录合成cDNA的第一条链；以Cell2A-F和M13 Primer M4为引物进行第一轮PCR，反应条件为94°C 2min，30个循环 (94°C 30s, 53°C 30s, 72°C 60s) ,72°C IOmin ；以 Cell2A_F 禾口 Cell2A_R 为引物进行第二轮 PCR，反应条件为94°C 2min，30 个循环(94°C 30s, 53°C 30s, 72°C 45s)，72°C IOmin0 将第二 轮PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分析，回收目的条带并与pUCm-T连接(pUCm-T-ce112A)， 转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序。将测序结果正确的pUCm-T-Cell2A与 PPIC9K质粒均用EcoR I和Not I进行双酶切，回收的酶切产物在T4 DNA连接酶的作用下 进行连接，得到重组质粒pPIC9K-cell2A，并对重组质粒进行序列测定。实施例6GS115/cell2A的构建、表达、产物纯化及活性测定用Ml I对pPIC9K-cell2A进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转化、筛 选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/cell2A。该基因工程菌用1.0%甲醇诱导表达 96h，采用DNS法测得发酵液中重组β-内切葡聚糖酶活性达MOU/mL。发酵液经离心后 的上清液为重组AusCell2A粗酶液，该粗酶液经截留分子量为IOkDa的超滤膜浓缩，再经 DEAE-Sepharose !^astFlow离子交换层析和kphadex G_75凝胶过滤层析纯化，纯化后经 SDS-PAGE检测为单一条带，并显示重组Aus Cell2A的分子量为27kDa。该重组Aus Cell2A 的最适作用温度60°C，最适作用pH 5.0，该酶在？!1 4.0-7.0、60°C以下稳定。
权利要求
1.一种来源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)EOOl菌株糖苷水解酶第12家族 (GHl2)的新型β-1，4-内切葡聚糖酶基因(Aus cell2A)，其完整mRNA和DNA的核苷酸序 列分别为 SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO :2。
2.由权利要求1所述的葡聚糖酶基因(Auscell2A)编码的新型β_1，4_内切葡聚糖 酶(AusCel 12Α)，其完整的氨基酸序列对应于序列表中的为SEQ ID NO :3。
3.Aus cell2A完整mRNA和DNA序列的获取方法(1)Auscell2A 3'端mRNA序列的克隆首先对Aspergillus kawachii,AspergiIlus niger和Aspergillus terreus GHl2的β -内切葡聚糖酶的氨基酸序列进行同源比对，找 出两段约10个氨基酸的保守序列，再对该两段氨基酸序列的mRNA进行同源比对，设计两条 正向简并引物Cell2A-3Fl和Cell2A_3F2 ；Ce112A-3F1 5 ‘ -TA(T/C)GACAG(T/C)GC(G/C)TCGAGCCC-3‘Ce112A-3F2 5 ‘ -GTGAA (A/G)AGCTACTC(T/G)AACTC-3‘以A. usamii EOOl总RNA为模板，Oligo dT-Adaptor Primer为引物反转录合成 cDNA的第一条链；以M13 Primer M4和Cell2A_3Fl为引物进行第一轮PCR，其反应条件 为94°C 2min，30 个循环(94 °C 30s, 52 °C 30s, 72 °C 90s) ,72 °C IOmin ；以 M13 Primer M4 和Cell2A-3F2为引物进行第二轮PCR，其反应条件为94°C 2min，30个循环(94°C 30s, 52°C 30s，72°C 90s)，72°C IOmin ；目的条带经克隆、测序，得到 Aus cell2A 3'端 mRNA 序 列；(2)Auscell2A 5'端mRNA序列的克隆基于上述得到的Aus cell2A 3'端mRNA序 列，设计两条反向引物Cell2A-5Rl和Cell2A_5R2 ；Cell2A-5Rl 5' -TTGTCCTGCTTCCATTCCAC-3‘Ce112A-5R2 5‘ -ACATCACTCACGAGCTTCTT-3‘以反转录合成的cDNA第一条链为模板、Outer Primer和Cell2A_5Rl为引物进行第一 轮 PCR，其反应条件为94°C 3min，30 个循环(94°C 30s，55°C 30s，72°C 60s)，72°C IOmin ；以 Inner Primer和Cell2A_5R2为引物进行第二轮PCR，其反应条件为94°C 3min,30个循环 (94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 60s)，72°C IOmin ；目的条带经克隆、测序，得到 Aus cell2A 5' 端mRNA序列；(3)Auscell2A 5'端启动子序列的克隆以经处理的A. usamii EOOl基因组DNA为 模板，第一轮PCR以T-PrimerF和Cell2A_5Rl为引物，反应条件为94°C 4min,30个循环 (94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 60s) ,72°C IOmin ；第二轮 PCR 以 T-PrimerF 和 Cell2A_5R2 为引 物，反应条件为94°C，4min, 30 个循环(94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 60s)，72°C IOmin ；目的条 带经克隆、测序，得到Aus cell2A 5'端启动子序列；(4)Auscell2A 3'端转录终止区序列的克隆基于上述得到的Aus cell2A 3'端 mRNA序列，设计两条正向引物Cell2A-3F3和Cell2A_3F4 ；Ce112A-3F3 5 ‘ -GTGTCAGAAAGCCCTATCAA-3‘Ce112A-3F4 5‘ -CAGCTATCTCACTCAGAACC-3‘以经处理的A. usami i EOO1基因组DNA为模板，第一轮PCR以Ce 112A-3F3和T-Pr imerR 为引物，第二轮PCR以Cell2A-3F4和T-PrimerR为引物；目的条带经克隆、测序，得到 Auscell2A 3'端转录终止区序列；
4. Aus Cel 12A工程菌的构建和表达方法(1)含编码AusCell2A成熟肽基因的表达质粒的构建以M13 Primer M4和 Cell2A-F 为引物进行第一轮 PCR(94°C 2min ；30 个循环，94 °C 30s, 53 °C 30s, 72 °C 60s ； 72°C IOmin)；以 Cell2A_F 和 Cell2A_R 为引物第二轮 PCR(94°C 2min ；30 个循环，94°C 30s, 53 °C 30s，72 °C 45s ；72 °C lOmin)；将第二轮PCR的目的条带进行克隆、测序；测序正确的 pUCm-T-cell2A与pPIC9K质粒均用EcoR I和Not I进行双酶切，回收的酶切产物在T4 DNA 连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pPIC9K-cell2A，并对重组质粒进行测序鉴定；(2)GS115/cell2A的构建、表达、产物纯化及活性测定用SalI对pPIC9K-cell2A进 行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转化、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/ cell2A ；该工程菌用1. 0%甲醇诱导96h，DNS法测得发酵液中重组木聚糖酶活性达MOIU/ mL。发酵液经离心后的上清液为重组β -内切葡聚糖酶粗酶液，经截留分子量为IOkDa的 超滤膜浓缩，再经DEAE-kpharose Fast Flow离子交换层析和kphadex G_75凝胶过滤层 析纯化，纯化后经SDS-PAGE检测为单一条带，并显示重组葡聚糖酶分子量为27kDa ；该重组 葡聚糖酶最适作用温度60°C，最适作用pH
5.0，该酶在？!1 3.0 7.0、601以下稳定。
全文摘要
本发明提出了一种源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001的β-1，4-内切葡聚糖酶基因完整mRNA和DNA序列的克隆方法，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO1和SEQ ID NO2。生物信息学分析表明该β-内切葡聚糖酶属于糖苷水解酶第12家族，命名为Aus Cel12A，其氨基酸序列为SEQ ID NO3，相应的基因命名为Aus cel12A。本发明还公开了Aus Cel12A工程菌的构建以及重组Aus Cel12A的高效表达和纯化的方法。制备的重组Aus Cel12A的最适作用温度和pH分别为60℃和5.0，在pH 4.0-7.0、60℃以下稳定，具有较大的工业化生产潜力和经济价值，也为其它β-内切葡聚糖酶的研究奠定了理论基础。
文档编号C12N9/42GK102127555SQ201010581299
公开日2011年7月20日 申请日期2010年12月10日 优先权日2010年12月10日
发明者刘高磊, 史红玲, 邬敏辰, 郭静, 韦敬土 申请人:江南大学