专利名称：一种耐热的内切－β－1,4－葡聚糖酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种在高温时有纤维素分解活性的酶，特别是内切-β-1，4-葡聚糖酶；编码该有纤维素分解活性的酶的克隆DNA序列；提供编码这种酶的基因的方法；生产这种酶的方法；一种含有所述具纤维素分解活性的酶的酶组合物；以及该酶和酶组合物的多种工业应用。
背景技术：
纤维素酶或纤维素分解酶是参与纤维素水解过程的酶。天然纤维素的水解中，众所周知有三类主要的纤维素酶参与这一过程，即纤维素二糖水解酶(1，4-β-D-葡聚糖纤维素二糖水解酶，EC3.2.1.91)，内切-β-1，4-葡聚糖酶(内切-1，4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶，EC3.2.1.4)和β-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)。
特别是内切-β-1，4-葡聚糖酶(EC3.2.1.4)构成一组可用于上述工业用途的引人注意的水解酶。内切-β-1，4-葡聚糖酶催化纤维素、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣多糖中1，4-β-D-糖苷键的内切水解，及混合β-1，3-葡聚糖，如谷类β-D-葡聚糖或木糖葡聚糖(xyloglucan)和含有纤维素部分的其他植物材料中的β-1，4键的内切水解。其权威命名是内切-1，4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶，本说明书使用简称内切-β-1，4-葡聚糖酶。可以参考T.M.Enveri，“微生物纤维素酶”，W.M.Fogarty，微生物酶类与生物技术，应用科学出版社，183-224页(1983)；酶学方法(1988)160卷，200-391页(Wood，W.A和Kellogg，S.T.编)；Beguin，P.“纤维素降解的分子生物学”，微生物学年度综述(1990)，44卷，219-248页；Beguin，P.和Aubert，J-P.“纤维素的生物降解”，FEMS微生物学综述13(1994)25-58页；Henrissat，B.“纤维素酶及它们与纤维素的相互作用”，纤维素(1994)，1卷，169-196页。
纤维素酶在大量微生物中都能合成，包括真菌，放线菌，粘细菌和真细菌，也能由植物合成。特别是已鉴定到具有各种特异性的内切-β-1，4-葡聚糖酶。已描述过许多细菌内切-β-1，4-葡聚糖酶(Henrissat，B.和Bairoch，A.(1993)生物化学杂志293781-788；Gilbert，H.J.和Hazlewood，G.P.(1993)普通微生物学杂志139187-194)。
比较上位的分类组古生物(Archaea)分成两个门Euryarchaeota和Crenarchaeota。古生物中Euryarchaeota门内的热球菌目包含热球菌属(Pyrococcus)和热球菌属(Thermococcus)(Maidak等，1996)。这些生物体分离自海洋或陆地硫酸盐环境中，它们是厌氧性生物，高度嗜热。激烈热球菌在100℃时生长情况最好，并且最高生长温度是103℃。在15-35g/l NaCl存在时可达到最佳生长状况。已有记载表明激烈热球菌利用肽、蛋白质、淀粉以及麦芽糖作为碳源(Zilling，1992)。
来自多种古生物的各种细胞外酶已有记载。例如，已在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中克隆和表达了来自激烈热球菌DSM 3638、最适温度约为100℃的一种淀粉酶(国际专利申请PCT/DK/90/00074)。来自各种古生物的其它水解酶(如细胞外木聚糖酶、β-甘露糖苷酶和β-半乳糖苷酶)以及胞内蛋白酶都有记载(Halio等，1996)。
已记载、鉴定和克隆了一种来自激烈热球菌DSM 3638的β-葡糖苷酶(Kengen，1993)。对该激烈热球菌β-葡糖苷酶的鉴定工作揭示出，该酶对纤维素或其它β-连接的葡萄糖聚合物没有活性(Bauer等，1996)。WO 97/44361(第115-117页)中公开了一种多核苷酸序列，该序列编码来自激烈热球菌、具有内切-β-1，4-葡聚糖酶活性的一种多肽。Thermophilum pendens是与古生物Crenarchaeota门热棒菌属有关的一种生物，已证实它能产生少量在88℃对羧甲基纤维素有活性的葡聚糖酶。然而，无论是酶还是分离物，都未见有进一步鉴定的记载(Bragger等，1989)。
木糖葡聚糖酶活性不包括在酶命名法(1992)提供的酶分类中。迄今为止，这一酶促活性仅仅被归类为葡聚糖酶活性，并常常被视为与纤维素分解活性(EC3.2.1.4)，即对纤维素或纤维素衍生底物中β-1，4-糖苷键作用的活性相同，或者至少是具有纤维素分解活性的酶的一种次要活性。然而，一种真正的木糖葡聚糖酶是一种真正的木糖葡聚糖特异性酶，能够催化木糖葡聚糖溶解形成木糖葡聚糖寡糖，但不具有明显的纤维素分解活性，如对常规所用纤维素样底物CMC(羧甲基纤维素)、HE纤维素和Avicel(微晶纤维素)作用的活性。木糖葡聚糖酶切割木糖葡聚糖骨架内的β-1，4-糖苷键。
木糖葡聚糖酶活性由Vincken等人(1997)进行了描述，他们从绿色木霉(类似于T.reesi)中鉴定出了三种不同内切-β-1，4-葡聚糖酶，它们对纤维素或CMC都有很高活性，并且，EndoI[它确实属于糖基水解酶的第5家族，参见Henrissat B.等(1991，1993)]对木糖葡聚糖基本上没有(即非常少)活性，EndoV(属于糖基水解酶的第7家族)和EndoIV(属于糖基水解酶的第12家族)二者对木糖葡聚糖和CMC都分别有相同数量级的活性。因此，人们估计，第12家族的内切-β-1，4-葡聚糖酶也可能具有木糖葡聚糖酶活性。
纤维素分解酶一种非常重要的工业用途是用来处理纤维素纤维、纺织品或织物，例如作为洗涤剂组合物或织物柔软剂组合物的成分，用于纺织工业中纤维素材料的酶促精练，机织织物的脱浆，新织物的生物抛光(衣物整理)，及获得含纤维素织物(特别是粗斜纹布)的“石洗”外观，这些处理过程的一些方法例如在GB-A-1 368 599，EP-A-0 307 564和EP-A-0 435 876，WO 91/17243，WO91/10732，WO91/17244，PCT/DK95/000108和PCT/DK95/00132中已被提及。纤维素分解酶另一个重要的工业用途是用于处理纸浆，如用于改善排水或回收纸张的除墨。
人们还知道，纤维素酶可以含有或不含有纤维素结合结构域(CBD)。CBD能够增强酶与含纤维素之纤维的结合，并提高该酶催化活性部位的功效。
仍然需要提供新型纤维素酶制剂，可以用在那些希望有纤维素酶(优选是内切-β-1，4-葡聚糖酶)活性的应用中。
本发明的目的是提供新型酶组合物，所述酶组合物在高温条件下具有显著的纤维素分解活性，并且在纸浆加工、纺织品处理、洗衣过程、提取过程或动物饲养中的性能有所改进；优选新型纤维素酶，更优选性能很好的内切-β-1，4-葡聚糖酶，预计这些酶可通过重组技术产生或是通过重组技术产生的。
发明概述本发明人已经成功克隆和鉴定了一种来自古生物激烈热球菌的DNA序列，它编码一种在极高温度下、很宽的pH范围内具有纤维素分解活性的酶，从而有可能用它来制备具有所期望特性的单组分纤维素分解酶组合物。
因此，本发明第一方面涉及具有内切-β-1，4-葡聚糖酶活性的酶制剂，它在至少90℃、优选至少95℃、更优选至少100℃的温度下具有最佳活性。该制剂可得自属于古生物、优选属于Euryarchaeota门、更优选属于热球菌(Thermococcoales)亚门的一个菌株，或者是其内源物。
本发明第二方面涉及一种DNA构建体，其中含有编码一种酶的DNA序列，所述酶具有内切-β-1，4-葡聚糖酶活性，并且最佳活性在90℃以上、优选95℃以上、更优选100℃以上，该DNA序列包含a)相应于SEQ ID NO1的DNA序列或可得自大肠杆菌DSM11203内质粒的DNA序列中内切-β-1，4-葡聚糖酶编码部分的DNA序列，或b)相应于SEQ ID NO1的DNA序列或可得自大肠杆菌DSM11203内质粒的DNA序列中内切-β-1，4-葡聚糖酶编码部分的DNA序列的相似物，它i)与相应于SEQ ID NO1的DNA序列或可得自大肠杆菌DSM11203内质粒的DNA序列中内切-β-1，4-葡聚糖酶编码部分的DNA序列同源，优选至少40％同源，或ii)与相应于SEQ ID NO1的DNA序列或可得自大肠杆菌DSM11203内质粒的DNA序列中内切-β-1，4-葡聚糖酶编码部分的DNA序列可杂交，或者iii)编码一种多肽，该多肽与SEQ ID NO2的多肽或者由包含相应于SEQ ID NO1的DNA序列或可得自大肠杆菌DSM11203内质粒的DNA序列中内切-β-1，4-葡聚糖酶编码部分之DNA序列的DNA序列所编码的多肽同源，优选至少45％同源，或者iv)编码一种多肽，该多肽与针对纯化的内切-β-1，4-葡聚糖酶产生的抗体有免疫反应性，所述内切-β-1，4-葡聚糖酶是由相应于SEQ IDNO1的DNA序列或可得自大肠杆菌DSM11203内质粒的DNA序列中内切-β-1，4-葡聚糖酶编码部分的DNA序列编码的。
在第三、四、五方面，本发明提供了带有本发明克隆DNA序列的表达载体；含有克隆DNA序列或表达载体的细胞以及生产显示有纤维素分解活性的酶的方法，该方法包括在允许该酶产生的条件下培养所述细胞，和从培养物中回收该酶。
本发明另一方面提供一种有纤维素分解活性的分离酶，其特征在于(i)不含同源杂质，并且(ii)该酶由上述方法产生。
本发明进一步涉及有纤维素分解活性的分离酶，优选内切-β-1，4-葡聚糖酶，其由本发明的DNA构建体编码。另外，本发明涉及本发明这种酶或酶制剂在工业应用中的用途，如在纺织业中用于改善纤维素纤维或织物的特性或者提供粗斜纹布的石洗外观；或者用于纤维素纤维加工业中，特别是用于大麻、黄麻、亚麻或亚麻布的浸解中；或者用于工业清洁程序；或者用在热挤压聚合物材料中；或者用于生物质转化成糖的过程中；或者用于生产乙醇；或者用于预消化例如饲料生产中所用的谷物；或者用于生产速溶咖啡或类似的提取过程；或者用于钻油工业中；或者用于通过聚合物驱油法提高油开采量。
本发明还涉及含有纤维素酶编码DNA序列之大肠杆菌菌株DSM11203的一种基本纯的分离生物学培养物(克隆至大肠杆菌DSM11203内存在的质粒pSJ1678中的DNA序列纤维素酶编码部分来源于古生物激烈热球菌，或所述大肠杆菌菌株的任何突变体)。发明详述本文中，术语“20种天然存在的氨基酸残基”表示常见于蛋白质中的20种氨基酸残基，惯称丙氨酸(Ala或A)，缬氨酸(Val或V)，亮氨酸(Leu或L)、异亮氨酸(Ile或I)、脯氨酸(Pro或P)、苯丙氨酸(Phe或F)，色氨酸(Trp或W)、甲硫氨酸(Met或M)、甘氨酸(Gly或G)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、半胱氨酸(Cys或C)、酪氨酸(Tyr或Y)、天冬酰胺(Asn或N)、谷氨酰胺(Gln或Q)、天冬氨酸(Asp或D)、谷氨酸(Glu或E)、赖氨酸(Lys或K)、精氨酸(Arg或R)和组氨酸(His或H)。
本发明的酶和酶制剂在宽范围pH都有活性，优选在大约pH4-11有活性，更优选在大约pH5.5--10之间有活性。
在一个优选的实施方案中，本发明的酶或酶制剂可得自一株菌或是其内源物，所述菌株属于古生物，更优选属于Euryarchaeota门，甚至更优选属于热球菌属，特别是激烈热球菌，如激烈热球菌DSM3638。此外，人们确信，本发明的酶包括在糖基水解酶第12家族这一定义内，即本发明的酶优选是第12家族的内切-β-1，4-葡聚糖酶。本发明酶的分子量约为34kDa。然而，可以想见，本发明酶也可以具有约30-35kDa(即30，31，32，33，34或35kDa)的表观分子量，这取决于在发酵和/或纯化过程中对该酶N-末端氨基酸残基序列作用的蛋白水解活性的存在与否。换言之，该酶可能在N-末端有所截短，但仍完全维持了内切-β-1，4-葡聚糖酶活性。
本文中，表达术语“克隆DNA序列”，无论是部分还是完整的，均是指采用基因工程中的标准克隆步骤，将一段DNA从它的天然位置重新放置于不同的位点(在该处它将被复制)，由此克隆的DNA序列。克隆过程包括切出和分离目标DNA片段，将该段DNA插入至载体分子内并将重组载体引入细胞，在细胞内将复制出多拷贝或多克隆的该DNA片段。
本发明的“克隆DNA序列”也可称为“DNA构建体”或“分离DNA序列”。
该DNA序列可以是基因组DNA、cDNA或合成来源的，或者是它们的任意组合。克隆到大肠杆菌DSM11203中质粒pSJ1678上的DNA序列的内切葡聚糖酶或纤维素酶编码部分和/或本发明的相似DNA序列可以从能产生有纤维素酶(优选内切-β-1，4-葡聚糖酶)活性的酶的古生物激烈热球菌一个菌株、优选DSM3638菌株中克隆得到，或者可从以下进一步描述的其它或相关生物体中克隆得到。
或者，类似序列可以依据SEQ ID NO1的DNA序列或可从大肠杆菌DSM11203中质粒得到的DNA序列构建而成(例如是其亚序列)，和/或通过导入不会使该DNA序列编码的纤维素酶氨基酸序列改变的核苷酸取代而获得，所述取代与旨在用于生产该酶的宿主微生物的密码子用法一致，或者通过导入使得产生不同氨基酸序列(即本发明纤维素酶的变体)的核苷酸取代而获得。
人们确信，SEQ ID NO1的DNA序列相应于可得自大肠杆菌DSM11203中质粒的DNA序列。
进行核苷酸取代时，优选氨基酸的变化影响较小，即是不会显著影响蛋白质折叠或酶促活性的保守性氨基酸取代，小片段删除，通常是删除1到约30个氨基酸；小段氨基或羧基末端延伸，例如一个氨基末端甲硫氨酸残基，不超过大约20-25个残基的小连接肽，或者有助于纯化的小段延伸，如一段多组氨酸，抗原决定簇或结合结构域。
保守性取代的例子有碱性氨基酸(如精氨酸、赖氨酸、组氨酸)、酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(如谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(如亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)、芳香族氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸)和小氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸)各组内的取代。核苷酸取代的综述可见如Ford等，(1991)，蛋白质表达和纯化，2，95-107。
对于本领域技术人员而言，很显然，可以在对分子的功能比较重要的区域之外进行这些取代，仍能得到活性多肽。可以用本领域的已知技术，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(参见例如Cunningham和Wells，(1989)，科学2441081-1085)，鉴定出对本发明克隆DNA序列所编码多肽的活性必需的、因此最好不做取代的氨基酸。后一种技术中将突变引入分子内的每一个残基处，检测所得突变分子的生物学(即纤维素分解)活性，以便鉴定出对该分子活性比较重要的氨基酸残基。底物-酶相互作用位点也可以通过分析晶体结构确定，如通过核磁共振分析、结晶学或光亲和标记等技术确定(参见例如de Vos等，(1992)，科学255306-312；Smith等，(1992)，分子生物学杂志224899-904；Wlodaver等，(1992)，FEBS快报30959-64)。
本发明DNA构建体的DNA序列所编码的内切-β-1，4-葡聚糖酶可以包含一个作为所编码之酶的整合部分的纤维素结合结构域(CBD)，或者可以向内切-β-1，4-葡聚糖酶中引入其他来源的CBD，形成酶杂合体。本文中，术语“纤维素结合结构域”应按“不溶性碳水化合物的酶解”，John N.Saddler和Michael H.Penner(编)，ACS研讨会系列，No.618，1996中Peter Tomme等“纤维素结合结构域分类和特性”定义的理解。该定义将120多种纤维素结合结构域分成10族(I-X)，并表明CBD存在于多种酶中，如纤维素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰酯酶和壳多糖酶。CBD还被发现存在于藻类，如红藻Porphyra purpurea中，这是一种非水解性的多糖结合蛋白质，参见Tomme等，(出处同前)。但大多数CBD来自纤维素酶和木聚糖酶。CBD位于蛋白质的N和C末端或者在内部。酶杂合体是本领域已知的，参见如WO90/00609和W095/16782，可以通过下述制得，即将DNA构建体转化至宿主细胞中，其中所述构建体含有至少一个编码纤维素结合结构域的DNA片段，带有或不带有接头而连接到编码内切-β-1，4-葡聚糖酶的DNA序列上，再培养宿主细胞以表达融合基因。酶杂合体可以用下列通式描述CBD-MR-X其中CBD是至少相应于纤维素结合结构域的氨基酸序列的N-末端或C-末端区域；MR是中间区域(接头)，可以是一个键，或者是一个短连接基团，所述连接基团优选含有约2-100个碳原子，更优选2-40个碳原子；或者优选是约2-100个氨基酸，更优选是2-40个氨基酸；X是本发明DNA序列所编码的多肽的N-末端或C-末端区域。
本发明的DNA序列可以用如Sambrook等((1989)，分子克隆实验指南Cold Spring Harbor Lab.Cold Spring Harbor，NY)描述的标准方法，从大肠杆菌DSM11203菌株中克隆得到。
本发明的DNA序列也可以用包含下述的任何一般方法克隆得到，—在合适的载体中克隆来自预期产生所需内切-β-1，4-葡聚糖酶的任何生物体(例如激烈热球菌)的DNA文库，—用所述载体转化合适的宿主细胞，—在合适的条件下培养宿主细胞，以表达由DNA文库中的克隆编码的任何目标酶，—通过测定这些克隆产生的酶的任何纤维素分解活性，筛选阳性克隆，以及—从这些克隆中分离编码该酶的DNA。
或者，可以依照众所周知的步骤，通过利用依据SEQ ID NO1的DNA序列或者可得自大肠杆菌DSM11203内质粒的DNA序列制备的合成寡核苷酸探针，方便地从合适的来源(例如以下提到的任何一种生物体)克隆得到编码本发明纤维素酶的DNA。
编码内切-β-1，4-葡聚糖酶的DNA序列的同源性利用SEQ ID NO1的DNA序列进行同源性分析。同源性分析显示，最相关的DNA序列是编码那不勒斯栖热袍菌的内切-β-1，4-葡聚糖酶的一个基因(GenBank acc.No.U93354，Bok，J.D.和Eveleigh，D.E.Direct Submission to database Submitted(1997年3月13日)Biochemistry and Microbiology，Cook College，Rutgers University，Lipman Drive，New Brunswick，NJ08903，USA)，SEQ ID NO1所示的DNA序列与该基因有34％的同一性。
利用上述的同源性分析鉴定出的低同源性表明本发明的内切-β-1，4-葡聚糖酶与任何已知的内切-β-1，4-葡聚糖酶相距较远。
上述提到的DNA序列同源性定义为两个序列间的相同程度，表明第一个序列来自第二个序列的派生关系。可以利用本领域已知的计算机程序，如GCG程序包提供的GAP程序(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1970)分子生物学杂志48443-453)合适地确定同源性。利用GCG程序包(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1970)分子生物学杂志48443-453)提供的GAP程序，作如下设置，进行DNA序列比较GAP产生罚分为5.0，GAP延伸罚分为0.3。利用上述设置的GAP进行DNA序列比较，结果发现，本发明的DNA构建体中包含的DNA序列显示与SEQ ID NO1的DNA序列或者可得自大肠杆菌DSM11203内质粒的DNA序列优选至少40％相同，更优选至少45％、更优选至少50％、更优选至少60％、甚至更优选至少70％、特别是至少80％、尤其是至少95％相同。
杂交上面所提到的杂交是指在如下详述的某些特定条件下，相似(部分)DNA序列与相应于可得自大肠杆菌DSM11203内质粒的DNA序列中内切-β-1，4-葡聚糖酶编码部分的寡核苷酸探针能发生杂交。
用于确定核苷酸探针与同源DNA或RNA序列间杂交情况的适宜条件包括将含有待杂交的DNA片段或RNA的滤膜预先在5×SSC(标准柠檬酸盐溶液)中浸泡10分钟，在5×SSC(Sambrook等，1989)、5×Denhardt’s溶液(Sambrook等，1989)、0.5％SDS和100μg/ml变性的超声处理鲑精DNA(Sambrook等，1989)溶液中对膜进行预杂交，然后在含有随机引发(Feinberg A.P.和Vogelstein B(1983)分析生物化学1326-13)的32P-dCTP标记(比活＞1×109cpm/μg)探针的相同溶液中于大约45℃杂交12小时。再在2×SSC、0.5％SDS中洗涤膜30分钟两次，优选洗涤温度至少55℃，更优选至少60℃，更优选至少65℃，还要更优选至少70℃，特别是至少75℃。
用X-光胶片检测在这些条件下与寡核苷酸探针杂交上的分子。
与氨基酸序列的同源性利用SEQ ID NO2的氨基酸序列进行同源性分析。同源性分析显示，最相关的蛋白质是来自那不勒斯栖热袍菌的内切-β-1，4-葡聚糖酶(Acc.No.U93354，Bok，J.D.和Eveleigh，D.E.Direct Submission todatabase Submitted(1997年3月13日)Biochemistry andMicrobiology，Cook College，Rutgers University，Lipman Drive，NewBrunswick，NJ08903，USA)，SEQ ID NO2所示的氨基酸序列与该蛋白质有39％相同。
利用SWISSPROT登录号 P16630的胡萝卜软腐欧文氏菌纤维素酶(属于糖基水解酶第12家族)的蛋白质序列，以及上面提到的那不勒斯栖热袍菌纤维素酶蛋白质序列和SEQ ID NO2(本发明)的蛋白质序列，进行疏水区分析。此分析显示，具有SEQ ID NO2蛋白质序列的蛋白质以及那不勒斯栖热袍菌纤维素酶属于糖基水解酶的第12家族(Lemesle-Varloot L，Henrissat B，Gaboriaud C，Bissery V，Morgat A，和Mornon Jp，疏水区分析Biochimie 72(8)555-574，1990)。
利用上述同源性分析鉴定出的低同源性表明本发明的内切-β-1，4-葡聚糖酶与任何已知的内切-β-1，4-葡聚糖酶相距较远。
上面提到的氨基酸序列同源性定义为两个序列间的相同程度，表明第一个序列来自第二个序列的派生关系。可以利用本领域已知的计算机程序，如GCG程序包的FASTA程序，采用GCG程序包提供的下述设置评分矩阵(Scoring matrix)GenRunDatablosum50.cmp，变量因子(varible pamfactor)采用GAP产生罚分12，GAP延伸罚分2，从而合适地确定同源性(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1970)分子生物学杂志48443-453)。利用具有上述设置的FASTA进行氨基酸序列比较，结果显示，该氨基酸序列与SEQ ID NO2所示的氨基酸序列或者由SEQ ID NO1的DNA序列中或可得自大肠杆菌DSM11203内质粒的DNA序列中内切-β-1，4-葡聚糖酶编码部分所编码多肽的氨基酸序列，相同程度优选为至少45％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，特别是至少95％。
免疫交叉反应性用于测定免疫交叉反应性的抗体可以利用提纯的纤维素分解酶制备。更具体地说，可以参照N.Axelsen等，定量免疫电泳指南，Blackwell科学出版社，1973，23章，或A.Johnstone和R.Thorpe，实用免疫化学，Blackwell科学出版社，1982(具体是27-31页)所述的程序，通过免疫兔子(或其他啮齿类动物)，得到针对本发明内切-β-1，4-葡聚糖酶的抗血清。纯化的免疫球蛋白可以从抗血清获得，例如通过盐析((NH4)2SO4)，然后透析，并在如DEAE-Sephadex上进行离子交换层析。蛋白质的免疫化学鉴定可以利用Outcherlony双向扩散分析(O.Ouchterlony，实验免疫学手册(D.M.Weir编)，Blackwell科学出版社，1967，655-706页)，交叉免疫电泳(N.Axelsen等，出处同前，第3和4章)或火箭免疫电泳(N.Axelsen等，第2章)进行。
微生物来源以下使用的分类命名与Maidak等(1996)一致。
为了本发明目的，本文中与某个特定来源联系使用的术语“得自”或“可得自”，意指该酶是由或者可以由这个特定来源或插入了来自这个来源的基因的细胞产生。
目前预计本发明的纤维素酶可以得自古生物，特别是属于Euryarchaeota门的菌株，优选属于热球菌亚门的菌株，特别是热球菌属的菌株，具体说是激烈热球菌的一个菌株。
在一个优选实施方案中，本发明的纤维素酶得自激烈热球菌DSM3638菌株。目前预计编码本发明酶的同源酶的DNA序列可以得自其他古生物菌株，特别是属于热球菌属的菌株。
能够从中得到本发明纤维素酶的一株激烈热球菌的分离培养物可以从德意志微生物保藏中心，以DSM3638公开得到。
另外，含有编码本发明内切-β-1，4-葡聚糖酶的DNA序列的质粒pSJ1678已被转化到一个大肠杆菌菌株中，发明人依照布达佩斯条约国际承认用于专利程序的微生物保藏规定，于1996年10月11日将该菌株保藏在Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1b，D-38124Braunschweig，Federal Republic of Germany，保藏号DSM11203。
重组表达载体含有编码本发明所述酶的DNA构建体的重组载体可以是能够方便地进行重组DNA操作的任何载体，载体的选择经常取决于它将要导入的宿主细胞。因此，载体可以是一种自主复制的载体，即以染色体外实体存在、复制独立于染色体复制过程的载体，例如质粒。或者，载体可以是这样一种类型，当它被导入宿主细胞中时，将会部分或全部整合到宿主细胞基因组中，并与其整合入的染色体一起复制。
载体优选是一种表达载体，其中编码本发明酶的DNA序列可操纵地连接了该DNA转录所需的附加片段。一般来说，表达载体来源于质粒或病毒DNA，或者可以含有两者的成分。术语“可操纵地连接”表明各片段的排列方式能使其功能与它们的预期用途一致，例如，使转录在启动子内起始并持续在编码酶的DNA序列内进行。
启动子可以是在所选宿主细胞内显示转录活性的任何DNA序列，并可以来自编码宿主细胞同源或异源蛋白质的基因。
适用于细菌宿主细胞的启动子的例子包括嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖源淀粉酶基因的启动子，地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因的启动子，解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因的启动子，枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基因的启动子，或者短小芽孢杆菌木糖苷酶基因的启动子，或者噬菌体λPR或PL启动子，或大肠杆菌lac，trp或tac启动子。
在必要时，编码本发明酶的DNA序列也可以可操纵地连接合适的终止子。
本发明的重组载体还可以再含有使载体能在所选宿主细胞中复制的DNA序列。
载体也可以含有一个选择性标记，例如，一个其产物可补偿宿主细胞缺陷的基因，或者编码抗例如卡那霉素、氯霉素、红霉素、四环素、壮观霉素等抗生素的基因，或者编码抗重金属或除草剂的基因。
为了使本发明的酶进入宿主细胞的分泌途径，可以在重组载体中提供一个分泌信号序列(也称为前导序列，前体序列或前序列)。分泌信号序列以正确阅读框加接在编码该酶的DNA序列上。分泌信号序列通常置于编码酶的DNA序列的5’端。它可以是正常情况下就与该酶相关联的或者可以来自编码另一种分泌蛋白质的基因。
将编码本发明酶的DNA序列、启动子和任选的终止子和/或分泌信号序列分别连接，或者通过合适的PCR扩增方案组合这些序列，并将它们插入含有复制或整合必需信息的合适载体中的步骤，是本领域技术人员熟知的(参见例如，Sambrook等，出处同前)。
宿主细胞导入宿主细胞的编码本发明酶的DNA序列可以是该选定宿主细胞的同源或异源序列。如果是宿主细胞的同源序列，即是宿主细胞天然产生的，一般将它可操纵连接另外的启动子序列，或者，如果可行，连接另外的分泌信号序列和/或终止子序列，而不处于其天然环境中。术语“同源”意指包括编码所选宿主生物天然酶的DNA序列。术语“异源”意指包括天然情况下宿主细胞不表达的DNA序列。因此，该DNA序列可以来源于另一种生物体，或者可以是合成序列。
本发明DNA构建体或者重组载体被导入的宿主细胞可以是能够生产所述酶的任何细胞，包括细菌、酵母、真菌和高等真核细胞。
经过培养能产生本发明酶的细菌宿主细胞的例子是革兰氏阳性细菌，如芽孢杆菌属的菌株，例如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌；或链霉菌属的菌株，如浅青紫链霉菌或鼠灰链霉菌；或革兰氏阴性细菌，如大肠杆菌。细菌的转化可以通过原生质体转化、电穿孔、接合或用感受态细胞依照已知方式进行(参见Sambrook等，出处同前)。
当在细菌如大肠杆菌中表达酶时，该酶可以保留在细胞质中，通常以不溶性颗粒存在(称为包涵体)，或者可以被细菌分泌序列引导到壁膜间隙。前一种情况下，裂解细胞，收集颗粒并变性，随后稀释变性剂使酶重新折叠。后一种情况下，通过在例如超声破碎或渗透压休克破碎细胞以释放壁膜间隙成分后，再回收酶，即可以从壁膜间隙收集酶。
当在如芽孢杆菌或链霉菌菌株等革兰氏阳性细菌中表达该酶时，酶可以保留在细胞质中，或者被细菌分泌序列引导到胞外培养基中。后一种情况下，酶可以按以下描述从培养基中回收出来。
所述酵母细胞可以是酵母属的一个菌株，特别是酿酒酵母。真菌宿主细胞可以是曲霉属、镰孢属或木霉属的一个菌株。
生产纤维素分解酶的方法本发明提供了一种生产本发明的分离酶的方法，其中，在允许该酶产生的条件下，培养已转化了编码该酶的DNA序列的合适宿主细胞，并从培养物中回收得到的酶。
如本文中的定义，一种分离的多肽(例如酶)是基本不含其它多肽的多肽，例如经SDS-PAGE测定，至少约20％纯，优选至少约40％纯，更优选约60％纯，甚至更优选约80％纯，最优选约90％纯，最最优选约95％纯。
术语“分离多肽”也可称为“纯化多肽”。
当将含有编码该酶的DNA序列的表达载体转化到异源宿主细胞中时，就有可能异源重组生产本发明的酶。
由此，有可能制备出很纯或单组分的纤维素分解组合物，其特征在于不含同源杂质。
本文中，同源杂质是指来源于最初获得本发明酶的同源细胞的任何杂质(例如本发明酶之外的其它多肽)。
本发明中，同源宿主细胞可以是激烈热球菌的一个菌株。
用于培养转化宿主细胞的培养基可以是适于所选宿主细胞生长的任何常规培养基。表达的纤维素分解酶可以方便地分泌到培养基中，并可以通过熟知的程序从中回收，包括通过离心或过滤将细胞从培养基中分离出来，用盐(例如硫酸铵)沉淀培养基中的蛋白质成分，随后进行如离子交换层析、亲和层析等层析。
酶组合物更进一步，本发明涉及含有上述具纤维素分解活性的酶的酶组合物。
本发明的酶组合物除包含本发明的纤维素酶之外，还可以含有一或多种其它酶类，例如半纤维素酶如木聚糖酶和甘露聚糖酶，其他纤维素酶或内切-β-1，4-葡聚糖酶组分，壳多糖酶、脂肪酶、酯酶、果胶酶、角质酶、肌醇六磷酸酶、氧化还原酶、蛋白酶或淀粉酶。
酶组合物可以依照本领域已知方法制备，可以是液态或干燥组合物形式。例如，酶组合物可以是颗粒或微粒形式。包含在组合物中的酶可以用本领域已知方法稳定化。
耐热纤维素酶在许多工业和应用领域中都有潜在的用途。以下给出了本发明酶组合物的优选用途的例子。本发明酶组合物的剂量和它的其它使用条件可以依据本领域已知方法确定。
本发明的酶组合物可以用于下列目的中的至少一种。
用途本文中，术语“纤维素材料”意指由棉花、棉混纺纱或者天然或人工纤维素(如来源于含木聚糖之纤维素纤维，如来自纸浆)或其混合物制成的纤维、已缝制或未缝制的织物，包括针织物、机织物、粗斜纹布、纱线和毛巾布。混合物的例子是棉或人造丝/粘胶丝与一种或多种配对材料的混合物，所述配对材料例如是羊毛，合成纤维(如聚酰胺纤维，丙烯酸纤维，聚酯纤维，聚乙烯醇纤维，聚氯乙烯纤维，聚偏二氯乙烯纤维，聚氨基甲酸乙酯纤维，聚脲纤维，芳族聚酰胺纤维)，和含纤维素的纤维(如人造丝/粘胶丝，苎麻，大麻，亚麻/亚麻布，黄麻，醋酸纤维素纤维，lyocell)。
在纺织业中，纤维素酶被用来对棉花和其它纤维素材料进行处理，以达到对纤维进行表面处理的目的，从而使织物性质改变，例如起球倾向降低、除去了绒毛、织物更为柔软、手感或视觉效果更好。特别是纤维素酶被用来产生粗斜纹布的“石洗”外观。高温下纤维素酶的使用有可能使粗斜纹布和非粗斜纹布棉/纤维素织物获得新外观。可以在织物的高温处理中使用耐热纤维素酶，这在以前是不太可能达到的；可以在80℃以上或在液体比率极低的蒸气条件下进行纤维素酶洗涤，这样有可能会得到新外观。
纺织工业中，将纤维素材料例如棉纤维处理成适于制衣的材料的方法包括几个步骤将纤维纺成纱线，将纱线编织成机织织物或针织织物以及后续的准备、染色和整理操作。机织织物是通过在一系列经线之间编织纬线来构造的；纱线可以是两种不同的类型。针织织物是由一根连续长的纱线形成联锁线圈网而构造的。纤维素纤维也可以用于非机织织物。
准备工序使纺织品在染色操作中能够产生合适的反应。准备工序中的各小步骤包括脱浆(对于机织产品)、精练和漂白。工业上也采用精练/漂白合并的一步加工法。尽管准备工序通常是在织物水平进行的；然而，也可以在纤维或纱线阶段进行精练、漂白和染色操作。
对于平幅或绳状的形式，处理过程可以通过处理液流间歇或连续地同织物接触。连续操作通常使用饱和器，在这里，以每份重量的织物大约等量的化学品，将化学品施加到织物上，接着是在其中将发生化学反应的加热了的停留室。然后洗涤区为织物在下面的处理步骤做准备。间歇操作通常在一个处理浴中进行，在这里织物与大约相当于其重量8-15倍的化学品浴进行接触。经过一段时间的反应后，排出化学品，水洗织物并施加下一种化学品。不连续的浸轧-堆放回苏工序包括一个饱和器，在此处，以每份重量的织物大约等重量的化学品浴，对织物进行处理，接着停留一段时间，其中对于冷浸轧-堆放回苏工序，该停留时间可以进行一天或多天。
机织产品是纺织织物结构的主要形式。机织过程需要对经线“上浆”以使其免受摩擦。由于可得性和价钱，淀粉、聚乙烯醇(PVA)、羧甲基纤维素、蜡和丙烯酸系粘合剂是使用的上浆化学物的典型实例。浆料必须在机织过程之后作为制备机织产品的第一步除掉。将上了浆的绳状或平幅形式的织物同含有退浆剂的处理液体接触。使用的退浆剂取决于要除掉的浆料的类型。对于PVA浆料，常常采用热水或者氧化型处理方法。对棉织物最通用的上浆剂是基于淀粉的上浆剂。因此最经常的是，机织棉织物通过热水、水解淀粉的α-淀粉酶和湿润剂或表面活性剂的混合物退浆。使纤维素材料在退浆化学品中保持足够长的“持续阶段”以完成退浆。持续阶段取决于处理方案的类型和温度，可以在15分钟到2小时，或者有时候可达数日。通常，在饱和器浴中使用退浆化学物，该饱和器浴通常大约15℃到55℃。然后将织物放置在例如能提供足够热量、通常为大约50℃到100℃的J型箱之类设备中，以提高退浆剂的活性。在持续阶段结束后，将化学品、包括除掉了的浆料从织物上洗掉。
为了确保有高白度或良好的可湿性以及染色性，浆料和使用的其他化学物必须完全去掉。通常认为，有效的退浆对于下面的准备工序-精练和漂白是至关重要的。
精练工序将棉中天然存在的大量非纤维素化合物去掉。除了天然的非纤维素杂质之外，精练可以去掉污垢、污渍以及制备过程中的残留物，例如纺丝、络筒或浆纱润滑剂。精练工序使用氢氧化钠或相关的苛性剂，例如碳酸钠、氢氧化钾或它们的混合物。通常，该工序中加入一种碱性稳定的表面活性剂，以提高疏水性化合物的溶解性，和/或防止它们重新沉淀回织物上。该工序通常在80-100℃的高温下，使用精练剂的强碱性溶液例如pH13-14。由于化学品处理的非特异性性能，化学品不但处理杂质而且处理纤维素自身，导致织物强度或其他理想织物性能受到损害。纤维素织物的柔软性是残留的天然棉蜡的函数。高温强碱性精练方法的非特异性性能不能区别所需的天然棉润滑剂和制备中加入的润滑剂。并且，由于来自于这些方法的高碱性废水，常规的精练方法会产生环境问题。精练阶段为织物在漂白中能达到最佳响应做准备。不恰当地精练了的织物将在后续的漂白阶段中需要更高水平的漂白化学品。
漂白工序将天然棉色素脱色，并且去掉在轧花、梳棉或精练中没有完全去掉的任何残留天然木质棉杂质组分。目前使用的主要方法是碱性过氧化氢漂白。许多情况下，尤其是不需要非常高的白度时，可以将漂白与精练结合起来。
预计可以将本发明的内切-β-1，4-葡聚糖酶或者内切β-1，4-葡聚糖酶制剂与其它一些酶活性结合起来，在大约90-100℃温度下，大约pH7-9的环境中，进行精练处理步骤，这样可代替或者补充高苛性剂的作用。
在工业清洗过程中，当要去除的杂物是纤维素类物质时，使用耐热纤维素酶能够使清洗过程更容易。实例是在食品/饲料工业中清洗超滤膜、管道等。
将耐热纤维素酶与纤维素填充剂一起添加至热挤压塑料和聚合物材料中，会使这些材料在自然界有更高的可降解性。
木质纤维素材料构成了农业和林业废物、以及在城市垃圾中占主要的废纸的一个大组成部分。这种废物通常被烧掉，从能量角度来看，这是对资源的极大浪费。已经进行了大量工作，目的在于发展一种高效、经济的方法，用于将这些生物质转化为糖，而糖可用来发酵生产诸如乙醇，以作为燃料。推荐用于将木质纤维素转化成糖的处理方法包括使用纤维素酶，但是所需的剂量极高，这样，出于经济考虑，在大规模工业生产中应用是不现实的。使用具有液化特性的耐热纤维素酶令这种生物转化过程更现实。高温下的处理能打开许多植物材料的细胞壁结构，使纤维素更易受到酶的攻击。
由各种谷物生产乙醇的工业化生产中，传统的加工过程包括在大约80-100℃用α-淀粉酶进行液化。在这个步骤加入纤维素酶能提高可发酵糖的产量。纤维素的预液化也使得在随后的加工中使用常规纤维素酶变得比较现实，因为此时水解速率比未预液化时要更高。
饲料生产中谷物、黑麦、大麦、玉米等的预消化是耐热纤维素酶的另一个潜在用途，这样是为了提高饲料在动物体内的消化性。
生产速溶咖啡时，咖啡的提取是在85-150℃下，在一套渗透柱中进行的。水由最浓缩的室逆流到刚装入了新鲜咖啡的室。含有新鲜咖啡的室的操作温度接近100℃。在这里加入嗜热纤维素酶将可提高柱性能，因为细胞壁结构被打开后，可溶物质更容易释放。
象咖啡提取一样，在从天然植物资源中提取油或香料/调味化合物的其它传统高温方法中加入纤维素酶能提高生产能力或产量。一个实例是提取棕榈油或棕榈果油，这就是一个水性高温过程。
在石油工业的钻油和通过聚合物驱油法提高油开采量(EOR)的过程中会使用一些水解胶状纤维素衍生物(CMC、HEC、HPC和常规使用的其它纤维素衍生物)水溶液，本发明纤维素酶也可用于降解这种衍生物水溶液，即使其粘度降低。
材料和方法保藏微生物激烈热球菌DSM3638，其含有本发明纤维素酶编码DNA序列。
大肠杆菌DSM11203，其含有在克隆载体pSJ1678中包含本发明纤维素分解酶编码DNA序列的质粒。
其它菌株大肠杆菌菌株大肠杆菌SJ2细胞(Diderichsen等，1990)制备用于电穿孔的细胞，使用BIO-RAD的Gene PulserTM基因脉冲电穿孔仪，依照厂商说明，进行转化。
枯草芽孢杆菌A164。此菌株是枯草芽孢杆菌ATCC 6051a的一种衍生物，它是孢子形成缺陷型，并且apr和npr基因已被破坏。这两个基因的破坏基本上按照Sonenshein等(1993)所述进行。感受态细胞的制备和转化按照Yasbin等(1975)所述进行。
质粒pBluescript II KS-(Stratagene，U.S.A.)和pSJ1678(参见WO94/19454)。
pUB110描述于McKenzie等(1986)和McKenzie等(1987)中的一种质粒。
pMUTIN-4-MCS该质粒可得自Laboratoire de GenetiqueMicrobienne，Institut National de la Recherche Agronomique，78352Jouy en Josas-CEDEX，France。
普通分子生物学方法DNA操作和转化采用标准的分子生物学方法(Sambrook等，1989；Ausubel，F.M.等，1995；Harwood，C.R.等，1990)进行。
DNA操作使用的酶依照厂商的说明使用。
编码本发明纤维素分解酶的DNA序列的分离编码本发明内切-β-1，4-葡聚糖酶的DNA序列可以从保藏微生物大肠杆菌DSM11203中，通过用本领域已知方法(Sambrook等，1989)提取质粒DNA获得。
内切-β-1，4-葡聚糖酶基因的克隆基因组DNA制备激烈热球菌DSM3638菌株在发酵罐内，用下述培养基，在90℃增殖14-24小时。
DSM3638菌株的培养基组成1.3g(NH4)2SO4，0.25g MgSO4·7H2O，30g NaCl，1.4g KH2PO4，50mg CaCl2，38mg FeSO4·7H2O，5μmol Na2SeO3·5H2O，10ml微量元素#，1g胰蛋白胨，1g酵母提取物，1g淀粉，1mg Resazurin，0.5g Cysteine·HCl，加水至1升。
#微量元素溶液0.1g MnCl2·4H2O，0.2g CoCl2·6H2O，0.1g NiCl2·6H2O，0.1gZnCl2，50mg CaCl2·2H2O，50mg CuSO4·2H2O，50mg Na2MoO4·2H2O，加水至1升。调节至pH6.2-6.5，充入N2/CO2(4∶1)气体。
收获细胞，用Pitcher等(1989)所述的方法分离基因组DNA。
基因组文库的构建用限制酶Sau3A部分消化基因组DNA，经0.7％琼脂糖凝胶电泳进行大小分级分离。电泳分离出2到7kb大小的片段，将它们转到DEAE-纤维素膜上(Dretzen，G.等，1981)。
将分离的DNA片段连接到经BamHI消化的pSJ1678质粒DNA上，用连接反应混合物转化大肠杆菌SJ2。
将细胞铺在含有0.1％CMC(羧甲基纤维素钠，Aqualon，France)和9μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上，达到500-1000个菌落形成单位/板，37℃培养过夜。
通过活性鉴定阳性克隆培养后，将菌落影印到一套LB+CAM琼脂平板上，继续在37℃培养约20小时。向影印平板倾注于适当缓冲液pH7中的含有0.1％CMC、1％HSB琼脂糖的顶层，65℃温育约20小时。用0.1％刚果红(Congo Red)(SIGMA，USA)水溶液染色，然后在2M NaCl中洗涤，鉴定出内切-β-1，4-葡聚糖酶阳性菌落。黄色环出现的位置即为内切-β-1，4-葡聚糖酶阳性克隆。
将来自酶阳性菌落的细胞在琼脂板上涂开以形成单菌落，对每一个鉴定到的产内切-β-1，4-葡聚糖酶的菌落都挑选出一个产酶单菌落。
阳性克隆的鉴定从划线平板得到内切-β-1，4-葡聚糖酶阳性克隆的单菌落，提取质粒。通过再转化大肠杆菌SJ2证实表现型，并通过限制酶切鉴定质粒。
内切-β-1，4-葡聚糖酶编码DNA的测序利用Taq脱氧末端循环测序试剂盒(PerkinElmer，USA)，荧光标记的终止核苷酸以及适当的寡核苷酸作引物，借助于引物步行法进行DNA测序，从而鉴定内切-β-1，4-葡聚糖酶基因。按照Devereux等(1984，核酸研究，12，387-395)所述进行序列数据分析。该序列相当于SEQ ID NO1所示DNA序列。
培养基TY和LB琼脂(如Ausubel等，1995所述)。
杂交条件(用于评价本发明DNA构建体的特性ii))确定核苷酸探针和同源DNA或RNA序列间杂交情况的合适检测条件包括将含有要杂交的DNA片段或RNA的滤膜预先在5×SSC(标准柠檬酸盐溶液)中浸泡10分钟，滤膜在5×SSC溶液(Sambrook等，1989)、5×Denhardt’s溶液(Sambrook等，1989)、0.5％SDS和变性的超声处理鲑精DNA100μg/ml(Sambrook等，1989)中预杂交，然后在含有随机引发(Feinberg等(1983)A.P.和Vogelstein B)的32P-dCTP标记(比活＞1×109cpm/μg)探针的相同溶液中于约45℃杂交12小时。然后将膜在2×SSC、0.5％SDS中洗涤30分钟两次，洗涤温度优选至少55℃，更优选至少60℃，更优选至少65℃，还要更优选至少70℃，特别是至少75℃。
用于杂交的核苷酸探针是可得自大肠杆菌DSM11203内质粒的DNA序列中的内切-β-1，4-葡聚糖酶编码部分。
免疫交叉反应性用于检测免疫交叉反应性的抗体可以利用纯化的内切-β-1，4-葡聚糖酶制备。更具体地说，针对本发明内切-β-1，4-葡聚糖酶的抗血清可以通过免疫兔子(或其他啮齿类动物)得到，步骤参照N.Axelsen等(1973)，或A.Johnstone等(1982)所述。纯化的免疫球蛋白可以从抗血清获得，例如通过盐析((NH4)2SO4)，然后透析和如在DEAE-Sephadex中进行离子交换层析。蛋白质的免疫化学鉴定可以利用Outcherlony双向扩散分析(Ouchterlony，1967)，交叉免疫电泳(N.Axelsen等，出处同前，第3和4章)或火箭免疫电泳(N.Axelsen等，第2章)进行。
构建表达载体下面对表达载体的构建过程进行描述。按类似方式构建实施例1中用于表达本发明内切-β-1，4-葡聚糖酶编码DNA序列的表达载体。
本说明书中包括了下述描述(斜体表示)，以阐述下文中进一步用于表达编码本发明纤维素分解酶之DNA序列(即SEQ ID NO1)的表达载体的构建过程pMUTIN4MCS是一个大肠杆菌质粒，它带有一个杂合启动子SPAC(Yansura等(1984))和处于该启动子转录调控下的lacZ基因。此外，该质粒含有在芽孢杆菌penP启动子调控下的lacI基因。因此，在枯草芽孢杆菌中时，lacI将被表达，并结合SPAC启动子-操纵子中的操纵子，这就会抑制下游序列的转录。启动子与Yansura等人所用的相同，但操纵子被修饰成了完善的回文结构。正好位于启动子-操纵子区下游的一个HindIII位点使得可以通过插入另一个基因(如本发明的内切-β-1，4-葡聚糖酶基因)而破坏lacZ基因。这样，内切葡聚糖酶的表达就处于SPAC启动子-操纵子的调控下。
在E.coli质粒pMUTIN4MCS中，以HindIII-SacI片段形式克隆了一个核糖体结合位点(RBS)和带有一个可用于克隆目的的SacII位点的信号肽。因此建立了如下核糖体结合位点和编码信号肽的DNA序列HindIIIRBS5′-AAGCTTGTTACACATTGAAAGGGGAGGAGAATCATGAAACAACAAAAACGGCTTT-ACGCCCGATTGCTGACGCTGTTATTTGCGCTCATCTTCTTGCTGCCTCATTCTGCAGCCG-NotI SacICGGCA GCGGCCGC GAGCTC-3′斜体书写的是编码芽孢杆菌属之种信号肽的DNA序列，它与编码蛋白质成熟部分的另一DNA序列融合时，能将该蛋白质引导到芽孢杆菌细胞外。
上述序列编码pMUTIN4MCS的HindIII位点，其后紧跟枯草芽孢杆菌RBS和编码芽孢杆菌信号肽的一段DNA序列，该DNA序列末端是一个人工引入的SacII位点，其后接着NotI和SacI限制酶切位点。通过电穿孔将质粒导入E.coli SJ2，铺在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上并在37℃培养细胞过夜，即在E.coli SJ2中引入了该质粒。得到的质粒命名为pMUTIN4-信号SacII-NotI。
耐热内切-β-1，4-葡聚糖酶基因以SacII-EagI消化的PCR片段进行克隆。
用Boehringer Mannheim的HiFi Expand PCR试剂盒获得该PCR片段，反应按照厂商建议进行。从质粒pDSM11201扩增该DNA片段。耐热内切-β-1，4-葡聚糖酶基因起初是从网球菌DSM6262克隆来的，并作为包含带有内切-β-1，4-葡聚糖酶基因的质粒的E.coli克隆(DSM11201)进行了保藏。所用的两个PCR引物如下所示#305195′-CATTCTGCAGCCGCGGCACAAACTCCAAAATACAAAGACGC-3′#306375′-CATGACACGGCCGATTATTTAAGCTCAATATCAAAATTTGAG-3′该PCR片段和pMUTIN4-信号SacII-NotI用SacII-EagI消化，连接在一起，通过电穿孔、铺在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上、并在37℃培养细胞过夜，从而转化E.coli SJ2。得到的SJ2中的质粒命名为pMB447A。
克隆融合了上述信号肽(在SacII-NotI/EagI位点)的内切-β-1，4-葡聚糖酶基因后，得到下面的在SPAC启动子-操纵子转录调控下的开放阅读框ATGAAACAACAAAAACGGCTTTACGCCCGATTGCTGACGCTGTTATTTGCGCTCATCTTCTTGCTGCCTCATTCTGCAGCCGCGGCACAAACTCCAAAATACAAAGACGCATTTATACTTAAAGCACCTTCCTCAGGCGATGTCACAACTAAAAATCTTCCTCTCACCTTAGAACTCAACTTTTGGAATATTGCAAACTATGAAGGAAATACATGGATGGCATTTTATAAAGAAGAAGATACTGTTGAATATTATGCCGACATAAAAAACATAGTACTTAAGGATAAAAATTCATGGGTACATGGATATCCTGAAGTCTACTATGGGTACAAACCATGGGCTGGCCATGGGAATTCCATTGAGAAATTAGCTCTTCCTAAAAAGGTATCAGAATTTCCAGACGTTCTCTTCAATCTAAAATACAACATATGGTACGAGAAGAATCTTCCTATAAATTTTGCTATGGAAACATGGATAACAAAAGAACCCTATCAGAAAACCGTTACTTCAGGGGATATAGAGATGATGGTATGGCTATATGCTAATAGACTTTCTCCTGCAGGGCGAAAGGTAGGAGAAGTAAAAATACCTATCATCCTAAACGGTAATCAAAAAGACATTATCTGGGAAGTATATCTTTCCCCTATGAGCTGGGACTACGTGGCCTATAAATCAAAAGAAAATATTCTTCAAGGACAGGTAAAAATACCAATAAATGAATTTTTGAAACACCTAAGAACAATTTTAGCCAACAATCCAAGTAGAATAACCCCAGAGAAATTTGATCAGATGTATGTGACAGTCTGGGAAATTGGAACAGAATTTGGCGATCCATATACTACTGAGGCAAAATTTGGATGGACTTTCTCAAATTTTGATATTGAGCTTAAATAA以及衍生的蛋白质MKQQKRLYARLLTLLFALIFLLPHSAAAAQTPKYKDAFILKAPSSGDVTTKNLPLTLELNFWNIANYEGNTWMAFYKEEDTVEYYADIKNIVLKDKNSWVHGYPEVYYGYKPWAGHGNSIEKLALPKKVSEFPDVLFNLKYNIWYEKNLPINFAMETWITKEPYQKTVTSGDIEMMVWLYANRLSPAGRKVGEVKIPIILNGNQKDIIWEVYLSPMSWDYVAYKSKENILQGQVKIPINEFLKHLRTILANNPSRITPEKFDQMYVTVWEIGTEFGDPYTTEAKFGWTFSNFDIELK.
为了能在枯草芽孢杆菌中增殖pMB447A，将该E.coli质粒与pUB110的衍生质粒(能在枯草芽孢杆菌中增殖的一种质粒)融合在pUB110的NciI位点用多接头引入SacI和NotI位点，得到的插入片段有如下序列CCCGGGAGCTCGCGGCCGCCCCGG下划线的是两个NciI位点，其间是SacI和EagI(NotI)位点。
随后用SacI和EagI消化该质粒，连接到经SacI和EagI消化过的pMB447A中，用连接产物转化枯草芽孢杆菌A164。建立克隆，并在LBPG-10 Kana AZCL-HE-纤维素平板上过夜生长。第二天，将平板在70℃保温5小时，蓝色环的出现指示耐热内切-β-1，4-葡聚糖酶的阳性表达。
分析从克隆MB505(DSM11903)分离得到的质粒DNA时，发现该质粒显然发生了重组，产生的质粒小于预料中的12.5kb大小。因此，看来质粒丢失了E.coli质粒pMUTIN4-信号SacII-NotI的大部分，得到大小约为5.5kb的一个质粒。
所得质粒具有如下基本特点质粒DSM11903上编码的内切-β-1，4-葡聚糖酶不需加入IPTG即可阳性表达，并且该质粒赋予对10μg/ml卡那霉素的抗性。在90℃进行CMCU检测(测定内切-β-1，4-葡聚糖酶活性)1CMCU单位定义为，在下述标准条件(90℃下的CMC测定)下，每分钟释放相当于1mmol葡萄糖所需的酶量将酶在于0.1M巴比妥酸钠缓冲液pH8.5中的0.75％CMC(7L，来自Hercules)溶液中保温20分钟。保温后，使用PHBAH(SIGMA H-988253H7704(对羟基苯甲酸酰肼))测定还原性末端基团的增加量，并利用葡萄糖标准，计算每分钟形成的相当于葡萄糖的末端基团(Lever，M.(1972)用于比色测定碳水化合物的一种新反应，分析生物化学，47卷，273-279页)。对硝基苯基-β-D-纤维素二糖苷检测一个PNPU单位定义为在标准检测条件(参见下述)下，每分钟从对硝基苯基-β-D-纤维素二糖苷(Sigma)释放1mmol对硝基苯酚所需的酶量。
方法稳态动力学，直接在405nm检测黄色产物对硝基苯酚。活性用吸光度的增加衡量，曲线的线性部分用于确定斜率(AU/sec)。活性的计算使用对硝基苯酚在磷酸盐缓冲液pH7.5中的吸光度在1cm比色杯中的吸光度，在405nm处1mM为0.018(在420nm处为0.014)。
检测条件475ml于0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.5)中的10mM对硝基苯基-β-D-纤维素二糖苷；25ml酶溶液步骤用恒温控制在70℃的HP 8452A二极管组分光光度计，在1cm厚的0.75ml比色杯中进行测量。
测量300秒内在405nm处的吸光度，每20秒测一次。
以下非限制性实施例用于阐明本发明。
实施例1A.从激烈热球菌DSM3638克隆内切-β-1，4-葡聚糖酶如“材料和方法”的描述，在大肠杆菌中构建并筛选来源于激烈热球菌DSM3638的一个文库。分离到的一个阳性转化子是DSM11203，它带有质粒pSJ1678，其中含有编码本发明纤维素分解酶的DNA序列，即SEQ ID NO1。
B.从保藏的E.coli克隆DSM 11203中克隆激烈热球菌内切-β-1，4-葡聚糖酶基因依据SEQ ID NO1 DNA序列，设计一套PCR引物。这些引物设计成能获得编码相应于本发明内切-β-1，4-葡聚糖酶最可能的成熟形式的DNA序列片段。以SacII-EagI片段的形式，将该片段克隆至上述载体pMB505内。
利用Expand High Fidelity PCR体系(#1732650，BoehringerMannheim，GmbH)，进行PCR。利用缓冲液2体系，以及四种dNTP(dATP、dCTP、dGTP和dTTP)各200μM、0.75μl酶混合液和下述PCR引物各250nM进行反应#1058475＇-CAT CAT TCT GCA GCC GCG GCA ATA TAT TTT GTA GAA AAG TAT CATACC-3＇#1058715＇-GCA CAA GCT TGC GGC CGC TTA GGA AAT AAG AGG TCT ATC TAG-3＇在50μl体积内，利用得自大肠杆菌DSM 11203的质粒100-200ng，进行PCR反应。PCR反应在Landgraf热循环仪(HansLandgraf，GmbH)内进行温度循环。采用下述温度循环方案*94℃ 60秒，1个循环；*(94℃ 15秒，60℃ 60秒，72℃ 60秒)10个循环；*(94℃ 15秒，60℃ 30秒，72℃ 60秒，在延伸步骤每循环增加20秒)20个循环；*72℃ 300秒，1个循环。
将从一种温度转换至另一温度所用时间设置为1秒[对于此热循环仪，这意味着是尽可能地快(大约10秒)]。
循环结束后，利用Qiagen PCR纯化试剂盒，按照生产商说明(Qiagen，GmbH)，纯化该50μl反应物。
纯化后，用限制酶SacII和EagI切割该PCR片段和质粒pMB505(利用Qiagen的质粒制备试剂盒#27106，从枯草芽孢杆菌克隆DSM11903内获得)。在染有溴乙锭的0.7％琼脂糖凝胶上对已消化的DNA跑电泳，从凝胶上切下所需的DNA片段，利用Qiagen试剂盒#28706，按照生产商建议进行纯化。
将DNA从纯化柱上洗脱下来之后，在20μl的体积内，利用1单位Boehringer Mannheim(GmbH)的T4 DNA连接酶，在其合适缓冲液内，于16℃温育连接混合物过夜，使部分PCR片段(大约100ng)和部分载体(大约400ng)连接起来。利用一半连接产物转化枯草芽孢杆菌A164。转化后，将细胞铺在含有10μg/ml卡那霉素的LBPG-AZCL-HE纤维素平板上，于37℃培养过夜。选出单个菌落，在新鲜平板上划线培养，并于37℃培养过夜。将数个克隆的单菌落在10mlTY中于37℃培养过夜，分离出质粒，并利用不同特异性的酶，通过限制酶消化法进行分析。
从过夜液体培养物中取40μl培养液，转移到LBPG-AZCL-HE纤维素平板上所挖的孔内。然后将平板置于80℃温育6小时，孔周围出现清亮蓝圈，表明在枯草芽孢杆菌内阳性表达了DSM 3638的激烈热球菌内切-β-1，4-葡聚糖酶和来自DSM11203的亚克隆基因。
这样的一个表达克隆被称作MB544。在带有2块挡板的500ml摇瓶内，100ml BPX培养基中，于37℃、300rpm培养MB544 5天。利用此培养液纯化表达得到的内切-β-1，4-葡聚糖酶。
培养基LB琼脂(如Ausubel，F.M.等(编辑)“现代分子生物学手册”，JohnWileySons，1995描述)。
LBPG是补充了0.5％葡萄糖和0.05M磷酸钾(pH7.0)的LB琼脂。
AZCL-HE-纤维素加入LBPG琼脂至1％。AZCL-HE纤维素来自Megazyme，Australia。
BPX培养基描述于US5,695,976和相应的EP-B-0 506 780中。
实施例2表达的激烈热球菌内切-β-1，4-葡聚糖酶克隆的纯化和鉴定得到含有实施例1所述克隆的芽孢杆菌3600ml摇瓶培养液，用HCl将3200ml培养液调节到pH5.5，然后，在室温并搅拌下，用150ml阳离子凝聚剂进行处理，再用300ml 0.1％阴离子凝聚剂溶液进行处理。利用Sorval RC 3B，在10,000rpm离心30分钟，分离凝聚过的材料。利用Whatman F号玻璃滤器澄清上清液。得到总量3400ml，其活性为8CMCU/ml(在90℃、pH8.5时测得的活性)。
将液体上样到已平衡于50mM乙酸盐缓冲液(pH5.5)的3000mlDEAE A-50 Sephadex中。未结合的材料总共含有18000CMCU。
在截留分子量为10kDa的过滤器中，将未结合材料浓缩至1.4升。然后，将用乙酸铵调至1M的400ml液体2份上样到已用1M乙酸铵缓冲液(pH6.5)平衡了的400ml Butyl Toyopearl柱中，用去离子水洗脱发生结合的酶。总共得到17000 CMCU单位。
用甘油将4000 CMCU单位制成终浓度为40％，用于应用试验。
B.鉴定本发明内切-β-1，4-葡聚糖酶在280nm的摩尔消光系数为84350，表观分子量(MW)为34kDa，pI为4.8。
纯内切-β-1，4-葡聚糖酶对对硝基苯基-β-D-纤维素二糖苷(Sigma)、CMC、HE纤维素(Megazyme)和酸溶胀的纤维素均有活性。内切-β-1，4-葡聚糖酶的温度-活性关系在pH7.5的CMCU检测中，将内切-β-1，4-葡聚糖酶在0.1M Mops缓冲液中，于不同温度下保温，保温20分钟后如上所述检测活性。超过100℃的保温没有做，在该温度得到的还原性糖量最高，用于计算低于该温度时的相对活性。温度 相对活性100℃96％90℃ 100％80℃ 65％70℃ 32％60℃ 13％pH-活性曲线在90℃的CMCU检测中，将内切-β-1，4-葡聚糖酶用pH4.5到11的不同缓冲液保温，保温20分钟后如上所述测定活性。
缓冲液pH4.5、5.0和5.50.1M 乙酸钠pH6.00.1M Na-MESpH6.5、7.0和7.50.1M Na-MOPSpH8.0和8.50.1M EPPSpH9.0、9.5、10.0、10.5和11.00.1M甘氨酸钠测得pH5.0到9.5的间隔内相对活性高于50％。
实施例3在浸轧-蒸气机系统中，用本发明内切-β-1，4-葡聚糖酶对棉针织物进行生物抛光实验方法织物和溶液制备将漂白过的针织棉毛布测试织物#460(来自TestFabrics公司，Middlesex，NJ)剪成大约20×30cm的布片，在人工气象室(相对湿度65±2％，温度70±3°F/21+2℃)内调湿至少24小时。称得所有布片均为11.8-12.6g。用缓冲液和酶制备溶液，使含有0,2CMCU/ml。将1.5g三(羟甲基)氨基甲烷溶于500ml去离子水中，并用HCl调节pH至pH8.9和7.3，制得缓冲液。采用按照实施例1和2制得的内切-β-1，4-葡聚糖酶(MB473，#9730)。
浸轧(padding)在Mathis浸轧-蒸汽机组(Werner Mathis USAInc.Concord，NC)内，利用酶溶液对布块进行浸轧。利用浸轧之前和之后的织物重量计算纤维吸液率，得到纤维吸液率为100±5％。在每种pH溶液中对两种布块进行浸轧。每一pH下，纤维素酶的浓度为0和2CMCU/ml。
保温将Mathis浸轧-蒸汽机组预热至90℃，相对湿度(RH)为100％。用溶液浸轧后，人为将布块挂在蒸汽机室内。打开浸轧-蒸汽机组的舱门会使温度和相对湿度降低。然而，2分钟内即可达到原来的温度和相对湿度。所有布片处理相同时间-90分钟。
漂洗从蒸汽机室内取出布片后，在去离子水中漂洗5分钟。然后风干，在人工气象室平衡至少24小时后再用于评估。
评估依照ASTM D 4970-89，由起球指数测得抗起球性进行评估。采用Nu-Martindale Abrasion and Pilling Tester(James H.Heal& Co.Ltd.，UK)。记录125转后的起球指数。与标准相片相比，将起球指数分成1～5级，1级表示严重起球，5级表示不起球。
按照ASTM D3786-87方法测量顶破强力损失。采用Mullenburst Tester(C型)(B.F.Perkins，Chicopee，MA)进行。
结果与结论测量起球指数2次，顶破强力至少7次。数据示于表1中。与在相同pH的无酶处理的对照相比，对经内切-β-1，4-葡聚糖酶处理过的所有布片均未检测到统计学上显著的强力损失。在pH7.3，经0和2CMCU/g织物处理过的布片，在125转后的起球指数分别为3和4。在pH8.9，经0和2 CMCU/g织物处理过的布片，在125转后的起球指数分别为2.5和4。这些结果显示存在明显差异。与经0CMCU/g织物处理过的织物相比，经内切-β-1，4-葡聚糖酶处理过的织物手感和外观均要更好一些。
可以得出这样一个结论在pH7.3至8.9，90℃的浸轧-蒸汽机组内，本发明的第12家族内切-β-1，4-葡聚糖酶显示出良好的生物抛光效果，而织物强力损失很小。能够提高起球指数的内切-β-1，4-葡聚糖酶的量可以少至2CMCU/g织物。也能够获得更好的外观和织物手感效果。
表1
STDEV标准误差参考文献N.Axelsen等。定量免疫电泳手册，Blackwell Scientific Publications，1973，第23章。A.Johnstone和R.Thorpe，实用免疫化学，Blackwell ScintificPublications，1982(更具体是第27-31页)。Diderichsen，B.，Wedsted，U.，Hedegaard，L.，Jensen，B.R.，Sjoholm，C.(1990)编码α-乙酰乳酸脱羧酶，一种来自短小芽孢杆菌的外切酶的aldB的克隆，细菌学杂志，172，4315-4321。Dretzen，G.，Bellard，M.，Sassone-Corsi，P.，Chambon，P.(1981)一种从琼脂糖和丙烯酰胺凝胶上回收DNA片段的可信方法。分析生物化学，112，295-298。Feinberg，A.P.和Vogelstein，B.(1983)分析生物化学1326-13。Maidak等(1996)核糖体数据库计划。核酸研究，2482-85。Zillig(1992)热球菌目。《原核生物》，Albert Barlows等(编)；Huber和Stetter(1992)热变形菌目。《原核生物》，Albert Barlows等(编)。Halio等(1996)编码来自超嗜热古生物激烈热球菌的一种新型胞内蛋白酶的基因(pfpi)序列、在大肠杆菌内的表达及分析。细菌学杂志，1782605-2612；Kengen等(1996)超嗜热生物的糖类代谢。FEMS微生物学综述，18119-137。Henrissat，B.1991.依据氨基酸序列相似性对糖基水解酶进行分类。生物化学杂志，280309-316。Henrissat，B.，和A.Bairoch.1993.依据氨基酸序列相似性进行的糖基水解酶分类中的新家族。生物化学杂志，293781-788。Kengen(1993)来自超嗜热古生物激烈热球菌的极端耐热的β-葡糖苷酶的纯化和鉴定。欧洲生物化学杂志，213305-312。Bauer等(1996)来自超嗜热古生物-激烈热球菌的一种β-葡糖苷酶与一种β-甘露糖苷酶的比较。生物化学杂志，27123749-23755。Bragger等(1989)来自极端嗜热的古细菌和真细菌的非常稳定的酶。应用环境微生物学，31556-561。Vincken，J.P.，Beldman，G.，和Voragen，A.G.J.内切-β-1，4-葡聚糖酶的底物特异性-由何确定木糖葡聚糖酶活性。糖类研究，298(4)299-310，1997。Sambrook等(1989)分子克隆，实验室手册，Cold Spring Harborlab.，Cold Spring Harbor，NY。Ausubel，F.M.等(编)“现代分子生物学方法”，John Wiley和Sons，1995。Harwood，C.R.，和Cutting，S.M.(编)“芽孢杆菌分子生物学方法”，John Wiley和Sons，1990。O.Ouchterlony，实验免疫学手册(D.M.Weir，编)，Blackwellscientific Publications，1967，655-706页。Pitcher，D.G.，Saunders，N.A.，Owen，R.J.(1989).用硫氰酸胍快速提取细菌基因组DNA。应用微生物学通讯，8151-156。A.L.Sonenshein，J.A.Hoch和Richard Losick编(1993)枯草芽孢杆菌和其它革兰氏阳性细菌，American Society for microbiology，618页。Yasbin，R.E.，Wilson，G.A.和Young，F.E.(1975)枯草芽孢杆菌溶源性菌株内的转化和转染敏感性细菌中原噬菌体选择性诱导的证据。细菌学杂志，121296-304。Mckenzie，T.，Hoshino，T.，Tanaka，T和Sueoka，N。pUB110的核苷酸序列；与复制及其调控有关的一些突出特性。质粒，15(2)，93-103(1986)。McKenzie，T.，Hoshino，T.，Tanaka，T.和Sueoka，N.校正·pUB110核苷酸序列和功能性图谱的修正。质粒，17(1)，83-85(1987)。Yansura等(1984)大肠杆菌lac阻遏子和操作子控制枯草芽孢杆菌内基因表达的用途，PNAS，181卷，439-443页。
序列表(1)一般资料(i)申请人(A)姓名Novo Nordisk A/S(B)街道Novo Alle(C)城市Bagsvaerd(E)国家丹麦(F)邮政编码(ZIP)DK-2880(G)电话+45 44 44 88 88(H)传真+45 44 49 32 56(ii)发明题目一种新型内切葡聚糖酶(iii)序列数2(iv)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC可兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release #1.0，Version #1.30(EPO)(2)SEQ ID NO1的资料(i)序列特征(A)长度960个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO1ATGAGCAAGA AAAAGTTCGT CATCGTATCT ATCTTAACAA TCCTTTTAGT ACAGGCAATA 60TATTTTGTAG AAAAGTATCA TACCTCTGAG GACAAGTCAA CTTCAAATAC CTCATCTACA 120CCACCCCAAA CAACACTTTC CACTACCAAG GTTCTCAAGA TTAGATACCC TGATGACGGT 180GAGTGGCCAG GAGCTCCTAT TGATAAGGAT GGTGATGGGA ACCCAGAATT CTACATTGAA 240ATAAACCTAT GGAACATTCT TAATGCTACT GGATTTGCTG AGATGACGTA CAATTTAACC 300AGCGGCGTCC TTCACTACGT CCAACAACTT GACAACATTG TCTTGAGGGA TAGAAGTAAT 360TGGGTGCATG GATACCCCGA AATATTCTAT GGAAACAAGC CATGGAATGC AAACTACGCA 420ACTGATGGCC CAATACCATT ACCCAGTAAA GTTTCAAACC TAACAGACTT CTATCTAACA 480ATCTCCTATA AACTTGAGCC CAAGAACGGC CTGCCAATTA ACTTCGCAAT AGAATCCTGG 540TTAACGAGAG AAGCTTGGAG AACAACAGGA ATTAACAGCG ATGAGCAAGA AGTAATGATA 600TGGATTTACT ATGACGGATT ACAACCGGCT GGCTCCAAAG TTAAGGAGAT TGTAGTCCCA 660ATAATAGTTA ACGGAACACC AGTAAATGCT ACATTTGAAG TATGGAAGGC AAACATTGGT 720TGGGAGTATG TTGCATTTAG AATAAAGACC CCAATCAAAG AGGGAACAGT GACAATTCCA 780TACGGAGCAT TTATAAGTGT TGCAGCCAAC ATTTCAAGCT TACCAAATTA CACAGAACTT 840TACTTAGAGG ACGTGGAGAT TGGAACTGAG TTTGGAACGC CAAGCACTAC CTCCGCCCAC 900CTAGAGTGGT GGATCACAAA CATAACACTA ACTCCTCTAG ATAGACCTCT TATTTCCTAA 960(2)SEQ ID NO2的资料(i)序列特征(A)长度319个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Ser Lys Lys Lys Phe Val Ile Val Ser Ile Leu Thr Ile Leu Leu1 5 10 15Val Gln Ala Ile Tyr Phe Val Glu Lys Tyr His Thr Ser Glu Asp Lys20 25 30Ser Thr Ser Asn Thr Ser Ser Thr Pro Pro Gln Thr Thr Leu Ser Thr35 40 45Thr Lys Val Leu Lys Ile Arg Tyr Pro Asp Asp Gly Glu Trp Pro Gly50 55 60Ala Pro Ile Asp Lys Asp Gly Asp Gly Asn Pro Glu Phe Tyr Ile Glu65 70 75 80Ile Asn Leu Trp Asn Ile Leu Asn Ala Thr Gly Phe Ala Glu Met Thr85 90 95Tyr Asn Leu Thr Ser Gly Val Leu His Tyr Val Gln Gln Leu Asp Asn100 105 110Ile Val Leu Arg Asp Arg Ser Asn Trp Val His Gly Tyr Pro Glu Ile115 120 125Phe Tyr Gly Asn Lys Pro Trp Asn Ala Asn Tyr Ala Thr Asp Gly Pro130 135 140Ile Pro Leu Pro Ser Lys Val Ser Asn Leu Thr Asp Phe Tyr Leu Thr145 150 155 160Ile Ser Tyr Lys Leu Glu Pro Lys Asn Gly Leu Pro Ile Asn Phe Ala165 170 175Ile Glu Ser Trp Leu Thr Arg Glu Ala Trp Arg Thr Thr Gly Ile Asn180 185 190Ser Asp Glu Gln Glu Val Met Ile Trp Ile Tyr Tyr Asp Gly Leu Gln195 200 205Pro Ala Gly Ser Lys Val Lys Glu Ile Val Val Pro Ile Ile Val Asn210 215 220Gly Thr Pro Val Asn Ala Thr Phe Glu Val Trp Lys Ala Asn Ile Gly225 230 235 240Trp Glu Tyr Val Ala Phe Arg Ile Lys Thr Pro Ile Lys Glu Gly Thr245 250 255Val Thr Ile Pro Tyr Gly Ala Phe Ile Ser Val Ala Ala Asn Ile Ser260 265 270Ser Leu Pro Asn Tyr Thr Glu Leu Tyr Leu Glu Asp Val Glu Ile Gly275 280 285Thr Glu Phe Gly Thr Pro Ser Thr Thr Ser Ala His Leu Glu Trp Trp290 295 300Ile Thr Asn Ile Thr Leu Thr Pro Leu Asp Arg Pro Leu Ile Ser305 310 31权利要求
1.一种有内切-β-1，4-葡聚糖酶活性的酶制剂，它在高于90℃的温度下有最佳活性。
2.权利要求1的制剂，其中所述酶制剂可得自属于古生物的一个菌株，或是它的内源物。
3.权利要求1或2的制剂，其中所述酶制剂可得自Euryarchaeota门的一个菌株，或是它的内源物。
4.权利要求3的制剂，其中所述菌株属于热球菌亚门。
5.权利要求4的制剂，其中所述菌株属于热球菌属，优选属于激烈热球菌，特别是属于激烈热球菌DSM3638。
6.权利要求1至5中任何一项的制剂，它在约pH4-11有活性，优选在大约pH5.5-10有活性。
7.权利要求1至6中任何一项的制剂，其基本上由一种酶组成，所述酶有内切-β-1，4-葡聚糖酶活性，且属于糖基水解酶第12家族。
8.一种DNA构建体，它含有编码有内切-β-1，4-葡聚糖酶活性的一种酶的一段DNA序列，该酶最佳活性在90℃以上，优选在95℃以上，更优选在100℃以上，所述DNA序列含有a)相应于SEQ ID NO1的DNA序列或者可得自大肠杆菌DSM11203内质粒的DNA序列中内切-β-1，4-葡聚糖酶编码部分的DNA序列，或者b)相应于SEQ ID NO1的DNA序列或者可得自大肠杆菌DSM11203内质粒的DNA序列中内切-β-1，4-葡聚糖酶编码部分的DNA序列的相似物，该相似物i)与相应于SEQ ID NO1 DNA序列或者可得自大肠杆菌DSM11203内质粒的DNA序列中内切-β-1，4-葡聚糖酶编码部分的DNA序列同源，优选至少40％同源，或ii)与相应于SEQ ID NO1 DNA序列或者可得自大肠杆菌DSM11203内质粒的DNA序列中内切-β-1，4-葡聚糖酶编码部分的DNA序列可杂交，或者iii)编码一种多肽，该多肽与SEQ ID NO2所示的多肽或者由一种DNA序列编码的多肽同源，优选至少45％同源，所述DNA序列包含相应于SEQ ID NO1 DNA序列或者可得自大肠杆菌DSM11203内质粒的DNA序列中内切-β-1，4-葡聚糖酶编码部分的DNA序列，或者iv)编码一种多肽，该多肽与针对纯化的内切-β-1，4-葡聚糖酶产生的抗体具有免疫反应性，所述内切-β-1，4-葡聚糖酶是由相应于SEQ IDNO1的DNA序列或者可得自大肠杆菌DSM11203内质粒的DNA序列中内切-β-1，4-葡聚糖酶编码部分的DNA序列编码的。
9.权利要求8的DNA构建体，其中所述DNA序列分离自一种古生物，或者是在一种古生物的DNA文库基础上产生的。
10.权利要求9的DNA构建体，其中的DNA序列分离自一个菌株，或者是在一个菌株的DNA文库基础上产生的，该菌株属于Euryarchaeota门，优选属于热球菌亚门，更优选属于热球菌属，甚至更优选属于激烈热球菌种，尤其是激烈热球菌DSM3638。
11.权利要求8-10中任何一项的DNA构建体，其中所述DNA序列分离自大肠杆菌DSM11203。
12.权利要求8-11中任何一项的DNA构建体，其中还含有编码纤维素结合结构域(CBD)的DNA序列。
13.权利要求12的DNA构建体，其中还含有编码纤维素结合结构域(CBD)的DNA序列，该纤维素结合结构域和由该DNA构建体之DNA序列所编码的酶的酶核心(催化活性结构域)被可操纵地连接在一起。
14.一种含有权利要求8-13中任何一项的DNA构建体的重组表达载体。
15.一种含有权利要求8-13中任何一项的DNA构建体或权利要求14的重组表达载体的细胞。
16.权利要求15的细胞，它是原核细胞，特别是细菌细胞；或者是真核细胞，特别是丝状真菌细胞；或者是编码具有内切-β-1，4-葡聚糖酶活性之酶的DNA序列最初来源的内源细胞。
17.权利要求16的细胞，其中所述细菌细胞属于芽孢杆菌的一个菌株，优选属于枯草芽孢杆菌或者迟缓芽孢杆菌的一个菌株；所述真菌细胞属于选自曲霉属各种和镰孢属各种的一个菌株。
18.权利要求16的细胞，其中所述细胞属于热球菌属的一个菌株，优选激烈热球菌DSM3638。
19.权利要求15的细胞，其中所述细胞属于酵母属的一个菌株，优选酿酒酵母的一个菌株。
20.产生有内切-β-1，4-葡聚糖酶活性、且最佳活性在90℃以上、优选95℃以上、更优选100℃以上的一种酶的方法，该方法包括在允许该酶产生的条件下培养权利要求15-19中任何一项所述细胞，并从培养物中回收该酶。
21.一种有内切-β-1，4-葡聚糖酶活性的分离酶，其中该酶i)不含同源杂质，并且ii)是依照权利要求20的方法产生的。
22.一种有内切-β-1，4-葡聚糖酶活性、且最佳活性在90℃以上、优选95℃以上、更优选100℃以上的酶，该酶a)由权利要求8-13中任何一项的DNA构建体编码，或b)通过权利要求20的方法产生，或c)是激烈热球菌DSM3638产生的一种多肽，可以由SEQ ID NO1的DNA序列或者可得自大肠杆菌DSM11203内质粒的DNA序列中内切-β-1，4-葡聚糖酶编码部分编码，或d)与针对纯化的内切-β-1，4-葡聚糖酶产生的抗体有免疫反应性，该纯化的内切-β-1，4-葡聚糖酶由相应于SEQ ID NO1 DNA序列或者可得自大肠杆菌DSM11203内质粒的DNA序列中内切-β-1，4-葡聚糖酶编码部分的DNA序列所编码。
23.权利要求21或者22的酶，其属于糖基水解酶第12家族。
24.一种富含权利要求21-23中任何一项的酶的酶制剂。
25.权利要求1-7和24中任何一项的制剂，其中还含有选自下述的一或多种酶甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、果胶乙酰酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、鼠李半乳糖醛酸酶、果胶裂解酶、果胶酸盐裂解酶、果胶甲酯酶、内切-β-1，4-葡聚糖酶、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、角质酶、过氧化物酶、漆酶、纤维素二糖水解酶和转谷氨酰胺酶。
26.大肠杆菌DSM11203菌株基本纯的分离的生物学培养物。
27.权利要求21-23中任何一项的酶或者权利要求1-7、24和25中任何一项的酶制剂在纺织业中，用于改善纤维素纤维或织物品性，或者提供粗斜纹布的石洗外观；或者用于纤维素纤维加工业；或者用于工业清洁工序；或者用于热挤压聚合物材料；或者用于将生物质转化成糖；或者用于生产醇；或者用于预消化例如饲料生产中所用的谷物；或者用于生产速溶咖啡或相似提取过程；或者在油业中用于降解钻油或通过聚合物驱油法提高油开采量中所用水解胶状纤维素衍生物水溶液中的用途。
全文摘要
在至少90℃的温度下具有内切－β－1,4－葡聚糖酶最佳酶活性的一种酶制剂可得自属于古生物的一个菌株,或者是其内源物,如克隆自激烈热球菌DSM3638、并且可由SEQ ID NO:1 DNA序列编码的一种内切－β－1,4－葡聚糖酶。
文档编号C12N9/42GK1246149SQ9880218
公开日2000年3月1日 申请日期1998年1月30日 优先权日1997年1月31日
发明者L·N·安德森, M·E·布约恩瓦德, M·舒莱恩 申请人:诺沃挪第克公司