新的内切葡聚糖酶的制作方法

专利名称：：新的内切葡聚糖酶的制作方法新的内切葡聚糖酶本发明涉及新的酶制剂，该酶制剂包含显示内切葡聚糖蘇活性的酶，其在工业应用(如洗衣组合物、生物抛光(biopolishing)新制造的织物、提供纤维素织物或衣物磨损的外观和处理纸浆)中性能良好。此外，本发明涉及编码这种酶的DNA构建体、提供编码这种酶的基因的方法、产生所述酶的方法、包含这种酶的酶制剂以及这些酶在许多工业应用中的用途。
背景技术：
：纤维素酶或溶纤酶是涉及纤维素水解的酶。在天然纤维素的水解中，已知涉及三种主要类型的纤维素酶，即纤维二糖水解酶(l，4-P-D-葡聚糖纤維二糖水)^EC3.2.1.91)、内切-P-1，4-葡聚糖酶(内切1，4-p-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶EC3.2.1.4)和p-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)。纤维素酶由大量徵生物(包括真菌，放线菌，粘细菌和真细菌)合成，也由植物合成。已筌别了各种特异性的特定的内切葡聚糖酶。溶纤酶的一种十分重要的工业用途是用来处理纤维素织物原料或织物，例如作为洗涤剂组合物或织物软化剂组合物中的组分、用于生物-抛光新织物(衣物修饰)和用于获得含纤维素织物(尤其斜紋粗棉布)的"石洗(stone-washing)"外乂見。在例如下列文献中提出了几种这样的处理方法GB-A-l368599，EP+0307564和EP-A-0435876，W091/172431W091/10732，W091/17244，PCT/DK95/000108和PCT歸5/00132。溶纤酶的另一个重要的工业用途是用于纸装处理，例如为了改善导液(drainage)或使再利用紙脱墨。尤其是，对所论及的工业用途而言，内切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)构成了有意义的一组水解酶。内切葡聚糖酶催化下列键的内切水解纤维素、纤維素衍生物(如氛基甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣淀粉中的1,4-p-D-酉t^键；混合的p-1，3葡聚糖(如谷类p-D-葡聚糖或&瞎葡聚糖)和其它含纤维素部分的植物材料中的P-1，4键。公认的名称是内切-l，4-(3-D-葡聚糖轩葡聚糖基(glucano)水解酶，本发明中使用缩写术语内切葡聚糖酶(endoglucanase).可以参见T.-M.Enveri，"徵生物纤维素酶"W.M.Fogarty，微生物酶和生物技术，应用科学出版社，p.183-224(1983);酶学方法，U988)Vo1.160，p.200-391(Wood,W.A.和KeUogg，S.T.编);B"uin,P.,"纤維素降解的分子生物学，徵生物学年评(1990),Vol.44,pp.219-248;BSguin，P.和Aubert,J-P.,"纤维素的生物降解"，FEMS微生物学回顾13(1994)p.25-58;Henrissat，B.，"纤维素酶和它们与纤维素的相互作用"，纤维素(1994),Vol.1，pp.169-196。许多出版物中已描述了真菌内切葡聚糖酶，特别是来源于例如尖镰孢、7>/c/ofl^/7areese/,7y/c/oflte/7K3/0/g/^rac力/afw/w，棘抱曲審，yVeoca/〃啦"/f和例如/Vixwyces、腐质霉属，毁丝霉属，fe"r/c咖，青霉属，耙菌属，鬼伞属的种的那些内切葡聚糖酶。例如，真菌内切葡聚糖酶已由下列文献描述SheppardP.O.,等，用保守纤维素酶家族-特异性的序列从尖镰孢克隆纤维素酶同系物cDNA，基因，(1994)，vol.15，pp.163-167;SaLoheimo，A.，等，"在酵母中表达的7Wc力Of/er鹏reese/的新小内切葡聚糖蘇基因egl5"，分子微生物学，(1994)voi.13(2)，pp.219-228;vanArsdell,J.N.等，(1987)，7Wc力Of/ei7zareese/在哞酒糖酵母内切葡聚糖酶1的克隆，特征确定和表达，生物/技术5:60-64;PeritUl'd，M.等，(1986)，"7Wc/7orferfflareese;'纤维素酶基因之间的同源性内切葡聚糖酶I基因的完整的核苷蔽亭列"，基因45:253263;Saloheirao，M.等，(1988)，"EGIII，一种新的7Wc力oflfer则ree"/内切葡聚糖酶基因和蘇两者的筌定"，基因63:1121;Gonzales,R.等-,"7Wc力oc/"側/0/7^76/\3<//"卿e^7/基因的克隆、序列分析和酵母表达"，应用微生物学和生物技术，(1992)，vol.38，pp.370-375;Ooi,T.等棘孢曲霉纤维素酶(FI-CMCase)cDNA的克J^序列分析"，Curr.Genet.,(1990),vol.18，pp.217222;Ooi，T.等，编码棘孢曲霉纤维素酶(FI-CMCase)的基因的完整的核芬酸序列"，核酸研究，(1990)'vol.18，No.19，P.5884;Xue，G.等，"多种厌氧瘤胃真菌Neocalliraastixpatriciarum纤维素蘇cDNA在大肠軒菌中的克J^P表达"，J.Gen.Microbiol.,(1992),vol.138，pp.1413-1420;XueG.等，"编码具有高内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和木聚糖酶活性的三个多功能催化区的/Veoca〃/啦sf"/af厂/c/a/""/77的新的多糖类水解酵cDNA(celD)",J.Gen.Microbiol.,(1992),vol.138，pp.2397—2403;Zhou,L.等，"来源于厌氧真菌NeocaUimastixpatriciarum的编码模式家族内切葡聚糖酶的无内含子celB"，生物讦匕学杂志，(1994)，vol.297，pp.359364;Dalb小ge，H.和Heldt-Hansen,H.P.，"有^L^达克隆真菌酶基因的新方法"，Mol.Gen.Genet.，(1994)，vol.243,pp.253260;Ali，B.R.S.等，"厌氧真菌Piromyces纤维素酶和半纤维素酶构成多蛋白纤维素-结合复合物和由多基因族编码"，FEMS徵生物学通讯，(1995),vol.125，No，1，pp.15'-21。此外，日本DNA数据库(/>众可从Internet上获得的DDBJ数据库)包括从徵紫青霉克隆的编码内切葡聚糖酵的两个DNA序列(分别由A.Koch和G.Mernitz克隆)和从灰腐质霉变种/7e/V77oA/ea克隆的编码内切葡聚糖酶DNA序列(由T.Uozumi克^0。两种他cr(9/7力o顶/7a/^aseo//^的内切葡聚糖酶已被克l^测序，参见Wang,H.Y.和Jones,R.W.:"植物致病真菌ytfec/"o//;o/ff//7a/^aseo///^的内切葡聚糖S^编码基因的克隆，特征确定和功能性表达"，基因，158:125128，1995;和Wang，H.Y.和Jones,R.W.:"从植物致病真菌他"0/7力0//7/加pA^ec^/'/w克隆的单一内切葡聚糖S^编码基因"，应用和环境微生物学，61:2004-2006,1995。这些内切葡聚糖酶中的一个显示与真菌7y/c/Oflter啦re"e/egl3内切葡聚糖酶的高同源性，另、一个显示与微生物植物病原体/^ewd。/77(m3Ssoh/7acea,鹏egll的同源性，说明两种内切葡聚糖酶都属于糖基水解酶5族(B.Henrissat，生物化学J280:3(19-316(1991))。Scha画ckerF.等(1995)公开了二态真菌玉米黑粉菌的纤维素翁b基因的丝-特异性(fi1ament-specific)表达。W091/17243(NordiskA/S)公开了一种纤维素酵制剂，该制剂由与抗高度纯化的43kDa内切葡聚糖酶(得自〃〃迈/co/a//7^/e/wDSM1800)的抗体免^^应性的同源内切葡聚糖蘇组成。W091/17244(NordiskA/S)公开了一种新的(半)纤维素降解酶，如内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶或(3-葡糖苷酶，其可以来源于非木霉属和展齿革菌属的真菌；W093/2019321公开了可以構孢曲霉获得的内切葡聚糖酶；W094/21801(Genencor公司)涉及一种纤维素酶系统，该系统是从显示内切葡聚糖酶活性的7Wc力M"啦/o"g/6/"ac力/afi/ffl分离到的；W094/26880(GistBrocadesN.V.)公开了一种分离的纤维素降解酶混合物(优选地是从木霉属、/"e/^/〃"s或"/印o/"of/7c力咖获得的)，其具有内切葡聚糖酶，纤维二糖水解酶和木糖葡聚糖酵活'汰；W095/02043(NordiskA/S)描述了一种具有内切葡聚糖酶活寸生的来源于7Wc/of/e/"啦/w/"z/a/m/77的酶，该每可以用于许多目的，包括例如植物细胞壁的降解或^f务饰。已知纤维素酶可以也可以不具有纤维素结合域(CBD)。CBD增加酶对包舍纤维素纤维的结合，并增加膝的催化活性部分的功效。仍然需要提供可以用于需要纤维素酶尤其是内切葡聚糖酶活性的场合的新的纤维素酶制剂。本发明的目的是提供新的酶制剂，该酶制剂实质上在酸性、中'昧或i^性条件下具有溶纤活性，并在纸浆处理，织物处理和洗衣过程中或者在动物詞养中具有改进的功效，优选地是新的纤维素蘇，更优选地是性能良好的内切葡聚糖酶的酶制剂，所述S^被尝试由重組技术生产或产生.发明概述令人惊奇地是，现已发现一组内切葡聚糖蘇具有某些独特的特征，在通常使用内切葡聚糖酶的那些工业应用中性能良好。这些独特的特征可以以酶蛋白质g酸序列的保守区进行描述，本发明发现，具有某些保守区的溶纤酶(即显示溶纤活性的酶)在处理要洗的衣物、处理新制造的织物和处理造纸纸浆中十分有效。因此，本发明第一方面涉及一种酵淛剂，该制剂实质上由具有溶纤活性的酶组成，所述酶包含具有以下序列的由"个M酸残基组成的第一g財列ThrArgXaaXaaAspCysCysXaaXaaXaaCysXaaTrpXaa123456789.1011121314和具有以下序列的由5个#^^基组成的第二#^*列TrpCysCysXaaCys12345其中，在第一序列的3号位置上，M^:Trp、Tyr或Phe;在第一序列的4号位置上，g酸是Trp、Tyr或Phe;在第一序列的8号位置上，g^Arg、Lys或His;在第一序列9、10、12和H号的^(i置上，在第二序列的4号位置上，M酸是20个天然a酸残基中的任何一个，其条件是在第一m宇列中，(i)当12号位置上的^酸残基是Ser时，14号位置上的a酸残基不是Ser，和(ii)当12号位置上的M酸残基是Gly时，14号位置上的M酸残基不是ALa'尽管在性能良好的内切葡聚糖酵内发现其它相当显著的变异，但可清楚识別保守区的这一惊人的发现是大量真菌DNA序列研究的结果，所述DNA序列编码具有有效的溶纤(尤其是内切葡聚糖酶)活性之酶的特定g^列。基于这一发现，开发了一种用于特异性筛选以编码本发明的酶为特征的基因组DNA或cDNA的分子方法。构建了作为其工具的三套简并引物。因此，本发明在其第二方面涉及^R供编码真有上述保守区^Ji:纤酶基因的方法。通过使用这种方法(即供基因组DNAPCR筛选的引物套)，令人惊奇地发现编码所述酶的DNA可以从宽范闺的真菌中发现，所述真菌属于分类学上很不相同的生物体，并且栖息于生态学上十分不同的小生境中。进一步地，通过使用这一方法，发现编码所迷酶核心区(催化活性区或旬而无^T连接的纤维素结合域(CBD)之DNA序列已经可能，所述酶的核心区将不通过采用基于筛选方法的常规手段来选择。发明人经实發逸实CBD区与本发明的酶核心区(包括所述酶的催化活性区或樹的连接导致多域酶的功效明显改善，例如，高出50倍的功效。因此，本发明提供了新的纤维素酶，尤其内切葡聚糖酶，以其天然形式或者同源或异源形式产生的这些酶在工业应用中具有改善的功效。另一方面，本发明涉及新的溶纤酶制剂，该制剂是可以从分类学上的特定门(phyli)、纲、目、科、属和种产生的，例如可以从担子菌门的(Basidiomycotous)层菌纲(〃//e/70/zy/cefe力、接合菌门(Zj^cw/cofa)、壶菌门(CAf"/V/o/^co&);或从纲盘菌纲(Z/"o/z7/c^e"、腔菌纲(屋潜溯、不整囊菌纲(/Ve"cw7/ce/^y);Jrc力aea5"ccw/c"es、半子囊菌纲(Hemiascoraycetes)或者从间座壳目、炭角菌目(7Wc/^^力ae/7a/e力、黑痣菌目(尸////ac/o/"a或从科丛赤壳科(yVe"r/ae3e)、粪壳科(SoiY/a".3ceae)、毛壳科(6Vwefo/w/ace3e，)、Cer2&"0鹏ce3e、毛球壳科("".osp/^er/aceae);或从属柱抱属(C/〃/7f/roca/770/7)、粘帚霉属(67/oc/af//"/77)、周刺座霉属(f^/wfe〃a)、5"c/fa/油'咖、顶孢霉属(爿cre卿"/u/7)、或从种番痴镰孢(F"5^厂/〃/T7//CO/e/^/c/)、尸iASa/7i7/Z7/7aS5"/Z7o厂3、腐皮镰抱(尸"X3/"/〃/77510/3/7/)、蛇形镰孢(y^A9a/"/w/w3/7《"/o/fl^y)、早熟禾嫌抱(/^5"<3,/"/77/70<3<5)、黑腐质審(〃"/7/<%/<3/H'g/esce/^)、灰腐质霉(〃i7/7/co/agr/sea)产生的，尤其是实质上由包含逸自以下序列的^J^^列的酶组成的那些XaaThrArgXaaPheAspXaa1234567XaaThrArgXaaTyrAspXaa1234567和XaaThrArg'XaaTrpAspXaa1234567其中，在4号位置上，Xaa是Trp、Tyr或Phe;和在1和7号位置上，Xaa是20个天然#^自基中的任何一个。更具体地说，本发明的绔制剂优选地是可以从以上提到的分类学上的特定门(phyli)、纲、目、科、属和种产生的，所述的所有微生物都产生内切葡聚糖酶，该酶包含具有以下序列的由n个gg基组成的第一肽ThrArgXaaXaaAspCysCysXaaXaaXaaCysXaaTrp12345678910111213和具有以下序列的由5个M^基组成的第二肽TrpCysCysXaaCys12345其中，在第一序列的3号位置上，^酸是Trp、Tyr或Phe;在第一序列的4号位置上，aaTrp、Tyr或Phe;在第一序列的8号位置上，M酸是Arg、Lys或His;在第一序列9、10和12号的^置上，在第二序列的4号位置上，g酸是20个天然g^基中的任何一个。本发明另一方面提供了包含编码显示内切葡聚糖酶活性的酶的DNA序列之DNA构建体，所述DNA序列包含分别在SEQIDNO:1、4、5、10、12、16和19中所示的DNA序列或者它们的类似物。本发明也涉及包含本发明DNA构建体的重组表达栽体；涉及包含本发明DNA构建体或重组表达栽体的细胞；涉及产生本发明酶(例如，重组体酶)的方法；涉及通过使用本发明的fi^f吏要洗的衣物颜色澄清的方法；涉及包含本发明的酶的洗衣组合物；涉;5U^发明的酶在降解或改.^b度物材料(例如细胞壁)，处理织物原料、织物或衣物，处理纸浆中的用途；并涉及富含本发明的酶的酶制剂。附图简要描迷图1是下列徵生物的推定编码的氨基酸序列的序列对比化reM//w/T7/^/■awoo/w/ws/j.(77)，i^Fce_//o/7/^7<7/\2f力e/7770/7力/A3，r々/e/ar/'<3Ze/ve"/"/s，yf/acro/Acw//7a//"<30//加。用Pileup程序(Feng和D00LiUle1987)(GCG包，8.0)产生最好的序列对比。在至少四个序列中相同的残基(方框中)在相应的g酸周围表示出来'图2图2a，b，ci兑明在真菌界内的本文所讨论的所有微生物(其能够产生本发明的酶制剂和酶)的分类学分类。本文^f吏用的分类学分类基于用于NIH数据库(Entrez1996春天妃的系统，该系统可以从WorldWideWeb:(http:〃www3.ncbLnlm.nih.gov/htbin/ef/entrezTAX)获得。对未包含在Entrez数据库中的生物体的分类，使用了下列一般可获得的和世界范围内接受的参考书对于子嚢菌纲""o迈ycefe力Eriksson,0.E.&Hawksworth，D丄子囊菌纲系统，vol12(1993)。对于担子菌纲O"/"/offly"fes):JiUich，W，担子菌纲的较高分类群，BibUothecaMycologia85，485pp(1981)。对于#菌纲O'Donnell，K.:培养中的接合菌纲，佐治亚大学，美国，257pp(1979)。一般4生的微生物学参考书Hawksworth,D.L.，Kirk，P.M.，Sutton,B.C.和Pegler，D.N.:真菌词典，国际真菌学研5C所，616pp(1995);VonArx，J.A,:培养中形成孢子的真菌属，424pp(1981)。迄今仍不清楚腐质霉属(^/顶/co/a)的分类学位置(impLaceraent).然而，粪壳目(化r^r/We^广泛选择的18SRNA的研究已给出腐质霉属归于粪壳目的有力的提示(Taylor,CUusen&0xenb(()il，？MC表).此外，这些数椐表明腐质霉属与蛾柱霉属(^^"//心咖)一起与粪壳科、毛壳科，长咮壳科(Ce/^/o〃o鹏"ceae)和4^壳考+仅有相当远的关系。依据上述，在这里将腐质霉属和5^/"//力'鄉置于粪壳目内，科未知。图3是推定的部分M酸序列的序列对比，所述序列来源于实施例5中描述的46种徵生物中选择的26种。发明详述在本文中，术语"2()种天然Ma基"指通常在蛋白质中发现的20种M^1照惯例被认为是丙氨酸(Ala或A)、缬氨酸(Val或V)、亮氨酸(Leu或L)、异亮氨酸(Ile或1)、脯氨酸(Pro或P)、笨丙氨酸(Phe或F)、色氨酸(Trp或W)、甲疏氨酸(Met或M)、甘氨酸(Gly或G)、丝氨酸(Ser或5)、苏氨酸(Thr或T)、半胱氨酸(Cys或C)、酪氨酸(Tyr或Y)、天冬跣胺(Asn或N)、谷氨敞胺(Gln或Q)、天门冬氨酸(Asp或D)、谷氨酸(Glu或E)、赖氨酸(Lys或K)、精氨酸(Arg或R)、和组氨酸(H"或H)。按照本发明，本发明提供了新的性能良好的内切葡聚糖酶，其包含保守#^*列区，尤其是具有以下序列的由l4个M^基组成的第一g耕列ThrArgXaaXaaAspCysCysXaaXaaXaaCysXaaTrpXaa1234567891011121314和具有以下序列的由5个#^^^基组成的第^#^蔽亭列TrpCysCysXaaCys12345中，第一序列的3号位置上，g^Trp、Tyr或Phe;第一序列的4号位置上，M^Trp、Tyr或Phe;第一序列的8号位置上，M酸是Arg、Lys或His;其在在在在第一序列9、10、12和"号的M置上，在第二序列的4号位置上，M^^A20个天然M^^基中的任何一个，其条件是在第一M^^列中，(i)当12号位置上的g^基是Ser时，14号位置上的g酸残基不是Ser，和(ii)当12号位置上的M酸残基是Gly时，14号位置上的M酸残基不是Ala。优逸地，本发明的蘇是徵生物来源的，即是可以从微生物(如真菌)获得的。在一个优选的实施方案中，在第一序列的9号位置上的g酸残基选自脯氨酸、苏氨酸、缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、笨丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬亂疾、谷氨酰胺、酪氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸和色氨酸，优a选自脯氨酸和苏氨酸。在另一个优选的实施方案中，在第一序列的10号位置上的M酸残基选自脯氨酸、苏氨酸、缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、笨丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬敞胺、谷氨跣胺、酪氨酸、丝氨酸、甲疏氨酸和色氨酸，优选地是丝氨酸.在另一个优选的实施方案，在第一序列的12号位置上a^aiJ^自脯氨酸、苏氨酸、缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、笨丙氨酸、甘氨酸、半耽氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸和色氨酸，优i4i也选自丙氨酸和甘氨酸。在另一个比选的实施方案中，在第一序列的14号位置上的g酸残基选自脯氨酸、苏氨酸、幾氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、笨丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬醜胺、谷氨缺胺、酪氨酸、丝氨酸、甲磁，氨酸、色氨酸、谷氨酸和天冬氨酸，优选地选自脯氨酸、苏氨酸、丝氨酸、丙氨酸、谷氨酸和天冬氨酸.优逸地，在第二序列的4号位置上的a^^自脯氨酸、苏氨酸、缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、笨丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬跣胺、谷氨跣胺、酪氨酸、丝氨酸、甲琉氨酸、色氨酸、谷氨酸和天冬氨酸，更优选地选自丙氨酸、甘氨酸和谷氨耽胺.更优选的实施方案的例子是这样的一些，其中，在第一序列中，第3号位置上的絲舰基是酸氨酸；或在第4号位置上的狄絲基是色氨酸;或在第8号位置上的g^^基是赖氨酸。在一个特別优逸的实施方案中，本发明的酶包括逸自以下序列的氛基酸序列ThrArgTyrTrpAspCysCysLysProSerCysAlaTrp12345678910111213,ThrArgTyrTrpAspCysCysLysThrSerCysAlaTrp12345678910111213,和ThrArgTyrTrpAspCysCysLysProSerCysGlyTrp12345678910111213在第二方面，本发明提供了用于发现和克隆编码这种酶的基因的方法，该方法包括在标准条件下与来源于任何保守区的寡核苷酸杂交(例如PCR扩增)，如图1所i兑明的。一种有用的寡核苷酸包含编码包含在选自以下序列的肽中的至少五肽的核苷^列a.ThrArgXaaXaaAspCysCysXaaXaaXaaCysXaaTrpXaa1234567891011121314在3或4在号位置上的^酸是Trp、Tyr或Phe;在8号位置上的Jt^^Arg、Lys或His;在9、10、12和14号位置上的^^酸分别是20个天然城絲基中的任何一个；和b.TrpCysCysXaaCysTyr123456在4号位置上的g酸是20个天然M酸残基中的任何一个；和c.XaaProGlyGlyGlyXaaGlyXaaPhe1234567891号位置上的a^:Met或Ile;6和8号位置上的氨基酸分别是Leu、lie或Yal;和d.GlyCysXaaXaaArgXaaAspTrpXaa123456789在3号位置上的M^20个天然^^酸残基中的任何一个；在4和6号位置上的氛基酸分別是Trp、Tyr或Phe;并且在9号位置上的^^APhe或Met。所述有用的寡核苷酸也包括与以上所述序列互补的核苷酸序列.在本发明的方法的一个优选的实施方案中，所迷寡核苷酸相应于选自以下PCR引物的PCR引物有义，5，-CCCCAAGCTTACIA/cG工TAC/tTGGGAC/tTGC/tTGC/tAAA/g八/cC-3,反义l,5'-CTAGTCTAGATAA/0CAIGCV。CAA/。CACC-3';反义2,CTAGTCTAGAAAIAA/G/TICCIAA/C/0ICCI<;CICCIGG-3';和反义3，5'-CTAGTCTAGAIAACCAA/0TCAV0A/TAIC°/TCC-3.在第三方面，本发明提供了一种酶制剂，该制剂实质上由具有溶纤活性和具有发明人所发现的保守区的酶组成，该酶包含具有下列序列的由7个g^列组成的AbXaaThrArgXaaPheAspXaa1234567XaaThrArgXaaTyrAspXaa1234567;和XaaThrArgXaaTrpAspXaa1234567其中，在4号位置上，Xaa是Trp、Tyr或Phe;和在1和7号位置上，Xaa是20个天然^J^^基中的任何一个.这种酶是可以从属于担子菌门的层菌纲菌抹优逸地属于蘑菇目、木耳目和非褶菌目的菌抹，更优逸的属于黑耳科、口蘑科、鬼*、裂褶菌科、烟管菌科和多孔菌科的菌抹，特别是属于黑耳属、毛皮伞属、层孔菌属、斑褶菇属、栓菌属、裂褶菌属和绵皮孔菌属的菌株获得的(参见图2)。特定的例子是可以>^于黑胶耳、6V/'/7/;7e〃/、sca办e//3、；M^层孔菌和5>)o/^//7e〃/ssa的菌抹，特别是可以从黑胶耳CBS277.96、6W/7/^/〃s"We/"CBS280.96、木蹄层孔菌CBS276.96和i"/w/^/》e"Aw.CBS283.96获得的内切葡聚糖酶。按照布达佩斯条约，黑胶耳于1996年3月12日以保藏号CBS277.96保藏在真菌菌种保藏中心，Oosterstraat1,Postbus273，NL-3740AGBaarn，4肯兰；CV////^//^sca^/A3于1996年3月12日以保藏号CBS280.96保藏在真菌菌种保藏中心，Oosterstraat1，Postbus273，NL-3740AGBaarn，荷兰；^M^层孔菌于1996年3月12日以保藏号CBS276.96保藏在真菌菌种保藏中心，Oosterstraat1，Postbus273，NL-3740AGBaarn，荷兰；Spongipellissp.于1996年3月12日以保藏号CBS283.96保i^真菌菌种保藏中心，Oosterstraat1，Postbus273，NL—3740AGBaarn，荷兰。本发明的酶制剂是也可以从属于壶菌门的菌珠优i^Mk^于壶菌纲的菌抹，更优选地属于Sp/ze/^/h/ce/^/es目的菌抹，特别优选地属于5/7/ze〃o/z7yce"ceae考牛的菌^尤其是属于囊壶菌属的菌^^得的'所H兑菌抹的特定的例子是属于红根嚢壶菌的菌抹，尤其是红根囊壶菌CBS282.96。按照布达佩斯条约，MIL嚢壶菌于1996年3月12曰以保藏号CBS282.96保藏在真菌菌种保藏中心，Oosterstraat1，Postbus273，NL-3740AGBaarn,4肓兰。本发明的酶制剂也可以M于掩^菌门的菌歉优^M^于接合菌纲的菌^更优g从毛霉目的菌^尤其是从属于毛霉科和枝霉科的菌^尤其是属于根毛霉属、须霉属和刺枝霉属的菌抹获得。特定菌抹的例子是属于i//Z0/ZW/C0/"，闪光须霉和弗雷生刺枝霉的菌抹，特别是^/z湖wcor/7"s/7/MIF04578、闪光须霉IF04814和弗雷生刺枝霉NRRL2305。此外，本发明的酵制剂也可以从属于打c/wea"o/ff/ce"s、盘菌纲，半子囊菌亚纲，腔菌纲和不整囊菌纲的菌珠优选地从属于由盘菌目、斑痣盘菌目0/^〃s鹏fa/es)、座嚢菌目和狀嚢菌目的菌抹获得。尤其是所迷酶可以从属于葫声霉科、粪盘菌科、斑痣盘菌科和发菌科的菌^优选地从属于色二^&^、/i//c/x"/7aerc/7s/s、"/o"ora、壳球:&^，粪盘菌属，5^cco^/ws、青霉属和77er/7/咖/ces的菌抹获得'特定的例子是可以从以下菌抹获得的酶，所述菌抹是属于由棉色二孢、Wcros/)/aero/^"、^5"cc^o7w5"5^/c/o/'o^51、i^cco6o/oy/wfe//us、盘菌属(尸ez/z3)、虎孢青霉、产黄青霉和77er/770/77/cwp^r/""cos^的菌歉特别是棉色二孢CBS274.96、〃/os/o/^NKBC1444、ylfecrcipAcw//7a/7/aseo///^CBS281.96、5"縱o6o/"sCBS275.96、虎孢青霉ATCC623%、产黄青霉ATCC9480和T77e磨/^c"w藩o馬CBS285-96。按照布达佩斯条约，棉色二孢于1996年3月12曰以保藏号CBS2".96保l^真菌菌种保藏中心；船"op力o/p/朋/^^eo//^于1996年3月12曰以保藏号CBS281.96保藏在真菌菌种保藏中心；5^ccoto/"s(///tUe〃"s于1996年3月12曰以保藏号CBS"5.96保l^真菌菌种保藏中心；777e/wo顶/ceszerr"c^us于1996年3月12日以保藏号CBS285.96保藏在真菌菌种保藏中心。此外，所述酶可以从属于间座壳目、炭角菌目、假毛球壳目和黑痣菌目的菌來优选M属于炭角菌科、黑腐皮壳科和,//y/ac/oraceae的菌椒更优i^^属于由间座壳属、刺盘孢属、黑孢属、炭角菌属、和孔座壳属的菌抹获得。特定的菌抹的例子是属于历'a/w/^力esj7^e;es/a.葫，牙4"刺盘孢、鹿角团炭角菌、/V/>/^i770/\3577.、〃6^/〃//s/70/xw和.泉孑L座壳的菌椒特另'l是Z/a/wrf/7esj/^e/es/aCBS278.96、葫,科刺盘孢ATCC52609、A7groypo"CBS272.96、鹿角团炭角菌CBS284,96.按照布达佩斯条约，"/a/oi^力esy/^e/es/a于1996年3月12日以保藏号CBS278.96保藏在真菌菌种保藏中心；/V/>/Y^/7ora于19%年3月U曰以保藏号CBS272.96保艮在真菌菌种保藏中心；鹿角团炭角菌于1996年3月12曰以保藏号CBS284.96保M真菌菌种保藏中心.所迷醃也可从按照布达佩斯于1996年3月12日分別以保藏号CBS270.96、CBS271.96和CBS273.96保藏在真菌菌种保藏中心的未鉴別的真菌(有丝分裂孢子的，coleomycetous)获得。所述酶也可从以下菌抹获得，所述菌抹是属于柱孢属、粘帚霉属、赤壳属、周刺座霉属、粪壳属、Xc/"〃g7lw7、後孢壳属、5"/5^aWos/ora、67s^〃///7〃/7、毛壳属、#/ce〃/7/f/7ora和顶孢霉属的菌來特别是属于0^///7GV0ca777朋早、Afe"/7a///7<<3、K(o/wfe//<3"//etofr/c^o/fl^、类生类壳，大抱类壳、r力/eA3r/a/erres/r/s、,力/e/ar/a//e/777c/7//7<3、CW//CO/0/77/77、//e/7770/7//7a、链抱粘帝審、5V7//^//(77〃/77fAe/7op///a和/fcre/noo/u迈s/的菌珠尤其是Afecfr/a/7y'/7eaCBS279.96、&/"e//aco〃"ofr/由/'ctesCBS400.58、粪生粪壳ATCC52644、大孢类壳ATCC60255、r力/e/ay/afe/尸esf/7sNRRL8126、r力/e/aK/3/^e/7wo/7力/7aCBS174.70、墙毛壳CBS163.52、CAaefOflz/w/nr/resce/7SCBS547.75、C力a"薩'"/w6ra"7/譜/sCBS122.65、C/ae論/卿cw/7/'co/o厂w/zCBS799.83、Syspas/ospora60/7/"e/7s/sN1CBC1515、C/<2J<zr/////7w/z7厂oec/7y/2o7s5"/历〃/zATCC62373、W/ce//o/7^f/7(/"a*層/)///3CBS117.65、5"Wa/W^^e飾/7A/7aATCC28085、链孢粘帚霉ATCC10523和力cr湖朋/"迈CBS478.94。按照布达佩斯条约，/Vecfr/ap/"ea于1996年3月12日以保藏号CBS279.96保^L真菌菌种保藏中心；/Tcre迈卯/鹏".于1994年9月28曰以保藏号CBS478.94保藏。所述酶也可以从属于腐皮镰孢、蛇形镰孢、早熟禾镰孢、尖镰孢s羊^KCo/em.c/、尖银孢S57./7a^/Z7o/"a、黑腐质霉和灰腐质霉的菌抹，尤其是番茄尖镰孢"pj^co/^"/c/CBS645.78、尖镰孢"ppa^/77oraCBS744.79、腐皮镰孢IMI107,511、蛇形镰孢IFO4467、早熟禾镰孢ATCC60883、黑腐质霉CBS819.73和灰腐质霉ATCC22726获得.应当注意灰腐质霉不同于灰腐质霉Me/vz/o/^a变种.在一个优选的实施方案中，本发明的酶制剂来源于所公开的纲、目、科、属和种，并且实质上由下述酶组成，所迷酶包含具有以下序列的由13个氨基^基组成的第一肽ThrArgXaaXaaAspCysCysXaaXaaXaaCysXaaTrp12345678910111213和具有以下序列的由5个^&^^基组成的第二肽TrpCysCysXaaCys12345其中，在第一序列的3号位置上，M^:Trp、Tyr或Phe;在第一序列的4号位置上，M酸是Trp、Tyr或Phe;在第一序列的8号位置上，#^^LArg、Lys或His;在第一序列9、10和12号的^Mi置上，在第二序列的4号位置上，g酸是20个天然Ma基中的任何一个。优选地，在第一序列的9号位置上的^^基选自脯氨酸、苏氨酸、绳氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、笨丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬统胺、谷氨跣胺、酪氨酸、丝氨酸、甲i^酸和色氨酸，更优选地选自脯氨酸和苏氨酸；在第一序列的10号位置上的^^^M自脯氨酸、苏氨酸、幾氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、笨丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬统胺、谷氨统胺、酪氨酸、丝氨酸、甲碟氨酸和色氨酸，优选地是丝氨酸；在第一序列的12号位置上的Mg;i^自脯氨酸、苏氨酸、缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、笨丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丝氨酸、甲坑氨酸和色氨酸，优选地选自丙氨酸和甘氨酸；在第二序列的4号位置上的^A^JJ^自脯氨酸、苏氨酸、幾氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丝氨酸、甲琉氨酸、色氨酸、谷氨酸和天冬氨酸，更优选地选自丙氨酸、甘氨酸和谷氨耽胺.另一方面，本发明换:供了一种DNA构建体，该构建体包含编码显示内切葡聚糖酶活性^的DNA序列，所述DNA序列包括a)分别在SEQIDNO:1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列和/或可以分別从哞酒糖酵母DSM9770、DSM10082、DSM10080、DSM10081，大肠杆菌DSM10512、DSM10511、DSMi0571、DSM10576中的质粒获得的DNA序列，或者b)分別在SEQIDNO:1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列的类々义物或可以分别从哞酒糖酵母DSM9770、DSM10082、DSM10080、DSM10081，大肠杆菌DSM10512、DSM10511、DSM10571、DSM10576中的质粒获得的DNA序列的类似物，该类似物U同源于分别在SEQNO:1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列和/或可以分別从啤酒糖酵母DSM9770、DSM10082、DSM10080、DSM10081，大肠杆菌DSM10512、DSM10511、DSM10571、DSM10576中的质粒获得的DNA序列，ii)与分别在SEQIDNO:1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列和/或可以分别从啤酒糖酵母DSM9770、DSM10082、DSM10080、DSM10081，大肠杆菌DSM10512、DSM10511、DSM10571、DSM10576中的质粒获得的DNA序列的相同核普酸探针杂交，iii)编码一种多肽，该多肽同源于由一种DNA序列编码的多肽，所述DNA序列包含分别在SEQIDNO:1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列和/或可以分別从啤酒糖酵母DSM9770、DSM10082、DSM10080、DSM10081，大肠杆菌DSM10512、DSM10511、DSM10571、DSM10576中的质粒获得的DNA序列，iv)绵码一种多肽，该多肽是与一种抗纯化内切葡聚糖酶的抗体免疫学反应性的，所述内切葡聚糖酶由分別在SEQIDNO:1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列或可以分别从啤酒糖酵母DSM9770、DSM10082、DSM10080、DSM10081，大肠杆菌DSM10512、DSM10511、DSM10571、DSM10576中的质粒获得的DNA序列编码。按照布达佩斯条约，大肠杆菌DSM10512已于1996年2月2日保^DSM(德意志魂生物保藏中心，MascheroderWeg16，D-38124Braunschweig,德国)。按照布达佩斯条约，大肠杆菌DSM10511已于1996年2月2曰保藏在DSM(德意志雀生物保藏中心，MascheroderWeg16，D-38124Braunschweig,德国)。按照布达佩斯条约，大肠杆菌DSM10571已于1996年3月6日保^DSM(德意志微生物保藏中心，MascheroderWeg16,D-38124Braunschweig,德国).按照布达佩斯条约，大肠杆菌DSM10576已于1996年3月12曰保藏在隨(德意志徵生物保藏中心，MascheroderWeg16，D-38124Braunschweig,德国)。按照布达佩斯条约，大肠杆菌DSM10583已于1996年3月13日保gDSM(德意志徵生物保藏中心，MascheroderWeg16，D-38124Braunschweig,德国)。按照布达佩斯条约，大肠杆菌DSM10584已于1996年3月13日保藏在DSM(德意志微生物保藏中心，MascheroderWeg16，D-38124Braunschweig,德国)。按照布达佩斯条约，大肠杆菌DSM10585已于1996年3月13日保gDSM(德意志微生物保藏中心，MascheroderWeg16，D-38124Braunschweig,德国)。按照布达佩斯条约，大肠杆菌DSM10586已于1996年3月13日保MDSM(德意志雀生物保藏中心，MascheroderWeg16，D_38124Braunschweig,德国)'按照布达佩斯条约，大肠杆菌DSM10587已于1996年3月13日保M醒(德意志微生物保藏中心，MascheroderWeg16,D-38124Braunschweig,德国)。按照布达佩斯条约，大肠杆菌DSM10588已于1996年3月13日保gDSM(德意志微生物保藏中心，MascheroderWeg16，D-38124Braunschweig,德国)。按照布达佩斯条约，啤酒糖酵母DSM9770已于1995年2月24日保藏在DSM(德意志徵生物保藏中心，MascheroderWeg16，D-38124Braunschweig,德国)。按照布达佩斯条约，哗酒糖酵母DSM10082已于1995年6月30日保藏在DSM(德意志徵生物保藏中心，MascheroderWeg16，D-38124Braunschweig,德国)。按照布达佩斯条约，,酒糖酵母DSM10080已于1995年6月30日保藏在DSM(德意志徵生物保藏中心，MascheroderWeg16，D-38124Braunschweig,德国)。按照布达佩斯条约，啤酒糖酵母DSM10081已于l"5年6月30曰保藏在DSM(德意志徵生物保藏中心，MascheroderWeg16，D-38124Braunschweig,德国)，与SEQIDNO:1有关的本发明DNA构建体可以A^丝霉属的菌珠特别是#.Me,卿///7a的菌來尤其是Mf/e/v770///A3CBS117.65的DNA文库分离或者基于该文库产生。与SEQIDN0:4和6有关的本发明DNA构建体可以从顶孢霉属的菌抹，尤其是力"e/770/j/柳s/j.CBS478.94的DNA文库分离或者基于该文库产生。与SEQIDNO:8有关的本发明DNA构建体可以从梭孢壳属的菌珠特另'J是T7/'e/3"3/^/ve5^/v:的菌#^尤其是r々/e/aK/<3/^/vesf/7irNRRL8126的DNAi^分离或者基于该il^产生.与SEQIDNO:10有关的本发明DNA构建体可以从壳球孢属的菌珠特別是脱//jaseo7/"a的菌昧尤其是JZ-//weoh加CBS281.96的DNA文库分离或者基于该iL^产生。与SEQIDNO:12有关的本发明DNA构建体可以从毛皮伞属的菌A特別是C"We/As的菌珠尤其是C."We//aCBS280.96的DNA文库分离或者基于该文库产生。与SEQIDNO:19有关的本发明DNA构建体可以从粪壳属的菌來特别是粪生粪壳的菌抹的DNA文库分离或者基于该文库产生。在本发明中，分别在SEQIDNO:1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列的"类似物"意指^T编码显示内切葡聚糖酶活性的酶的DN八序列，其具有性质i)-iv)的任一或全部.类似的DNA序列a)可以基于分别在SEQIDNO:1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列，采用例如本文所公开的方法，从产生具有内切葡聚糖酶活性之蘇的其它或者相关(例如，相同)生物体分离；同系物可以是包含本文所示的DNA序列的DNA序列的等位变体，即经突变产生的基因的另一种形式.突变可以是沉默的(在编码的酶上无变化)或可以编码具有改变的M酸序列的酶；所述DNA序列的同系物也可以是属或种同系物，编码来源于另一个种的具有类似性质的酶。b)可以基于分别在SEQIDNO:1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列构建，例如通过引入不产生另一个由所述DNA序列编码的内切葡聚糖酶的^&l宇列(但其相应于用于产生所迷酶的生物体的密码子使用)的核苷酸取代，和能够产生一种不同的g酸序列的核苷酸取代。然而，在后一种情况下，氨基酸的变化优选地是次务f生质的改变(其是保守氨基酸取代，不明显地影响蛋白质的折叠或活性)、小的缺失(典型地是1到约30个^J^0;小的虽^^-或M-末端延伸(如^-末端甲硤歲^《基)，至大约20-25个残基的小的接头肽或有利于纯化的小的延伸(如聚-组氨^，抗原表M结合^U，总的情况参见Ford等，蛋白质表达和纯化，2:95-107，1991。保守取代的例子在下列^^酸的范围内碱性氨基酸(如精氨酸，赖氨酸，组氨紛，酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨紛，极性氨基酸(如谷氨跣胺和天冬StJ^)，疏水氨基酸(如亮氨酸，异亮氨酸，缬氨銜，芳族a酸(如笨丙氨酸，色氨酸，輅氨紛和小絲酸(如甘氨酸，丙氨酸，丝氨酸，苏氨酸，甲>^紛。对本领域技术人员明显的是，可以进行这样的取代，其在对所述分子的功能关键性的区域之外，并且仍然产生活性多肽。可以按照本领域已知的方法鉴别对本发明的DNA构建体编码的多欣之活性必需的g酸，所述方法例如定向谦变或丙氨酸-扫描诱变(Cunningham和Wells,科学244，108卜1085,1989)。在后一技术中，在分子中的任何残基上引入突变，试验形成的突变体分子的生物学(即内切葡聚糖鲦)活性，以筌别对所说分子活性关键性的氨基酸残基.底物-酶相互作用的位点也可以通过晶体结构(由核磁共振、结晶学或光亲和性标记法之类的技术测定的)分析测定。参见例如deVos等，科学255:306-312，1992;Sraith等，分子生物学杂志.224:899-904，1992;Wlodaver等，FEBSLett.309:59—64，1992。由本发明的DMA构建体的DM序列编码的内切葡聚糖蘇可以包括纤维素结合域(CBD),以编码完^S^—部分存在，或者其它来源的CBD可以引入进内切葡聚糖酶酶，由此产生酶杂合沐。在本文中，术语"纤维素-结合域"应如PeterTo咖e等"不溶性碳水化合物的S^t降解"中的"纤维素-结合域分类和性质"，JohnN.SaddlerandMichaelH.Penner(编者)，ACS专题研讨系列No.618,1996所定义的来理解。这一定义把120种以上的纤维素-结合域(CBD)分类成10个家族([-)O，并且其i爻明CBD在各种蘇中发现,如纤维素蘇，木聚糖酶，甘露聚糖酶，阿拉伯呋喃糖苷酶，乙酰酯酶和壳多糖酶。CBD^藻类中发现，例如，作为-非水解多糖类-结合的红藻尸o/77力//^/7〃i77〃rea蛋白质，参见PeterTomme等，同上。然而，大多数CBD来源于纤维素餘和木聚糖酶。CBD在蛋白质的N或C末端或内部发现。酶杂合体在本领^A已知的，参见例如W090/00609和W095/16782，并且可以通过将包含至少一种编码纤维素-结合域的DNA片段(其带有或不带有接头，与编码目的酶的DNA序列连接)的DNA构建体转^ii宿主细胞中，并培养该宿主细胞以表达融合基因来制备。酶杂合体可以用下式来描述CBD-MR-X，其中CBD是相应于至少纤维素-结合域的#^^列的N-末端或C-末端区；MR是中间区(接头)，和可以是化学键或者短的连接基团，这些基团优逸地具有约2至100个碳原子，更优逸地具有2至40碳原子；或者优选地是约2至约100个g酸，更优逸电是2至40个#^酸；X是由本发明的DNA序列编码的多肽的N-末端或者C-末端区。以两种序列之间的等同性的程度测定以上i)中H的同源性，表示第一序列和第二序列的差别。同源性可以用本领域已知的计算;b^序合适地测定，例如在GCG禾呈序包中^R供的GAP(Needleman,S.B.和Wunsch，C.D.，分子生物学杂志，48:443-"3，1970).采用GAP和下列设置进行DNA序列比较GAP产生罚分5.O和GAP延伸罚分O.3,所述DNA序列的编码区显示与分别在SEQIDN0:1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列或者可以分別从哞酒糖酵母DSM9770、DSM10082、DSM10080、DSM10081，大肠杆菌醒10512、隨10511、DSM10571或DSM10576中的质粒获得的DNA序列具有优选地至少60%，更优逸地至少65%，更优M70%，更优选地至少80°/。，尤其是至少90%的等同性程度。以上ii)中M的杂交意指在某些特点的条件下(在此后的材料和方法中详细描述)，类似的DNA序列杂交到编码内切葡聚糖酶的DNA序列的相同探针上.所使用的寡核苷酸探针是相应于分别在SEQIDNO:1、4:6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列或者可以分别从啤酒糖酵母DSM9770、DSM10082、DSM10080、DSM10081，大肠杆菌DSM10512、DSM10511、DSM10571或DSM10576中的质粒获得的DNA序列之内切葡聚糖酶编码部分的DNA序列。以两种序列之间的等同性的程度测定以上iii)中提及的同源性，表示第一序列和第二序列的差别。同源性可以用本领域已知的计算机程序合适地测定，例如在GCG程序包中提供的GAP(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，分子生物学杂志，48:443-453，1970)。采用GAP和下列设置进行多肽序列比较GAP产生罚分3.O和GAP延伸罚分O.1，类似DM序列编码的多肽显示与包含分别在SEQIDNO:1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列或者可以分别从啤酒糖酵母DSM97"70、DSM10082、DSM10080、讀10081，大肠杆菌DSM10512、DSM10511、DSM10571或DSM10576中的质粒获得的DNA序列的DM构建体所编码的酶具有优选地至少55%，更优选地至少60%，更优选地65%，更优选地至少70%，更优选地至少80%,尤其是至少90%的等同性程度。关于以上iv)提及的性质，意指分别由从啤酒糖酵母DSM9770、DSM10082、DSM10080、DSM10081，大肠杆菌廳10512、DSM10511、廳10571或DSM10576分离的DM序列编码和由用所i兌DNA序列转化的宿主生物体产生的内切葡聚糖酶酶，或者分别由///ce/2'0;7力M0raMe/7ffop///s、CW;/^///sca6e"a、「。/We//a或粪生粪壳天然内切葡聚糖酶。可以用以下材料和方法部分描述的方法测定免疫学反应性。本发明的另一方面涉及具有本发明的DNA构建体的表达载体、包含所说DNA构建体和表达载体的细胞以及产生显示内切葡聚糖酶活性之酶的方法，该方法包括在可以产生所说酶的条件下培养所说的细胞，并从培养物回收所说的酶.本发明的另一方面涉及一种显示内切葡聚糖酶活性的酶，这种酶a)由本发明的DM构建体编码b)用本发明的方法产生C)与一种抗纯化内切葡聚糖酶的抗体是免疫学反应性的，所述内切葡聚糖蘇由分别在SEQIDNO:1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列或者可以分别从哞酒糖酵母DSM9770、DSM10082、DSM10080、DSM10081，大肠軒菌DSM10512、DSM10511、DSM10571或DSM10576中的质粒获得的DNA序列编码。以上c)中^^的内切葡聚糖酶可以是由从,酒糖酵母DSM9770、DSM10082、DSM10080、DSM10081，大肠杆菌DSM10512、DSM10511、DSM10571或DSM10576分离的DNA序列编码和由用所说DNA序列转化的宿主生物体产生的内切葡聚糖酶，或者分别由/^/ce//oM^o/^f^e/7wc>;)/j//a、/fcre/wcw/w/wsp.、7T7/e/aK/'aferretf/"/:、Afecro//o/77//<3粪生粪壳天然相应的内切葡聚糖酶。一般地，在本文中，术语"酶"被理解为包括成熟蛋白质或其前体形式以及其实质上具有全长酴活性的功能性片段。此外，术语"酶"旨在包括所说酶的同系物。所述酶的同系物可以具有一个或多个g酸取代，缺失或者添加。这些变化优选地是次务li质的改变(其是保守g酸取代，不明显地影响蛋白质的折叠或活性)、小的缺失(典型地是1到约30个氩基^);小的募l-或羧基-末端延伸(如氨基-末端甲i^^基)，多至大约20-25个残基的小的接头肽或有利于纯化的小的延伸(如聚-组氨酸束，抗原表位或结合樹，总的情况参见Ford等，蛋白质表il^纯化，2:95-107，1991.保守取代的例子在下列氨基酸的范围内碱性氩基酸(如精氨酸，赖氨酸，组氨銜，酸性的氨基酸(如谷氨酸和天冬氨紀，极性氨基酸(如谷氨酰胺和天冬酰胺)，疏水氩基酸(如亮氨酸，异亮氨酸，幾氨紛，芳族氛基酸(如笨丙氨酸，色氨酸，酪氨紛和小a酸(如甘氨酸，丙氨酸，丝氨酸，苏氨酸，对^域技术人员明显的是，可以iK亍il样的取代，其在对所述分子的功能关键性的区域之外，并且仍然产生活性酶。可以按照本领域已知的方法鉴别对本发明的DNA构建体编码的酶之活性必需的^酸，所述方法例如定向请变或丙氨酸-扫描请变(Curminghara和WeUs,科学244，1081-1085，1989)。在后一技术中，在分子中的任何残基上引入突变，试验形成的突变体分子的生物学(即内切葡聚糖酶)活性，以鉴別对所说分子活性关键性的4^^基.配体-受体相互作用的位点也可以通过晶体结构(由核磁共振、结晶学或光亲和'汰标记法之类的技术测定的)分析测定。参见例如deVos等，1992;Smith等，1992;Wlodaver等，1992。同系物可以是等位变体，即经突变产生的基因的另一种形式或可以是由突变基因编码的改变的酶(但具有与本发明的酶实质上相同的活性)。由此的酶。所述酶的同系物也可以是属或种同系物，即来源于另一物种的具有类似性质的酶.所述酶的同系物可以通it^文描述的方法分离。经聚合^m^应分子筛^克隆使用从^il的来源(例如任何本文提及的生物体)分离的基因组DNA或者双链cDNA和基于本文公开的DNA序列和^酸序列制备的合成自普酸引物，经聚合S^乏应(PCR)进行本发明的DNA序列的分子筛选。例如，合适的B苷酸引物可以是在材料和方法部分中所描迷的引物。依据众所周知的方法，在分子筛选中所产生的PCR片段可以被分离和亚克隆进合适的载体中。经例如菌落或者噬斑杂交，PCR片段可以用于筛选DNA文库。酵母中的克隆表达可以通过一般性的方法分离编码显示内切葡聚糖酶活性的酶的本发明的mu序列，所述方法包括-在合适的栽体中从合适的来源(例如任何本文提及的生物体)克隆DNA文库，-用所说的载体转化合适的酵母宿主细胞，-在^il的务阵之下培养所说宿主细胞，以表达由DNA文库中的克隆编码的^r^^酶，-通过测定由这些克隆产生的酶的任何内切葡聚糖酶活性筛选阳性克隆，-从这些克隆分离编码所迷酶的DNA。在W094/14953中进一步/^开了一般'汰的方法，该文献的内容本文一并参考。筛选方法更详细的描l在以下实施例1中给出。可以分离编码酶的DNA序列，所迷分离是例如通过筛选他cro/7/o/77/朋/7力a51(5(9///73、C/7/7//7e///ssca^e〃a、粪生粪壳或r。7i/fe//3"//e/^mc/^/V"的cDNA文库，并选择表达合适的蘇活性(即内切葡聚糖酶活性)的克隆进行分离；或者从按照布达佩斯条约于1996年2月2日保藏在DSM(德意志微生物保藏中心，MascheroderWeg16，D-38124Braunschweig,德国)的大肠杆菌DSM10512分离；或者从按照布达佩斯条约于1996年2月2日保藏在DSM的大肠扦菌DSM10511分离；或者从按照布达佩斯条约于1996年3月12日保^jlDSM的大肠杆菌DSM10576分离；或者A^按照布达佩斯条约于1996年3月6日保藏在DSM的大肠杆菌DSM10571分离；或者通过筛选yV/ce〃;7/^/or3^e/vz70/7/7//<3CBS117.65、//c/"e/z70/7/.w迈CBS478.94或T7/e/aK/afe/resf尸/sNRRL8126的cDNA文库，并选择表达合适的酶活性(即内切葡聚糖酶活性)的克J^ii行分离；或者从按照布达佩斯条约于1995年2月24曰保藏在DSM(德意恭徵生物保藏中心，MascheroderWeg16,D—38124Braunschweig,德-国)的哞酒糖酵母DSM9770分离；或者从按照布达佩斯条约于1995年6月30日保^DSM的,酒糖酵母DSM10082分离；或者A^按照布达佩斯条约于1995年6月30日保藏在DSM的哗酒糖酵母DSM10080分离；或者M^按照布达佩斯条约于1995年6月30曰保,DSM的哞酒糖酵母DSM10081分离。然后，可以用标准方法(如实施例1中所描迷的)从所述克隆分离合适的隨序列。核酸构建体本文使用的术语"核酸构建体"旨在指任何cDNA、基因组DNA、合成DNA或者RNA来源的核酸分子.术语"构建体"旨在指核酸区段，其可以是单^或双链，并且其可以是基于编码兴趣酶的全部或部分天然核香酸序列，所述构建体可以含有可以不含有其它核酸区段。编码本发明酶的核酸构建体可以殳基因组或cDNA来源的，例如通过制备基因组或者cDNA文库，并按照标准技术(参见Sambrook等，1989)使用合成，苷酸^1针经杂交筛选编码全部或部分酶的DNA序列获得编码蘇的核酸构建体也可以用已建立的标准的方法经合成制备，所迷方法例如由Beaucage和Caruthers(1981)描迷的氨基亚嗜酸酷方法，或Matthes等(198W描迷的方法。按照氛l亚磷酸酯方法，在例如自动DNA合成仪中合成寡核苷酸，纯化，退火，连接和在合适的载体中克隆。此外，所述核酸构建体可以是合成和基因组，合成和cDNA或基因组和cDNA混合来源的，其是经按照标准技术连接合成、基因组或者cDNA来源的片段(相应于完整的核酸构建体的各种部分的片段)制备(以合适的方式)的。也可以采用特定的引物经聚合sm反应制备所述的核酸构建体，例如按照美国专利4,683,202或Saiki等(1988)描述的方法制备。核酸构建体优g是DNA构建体，这一术语将一直用于本说明书与权利要求书中.重组载体包含编码本发明的酶的DNA构建体的重组栽体可以是任何易于进行DNA搡作的栽体，栽体的选择常常取决于其所要引入的宿主细胞。这样，载体可以是自主复制栽体，即作为染色体外实体存在的栽体，其复制不依赖于染色体复制，例如质粒。另外，载体可以是这样一种，当其被引入宿主细胞时，#^^宿主细胞基因组，并且与其^ii的染色体一道复制。所述载体优选地是表达载体，在其中编码本发明的酶的DNA序列可:^作地连接到该DNA转录所需的附加区段上。一般来说，表达载体是来自质粒或病毒DNA的或可以包含它们的成分。术语"可，连接"指所述区段排列斧使它们对预期的目的协调起作用，例如转fe^启动子开始，并且经由编码酶的DNA序列进行。启动子可以是任何DNA序列，其在所选择的宿主细胞中显示转录活性，并且可以来源于编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。用于酵母宿主细胞的合适的启动子的例子包括来源于酵母糖解基因(Hitzeraan等，生物4匕学杂志.255(1980)，12073-12080;Alber和Kawasaki，分子应用遗传学杂志，1(1982)，419-434)或酒精脱氢酶基因(Young等，化学品的基因工程和微生物学(Hollaender等，编者)，Plenum出版社，纽约，1982)的启动子，或者TPI1(US4,599，3U)或ADH2-4c(Russell等，自然，304(1983)，652-654)启动子用于丝状真菌细胞的合适的启动子是例如启动子(McKnight等，TheEMB0L4(1985)，2093-2099)或fpM启动子。其它有用的启动子的例子是来源于编码下列酶的基因的那些，所述酶是米曲霉TAKA淀粉酶、//j/z咖"cor肌e/e/天冬氨蛋白酶、黑曲霉中性a-淀粉酶、黑曲霉酸稳定a-淀粉蘇、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉蘇(giuA)、^/^/z7〃co/"/w/e/e/'月旨酶、米曲霉威性蛋白酶、米曲^舜酸丙糖异构酶或构巢曲霉乙酰胺酶。优选的是TAKA-淀粉酶和gluA启动子。用于细菌宿主细胞的合适的启动子的例子包括嗜热脂肪芽孢杆菌生麦淀粉酶基因、地衣形芽旨菌a-淀粉酶基因、液/^f匕淀粉杆菌BAN淀粉酶基因、枯草杆菌碱性蛋白酶基因或短小芽^f菌^MI苷酶基因的启动子或噬菌体XP,或R启动子或者大肠杆菌"c、或"c启动子。如果需要，编码本发明的酶的DNA序列也可以可操作地与合适的终止子连接》本发明的重组栽体还可以包含使得所述栽体在所说的宿主细胞中复制的DNA序列。所述栽体也可以包含选^H生标记，例如，其产物补充宿主细胞缺陷的基因，如编码二氢叶酸还原酶(DHFR)的基因或粟酒裂殖酵母TPI基因(由P.R.Russell，基因40，1985，pp.125-130描述)。对于丝状真菌，选^r,Ji^示记包括a/z7必，af/"61、<3,^5,"/氛《为了引导本发明的酶i^宿主细胞的分泌途径，也可以在重组栽体中包含分泌信号序列(也称作前导序列、前序列原或前序列)，将分泌信号序列在正确的读框中与编码酶的DNA序列连接。分泌信号序列一般被置于编码酶的DNA序列的5'分泌信号序列可以是通常与所述酶相关的或者可以是来源于编码另一个分泌蛋白质的基罔的.为了从酵母细胞分泌，分泌信号序列可以编码伶阿信号肽，该肽确保所表达的酶以有效的方向ii^细胞的分泌途径。信号肽可以是天然信号肽或其功能性部分，或者其可以是合成氛已发現合适的信号欣是a-因子信号肽(参见美国专利4，870，008)，小鼠唾液淀粉酶信号肽(参见0.HagenbuchLe等，自然2891981,pp.643-646)，^"饰的狻肽斷言号肽(参见L.A,Vails等，细胞48、1987，pp.887-897)，酵母BAR1信号肽(参见W087/02670)或酵母天冬氨蛋白酶3(YAP3)信号肽(参见M.Eget-Mitani等，酵母，6，1990，pp.127-137)。为了在酵母中有效地分泌，也可以将编码前导肽的序列插入到信号序列的下游和编码酶的DNA序列的上游。前导肽的功能在于允许所表达的酶从内质网被引导到达高尔基体，并进一步到达分泌泡以便分泌到培养基中(即酶穿过细胞壁或至少穿过细胞膜ii^酵母细胞的周质空间的输出)。前导肽可以是酵母a-因子前导肽(其用it^在例如US4,546，082，EP16201，EP123294,EP123544和EP163529中描述)。另外，前导肽可以是合成的前导肽，这就是i充前导肽不是天然发现的。合成的前导肽可以按照例如WO89/02463或WO92/11378中的描述构建。对于在丝状真菌中的使用，所述信号肽可以方便地来源于编码/^/7e/^/7/〃s淀粉酶或葡糖淀粉酶的基因，编码M/zo/7wcar/z;/e力e/月旨酶或蛋白酶，〃w/w/co/a/3"昭//20^脂酶的基因。所述信号肽优i^是来源于编码米曲霉TAKA淀粉酶，黑曲霉中性a-淀粉酶，黑曲霉酸-稳定淀粉酶或黑曲霉葡糖淀粉酶的基因。分别用于连接编码所述酶的DNA序列、启动子以及可操作的终止子和/或分泌信号序列的方法和将它们插入到包含复制所需信息的合适载体中的方法是本领域技术人员已知的(参见，例如，Sambrook等，以上引用的)。宿主细胞引入到宿主细胞的编码所述酶的DNA序列对所说的宿主细胞而言可以是同源的或者是异源的。如果对宿主细胞是同源的，即由宿主细胞天然，则其典型地被可操作连接到另一启动子或者(可用的话)另一分泌信号序列和/或终止子序列上，而不是在其天然环境中。术语"同源的"旨在包括编码所说宿主细胞天然酶的cDNA序列。术语"异源的"旨在包括所说宿主细胞天然不表达的DNA序列'这样，所说的DNA序列可以来源于另一个生物体，或者其可以是合成的序列。本发明的DNA构建体或重组载体引入其中的宿主细胞可以是能够产生本发明的酶的任何细胞，包括细菌，酵母，真菌和高等真核细胞。经培养能够产生本发明的酶的细菌宿主细胞的例子是革兰氏-阳性菌，例如芽胞杆菌属的菌抹(如枯草芽胞杆菌、地衣形芽孢杆菌、迟緩芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、^c/7/ma/h/o/7力/7"s、液斷匕淀粉杆菌、凝结芽私fr菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽私扦菌、巨大芽胞杆菌或苏云金芽孢杆菌菌抹)或链霉菌属的菌抹(例如浅青紫链霉菌或鼠灰链霉菌的菌抹)，或者革兰氏-阴性菌，例如大肠杆菌。可以用已知方法经原生质体转化或者使用感受态细胞进行细菌的转化(参见Sambrook等，同上)。当在细菌(如大肠杆菌)中表达酶时，酶可以被保留在细胞质中(典型地是以被称作包含体的不溶4生颗粒)或由细菌分泌序列引导到周质空间中。在前一种情况下，裂解细胞，回收颗粒并变性，此后经稀释变性剂使酶再折叠。在后一种情况下，可以经裂解细胞从周质空间回收所i先酶，如通过超声波或渗透冲击以释放周质空间的内含物并回收酶。合适的酵母细胞的例子包括Sacc/a,cw7ycei15//.或^c//zosa"/arcw/cess;/7.的细胞，哞酒糖酵母或者克鲁弗酵母的特定菌抹。用于用异源DNA转化酵母细胞并且从此产生异源酶的方法在例如IIS4，599，311，US4，931，373，US4，870，008，5，037，743，和US4，845，075(所有这些本文一并参考)中有描迷。转化细胞由通过选择性标记确定的表型选择。所述选择性标记一般是对药物的抗性或者在缺少特殊营#(例如亮氨紛的情况下的生长能力.用于酵母的一个优选的栽体是US4,931,373中公开的P0T1栽体。编码本发明的酶的DNA序列可以在信号序列和可有可无的前导序列之前，例如如以上所述的。合适的酵母细胞的例子是克鲁维酵母属(如乳酸克鲁维酵母)、R^:酵母属(例如多形^L3b酵母)或毕赤酵母属(如巴斯德毕赤酵母)的菌抹(参见Gleeson等，遗传微生物学杂志1321986，pp.34593465;US4，882，279)。其它真菌细胞的例子是丝状真菌的细胞，例如"/7e/^/7/m,<y/7/7.，Z^aW鹏s/;/7.或7Wc力octe/7zai"/7/7.，尤其是米曲霉，构巢曲霉，黑曲霉或禾谷镰孢的菌來EP2"2"和EP2!J0023中描述了"/7e/^7/"ss卯.用于表达蛋白质的用途。尖镰孢的转化可以例如按照Malardier等，1989，基因78:147-156的描iti^f亍。当丝状真菌用作宿主细胞时，其可以用本发明的构建体转化，通常是将所_沈DNA构建体^i^宿主染色体中以获得重组体宿主细胞。这一整合一般^i人为是有利的，因为所述DNA构建艮可能稳定保持在细胞中。可以按照常规方法(如同源或者异源重组)将所述DNA构建体^进染色体中。然后在可以表达所i兑酶的条件下在合适的营养培养基中培养以上描述的转化或转染宿主细胞，接着从培#中回收所形成的酶。的培养基，例如含有适当补充物的最小或复合培养基。合适的培养基可以从供应商获得或者可以按照出版的(例如美国典型培养物保藏中心目录中)配方制备。然后，由所述细胞产生的酶可以用常规方法从培养基回收，所述方法包括经离心和过滤从培养基分离宿主细胞，借助盐(如硫酸铵)沉淀上层清液或滤液中的蛋白质组份，依据所述酶的类型，用各种色谱分离方法(如离子交换色诰，^H色谱，亲合色谱)纯化等。另一方面，本发明涉及产生按照本发明的酶的方法，其中在可以产生所述酶的务泮下培养^it的用编码酶的DNA序列转化的宿主细胞，并从培养物中回收所形成的酶。用分类学和生态学进行的酶筛选设计来检测和选择所-说类型的兴趣酶的象分子筛选之类的强有力的工具其自身仍不能满足需要。为了使兴^JC现的机会最大，在这一研究中将分子筛选方法与小心选择待筛选的真菌组合。通过全面考虑真菌的鉴别法、分类学类别和种系发生关系进4亍选择。如果包括生态学方法，则可以M—步地充分探讨溶纤鲦产生的分类学热点。设计聪明的筛选和取得成功的选择菌#待研究的生态小生境需要适应各种底物的全面的知识(尤其植物材料的腐生、神经营养或活体营养降解)。本文所公开的分类学和生态学方法两者的目标都是在分子筛选程序中最多地发现所述酶.然而，仍然有几百(或者如果包括了所有初期工作)几千种真菌被培养，以便检测本文报道的所说类型的溶纤酶的53个目标。可以按以下所纽行筛选和克隆才才#^方法生物体列^:,酒糖酵母DSM9770、DSM10082、DSM10080、DSM10081或大肠杆菌DSM10512、DSM10511、DSM10571、DSM10576分別含有质粒，该质粒包含在穿梭栽体pYES2.0中的编码本发明的内切葡聚糖酶的全长DNA序列。大肠杆菌DSM10583、10584、10585、10586、10587和10588。棉色二孢菌抹的保藏保藏号CBS274.96分类位置子囊菌门Uyco历yco")，腔菌纲，座嚢菌目，葫芦霉科〃/os/ora6//^ra历i7(Hawksw等)Hawksw等菌抹的保藏号NKBC1444，曰本大学，(Prof.Tubaki保藏中心)分类位置子嚢菌门，腔菌纲，座嚢菌目，(科未分类)分离自在中国云南省昆明植物园中生长的山茶的叶片(茶科，Guttiferales)分类位置子嚢菌门，腔菌纲腔菌纲，座囊菌目，(科未分类)菌抹的保藏保藏号CBS281.96分离自在秦国生长的Glycinemax(Leguminosa)cvCMM60的种子，1990分类位置子囊菌门，盘菌纲，斑痣盘菌目，斑痣盘菌科分离自挪良Svalbard，鹅粪分类位置子囊菌门，盘菌纲，盘菌目，粪盘菌科菌抹的保藏保藏号CBS275.96分类位置子囊菌门、盘菌纲，盘菌目，龚盘菌科疣孢青霉尸e/厂朋e/物种的保藏号ATCC62396分类位置子囊菌门，不整嚢菌纲，散囊菌目，发菌科产黄青霉77^/77菌抹的保藏号ATCC9480分类位置子嚢菌门，不整囊菌纲，散嚢菌目，发菌科77e/7Z70/zy^ce51Kerrwcc^i/sPugh等菌抹的保藏保藏号CBS285.96分类位置子囊菌门，不整嚢菌纲，散嚢菌目，(科未分类;affiliation基于18SRNA，测序以及同源'汰)鹿角团炭角菌厶eiCre/〃e菌抹的保藏保藏号CBS284.96分类位置子嚢菌门，尸7re/20迈ycWw，炭角菌目，炭角菌科点孔座壳(7^.ez分类位置子嚢菌门，/^re/KMycefes，炭角菌目，炭角菌科分离自在中国云南省昆明植物园中生长的山茶的叶片(茶科,Guttiferales)分类位置子嚢菌门，/yre"o/^c^"，炭角菌目，炭角菌科分离自海上样品，Bahamas分类位置子囊菌门，/^re/KMyc"es，肉座菌目，(科未分类)菌抹的保藏保藏号CBS478.94分类位置子囊菌门，/y/"e/K/77/ce"s，肉座菌目，肉座菌科蛇形镰孢J力er/^^/T菌抹的保藏号IF04467分类位置子嚢菌门，尸/re/70/77/c""，肉座菌目，肉座菌利-早熟禾镰孢(尸"^^.物种的保藏号ATCC60883分类位置子嚢菌门，/y/"e/70/z^c^"，肉座菌目，肉座菌科腐皮嫌抱0^rt乂5^cce咖diWyd》〃a"5".菌抹的保藏号IMI107.511分类位置子囊菌门，尸/re/7Cw/cW",肉座菌目，肉座菌科番荒尖嫌孢，/ycopem'c/"aCC.J5>3/d.《〃a/51.菌株的保藏号CBS645.78分类位置子嚢菌门，尸/re"o迈yce"s，肉座菌目，肉座菌科尖嫌抱/735^//7(9/"<2菌抹的保藏号CBS744.79分类位置子嚢菌门，/yre/20zz^ce/1^，肉座菌目，肉座菌利-链孢粘帚霉67"細》遍o"菌抹的保藏号CBS227.48分类位置子嚢菌门，/>re/io/n/cefes,肉座菌目，肉座菌科菌抹的保藏保藏号CBS279.96分类位置子囊菌门，/，re"6w/ce"s,肉座菌目，小赤壳科菌抹的保藏号CBS400.58分类位置子嚢菌门，/^/"e/o/77ycWd^,肉座菌目，(科未分类)大孢粪壳爿we"fra/(y物种的保藏号ATCC60255分类位置子嚢菌门，/^re/70/77/cer^，粪壳目，粪壳科粪生粪壳"。6e/^e乂Ces"/ef"e〃0/^r/s物种的保藏号ATCC52644分离自H.Dissing的粪，ISP，OJ,丹麦分类位置子嚢菌门，/yre/70/Z7yce"^粪壳目，粪壳利:灰腐质霉7Vaee"物种的保藏号ATCC22726来源HatfieldPolytechnic分类位置子嚢菌门，/y/"e/o/^c"",粪壳目，(考+未分类)黑腐质霉6to"尤菌抹的保藏号CBS819.73分类位置子嚢菌门，/yre/70/z^ce/1^,粪壳目，(科未分类)菌抹的保藏号ATCC28085分类位置子囊菌门，/y/"e/70/z^ce"s,粪壳目，(科未分类)一菌抹的保藏号CBS174.70，IM1145.136分类位置子囊菌门，Z^/"e/KM/cW"，粪壳目，毛壳科分离自蘑菇堆肥菌抹的保藏号NRRL8126分类位置子囊菌门，/^re/7^^cw"，粪壳目，毛壳科物种的保藏号ATCC62373分类位置子囊菌门，户yre/70迈/c""，粪壳目，4J^壳科分离自牙买加ii4^斯山Selandinsp(Corapositaceae，Asterales)的叶片菌抹的保藏号NKBC1515(曰本大学，profeTubaki保藏中心)分类位置子嚢菌门，/yre/K/277cefes，粪壳目，Ce/^"o鹏&ceae管毛壳/^"cire/菌抹的保藏号CBS799.83分类位置子嚢菌门，/^re/o历yce"s，粪壳目，毛壳科巴西毛壳5a〃s"ef尸o&a/菌抹的保藏号CBS122.65分类位置子嚢菌门，/yre/70/z^ce/1(^，粪壳目，毛壳科墙毛壳0r^菌抹的保藏号CBS163.52分类位置子囊菌门，/y/"e/7咖/c""，粪壳目，毛壳科菌抹的保藏号CBS547.75分类位置子囊菌门，尸/re/70/77/ce/^，粪壳目，毛壳科菌抹的保藏保藏号CBS117.65分类位置子囊菌门，/yre/7o/z^ceres，粪壳目，毛壳利-菌抹的保藏保藏号CBS272.96分离自在牙买加Christiana中生长的ArtocarpusaUUis的叶片，Moraceae，Urticales分类位置子囊菌1'，，/yre/7cvz7ycefes,7V7c/70577力ae/"/a/es,(孝+未分类)分离自云南昆明植物园的Pinusyuannanensis的叶片分类位置子囊菌门，尸/re/cw/cefes，假"4^壳目，/^/e&ceae，菌抹的保藏保藏号CBS278.96分类位置子嚢菌门，/yr，町ce/^,"/，"力a/es,黑腐皮壳科葫,科刺盘孢(Passerini)EllisetHalsted别名围小丛壳orbiculare变种JenkinsetWinstead物种的保藏号ATCC52609分类位置子嚢菌门，/^/"e/7卿7",M，黑痣菌目黑胶耳菌抹的保藏保藏号CBS277.96分类位置担子菌门，层菌纲，木耳目，黑耳科菌抹的保藏号CBS280.96分类位置担子菌门，层菌纲，蘑菇目网^&褶菇(尸rj67//.菌抹的保藏号CBS275.47分类位置担子菌门，层菌纲，蘑菇目，鬼MM层孔菌"J尸r.菌抹的保藏保藏号CBS276.96分类位置担子菌门，层菌纲，非褶菌目，Fo肌7aceaei^o/^/pe/Z/s1印.'菌抹的保藏保藏号CBS283.96分类位置担子菌门，层菌纲，非褶菌目，烟管菌科(由18S序列和同源性分类学鉴別和相联系)血^:菌(Y.K/ojW别名血红多孔菌；血红密孔菌(厶,乂菌抹的保藏号AKli5062(京都大学培#^保藏中心)分类位置担子菌门，非褶菌目，多孔菌科物种的保藏号ATCC38548分类位置担子菌门，非褶菌目，裂褶菌科菌抹的保藏号CBS282.96分类位置壶菌门，壶菌纲，5^/ze〃ofl^cefa/es，/zo迈wco/"/ws/y/i^U/'/^d^c/j/p/Jer另寸名徵小毛雾菌抹的保藏号IF04578物种的保藏号ATCC46883分类位置接合菌门，接合菌纲，毛霉目，毛霉科闪光多贞審"w/ze,K<3/77Yeg/7e/77丕Ae#0/7/7/er菌抹的保藏号IF04814物种的保藏号ATCC16327分类位置接合菌门，接合菌纲，毛霉目，毛霉科弗雷生余J枝雾K3/77eg/e/z》力e#0/7/7/er另'j名.#e//(%^^K/w/z7/>e<e/7//菌抹的保藏号NRRL2305分类位置接合菌门，接合菌纲，毛霉目，r力s咖/fl7aceae未分类的粉红单端孢菌抹的保藏号IF05372植物内寄生菌，分离自在中国云南省昆明的未鉴别的高等植物的叶片未分类和未鉴别的菌抹的保藏保藏号CBS271.96分离自牙买加Christiana生长ArtocarpusaUUis(桑科，Urticales)的叶片菌株的保藏保藏号CBS273.96分离自牙买加ii4i斯山生长的Pimentadioica(杉fe金"i良孝+，Myrtales)的叶片菌抹的保藏号CBS270.96分离自牙买加达拉斯山生长的Pseudocaly隱aUiaceum(紫葳科，Solanales)叶片其它菌沐大肠杆菌MC1061和DH10B。酵母菌沐所使用的啤酒糖酵母菌抹是W3124(MATa;ura3-52;ieu2-3，112;his3-D200;pep4-1137;prcl::HIS3;prM::LEU2;cir+)。质粒曲霉属表达栽体pHD414是质粒p775(在EP238023中描述)的书f生物。pHD414的构建在WO93/11249中有进一步的描述。pYES2.O(Invitrogen)。pA2C477,pA2C193,pA2C357，pA2C371,pA2C385,pA2C475,pA2C488，p八2C502(参见实施例1、2、3和4)。分别在SEQIDNO:1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列的分离通过用本领域已知的方法(Sambrook等(1989)分子克隆实验室手湖，冷泉港实验室，冷泉港，纽约)经抽提质粒，可以分别从保藏的生物体啤酒糖酵母DSM9770、DSM10082、DSM10080、DSM10081、大肠杆菌DSM10512、DSM10511、DSM10571或DSM10576获得全长DNA序列，这些全长DNA序列包含分别在SEQIDN0:1、4、6、8、10、12、16或19中所示的编码本发明的内切葡聚糖蘇的cDNA序列。分子筛^发明的纤维素酶的PCR引物四个简并的含JPtM^苷的寡核苷酸引物(有义；s和反义；asl、as2和as3)相应于四个高度保守氨基酸区，这些区在77/e7w/afe/ve^r/s纤纟*素、/i//Ce//。/7/7〃7。/^;力￡/"访6/3力//^7/纤乡#素醉和两种来》原、于/(ere,"/,w.的纤维素酶的推定的氨基酸序列中发现，按照/77e/"/7wp//7"/z7序列对残^iJ^号。在引物序列中脱ftJH芬由1表示，限制位点上有下划线。27jNH2-ThrArgTyrTrpAspCysCysLysPro/Thr-COOHs5'-CCCCKAGCTTACIAGITACTGGGACTGCTGCAAAAC-3'HindIIICTTTTGCNH2-TirpCysasl3'-CCACACysAlaCysACACGIACAGG111Tyr-COOHAT-Xbal145152叫-ProGlyGlyGlyLeu/ValGlyIle/LeuPhe-COOHas23,_GGICCICCICCIAAICCIAAIAACGXbaIGT193198NH2-TrpArgPhe/Tyi:AspTrpPhe-COOHas33,-CCGCIAAACTAACCAAATTGGGxbal经聚合fi^4反应(PCR)进行分子筛选基因组DNA和双链cDNA的体外扩增按照以下描述从5徵克poly(A)RNA定向合成双链cDNA.按照YeUon等的描述分离基因组DNA。在PCR緩冲液中经PCR扩增约10至20ng双链纤维素l论导的cDNA或100至200ng选择的真菌菌抹的基因组DNA,所i兑緩冲液(10幽Tris-HCl(pH8.3)、50mMKQ、1.5miMMgCl'、0.01%(w/v)明船包含200jaM各dNTP和lOOp歸l按以下全且合的各简并引物1)有义，5,_CCCCAAGCTTACIa/cGITAc/tTGGGAC/tTGC/tTgC/tAAa/gA/cC-3,反义1，5'-CTAGTCTAGATAVgCAIGCVgCAVgCACC-3''-或2)有义，5，-CCCCAAGCTTAClVcGITAc/TTGGGAc/TTGc/TTGc/TAAA/GVCC_3'反义2,CTAGTCTAGAAAIAA/G/TICCIAA/C/0ICCICCICCIGG-3.;43)有义，5'-CCCCAAGCTTACIa/cGITAc/tTGGGAc/tTGc/tTGc/tAAa/ga/cC-3'反义3，5,-CTAGTCTAGAIAACCAA/GTCAA/GA/TAICG/TCC-3一种DNA热循环仪(Landgraf，德、国)和2.5单位Taq聚合酶(Perkin-Elroer,Cetus,US).采用以下循环方式进;f亍PCR的三十个循环在94°C变性1分钟，64X:退火2分钟，72C延伸3分钟.以HaeIII-消化的(j)X174RFDNA为大小标记，通ii^3。yi琼脂糖:^(NuSieve，FMC)中的电泳分析扩增产物的10微升等^Sfc洋.PCR产物的直接测序按照制造商的"i充明^(吏用Q[AqiiickPCR纯化试剂盒(Qiagen,US)纯化PCR产物的80徵升等分试样，经双M^链-终止方法，使用50-150ng模板，Taq4^^^循环测序试剂盒(Perkin-Elmer,USA),荧光标记的终止剂'和5pmoi有义引物5'-CCCCAAGCTTACl7cGlTAC/TTGGGAC/TTGCATG"厶AAVc7cC-3'直接在纯化的PCR产物上测定扩增的PCR片段的核苷^f列。按照Devereux等的描述对序列数据进行分析。经聚合Sm^应(PCR)克lPCR片段的亚克隆#>以上所述所产生的PCR产物25徵升等分试样在0.8。M敏凝温度琼脂糖(SeaPiaqueGTG，FIC)凝皎上进行电泳，从凝皎上切下相关的片段。通过添加0.1体积10x琼脂糖酶緩冲液(NewEngUndBiotabs)和2单位八OO徵升熔化的琼脂糖到样品中，接着在""C温育1.5小时，经琼脂糖酶处理回收。用酚和三氯甲^提样品，经添加2体积96%EtOH和0.1体积3MNaAc(pH5.2)沉淀经离心回收PCR片段，在70%EtOH中洗涤，干燥和再悬浮于20徵升限制蘇緩冲液(10mMTris-HC1,lOraMMgCL,50mMNaCl，1mMDTT)中。以HindIII和Xbal消4匕片段，用S^三氯甲^:取，经2体积、96%EtOH和2体积、NaAc(pH5.2)沉淀回收，并亚克J^〃//2cUiI/J^2l-切割的pYES2.0栽体中。筛选cDNA文库和阳性克隆的特征确定。以相应的随机引导的(Feinberg和Vogelste'tn)"P-标i己的(〉lx10cpra/徵克)PCR产物作为探4十，经菌落杂交(Sambrook，1989)筛选按以下所说构建的哞酒糖酵母和大肠杆菌的cDNA文库。于65t:在2xSSC(Sambrook，1989)、5xDenhardt's溶液(Sambrook,1989)、0.5%(w/v)SDS、100jig/rai变性給睛DNA中进行杂交20小时，接着于25t:在5xSSC(2x15分钟)中、于65t:在2xSSC、0.5%SDS(30分钟)中、于65X:在O.2xSSC、0.5。/。SDS(30分钟)，^J&于25"C在5xSSC(2x15分钟)中洗涤，采用以下方法确定阳性cDNA克隆的特征，所述方法是用pYES2,0多接头引物(Invitrogen，USA)测序cDNA插入物的末端，用双M^链终止法(Sanger等)采用荧光标记的终止剂测定两条链的最长cDNA的核苷酸序列。按照制造商的说明，采用应用生物系统373A自动测序仪，用Taq脱氧末端循环测序试剂貪(PerkinElraerUSA)和[3YES2.0多接头引物(InvUrogen，USA)或合成寡核苷酸引物测序Qiagen纯化的质粒DNA(QiagenUSA).按照t)evereux等描迷的方法进行序列数据分才斤-用硫氰^ii行总RNA的抽提，接着经5-7MCsCl垫层超离心法，采用W094/14953中描述的方法经寡(dT)-纤维素亲合色谱法进行poly(A)HNA的分离。cDNA合成采用RNaseH方法(Gubler和Hoffman(1983)基因25:263-269，Sambrook等(1989)分子克J^:实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，NY)用F.S.Hagen(pers.comm.)开发的发夹j务饰从5微克poly(A)'RNA合成双链cDNA在预i^/(匕的无核糖核酸蘇的Eppendorph试管中于70t:加热poly(A广RNA(在5pi1DEPC处理的水中的5ng)8分钟，在冰上骤冷，添加逆转录酶緩冲液至终体积50微升，所述逆转^al:緩冲液(50mMTris-Cl(pH8.3)、75mMiCCl、3raMMgCL，lOraMDTT，Bethesda研究实验室)包含lmMdATP、dGTP和dTTP;0.5raM5'-甲基-dCTP(Pharmacia);40单位人类胎盘核糖核酸醉抑制剂(RNasin，P謂ega);1.45徵克oligo(dT),广NotI引物(Pharmacia)以及1000单位S叩erScript11核糖核酸酶H逆转录餘(Bethesda研究实验室).通it^45C温育反应混合物1小时合成第一链cDNA'在合成之后，将mRNA:cDNA杂交混合物按照制造者的i先明经MicroSpinS-40.0HR(Pharmacia)旋转柱凝胶过滤。在凝胶过滤之后，将杂交体用第二链緩冲液稀释，所述緩冲液(20raMTris—HC1(pH7.4)、90raMKC1、4.6raMMgCl!、lOraM(NH山SO"0.16mM(NAD+)包含200nM各种dNTP、60单位大肠杆菌DNA聚合酶l(Pharmacia)、5.25单位核糖核酸酶H(Proraega)和15单位大肠杆菌DNA连接酶(Boehringer曼海if)。通it^16t:下温育反应试管2小时和在25X:下温育15分钟进行第二链cDNA合成。由添加乙二胺四乙酸至最终浓度20mM终止反应，其后用e^三氯甲;^^提。Mung大豆核酸酶处理通过于-20X:下添加2体积的96%EtOH、0.2体积的10MNHMc沉淀双链cDNA12小时，离心回收，用70%EtOH洗涤，干燥并再悬浮于30徵升Mung大豆核酸酶緩冲液中，该緩冲液(30mMNaAc(pH4.6)、300raMNaCl,lraMZnSO,，0.35raMDTT，2%甘油)包含25单位Mung大豆核酸酶(Pharmacia).通过在30X:温育反应物30分钟，接着添加70徵升lOmMTris-HCl(pH7.5)、LmM乙二胺四乙酸，笨酚抽提以及在水上用2体积96%乙醇和0.1体积3MNaAc(pH5.2)沉淀来剪切单^C夹DNA。用T4DNA聚合Sl4t化末端离心回收双链cDNA，在30徵升含0.5mM各种dNTP禾口5单位T4DNA聚合酵(NewEnglandBiolabs)的T4DNA聚合酶緩冲液中16C温育1小时，使末端钝化。加入EDTA至终浓度20mM，然后用笨fid^氯仿提取，加入2体积96%EtOH和0.1体积3MNaAc(pH5.2)于-20。C沉淀12小时。衔接子连接，Not1消化和大小选#:在填充反应完成后，经离心回收cDNA,用70%EtOH洗涤并干燥。将cDNA沉淀重悬于25徵升连接緩冲液中，所述緩冲液(30raMTris-HCl(pH7.8)、lOmMMgCl!、10raMDTT、0.5mMATP)包含2.5微克非回文BstXI衔接子(lnvitrogen)和30单位T4连接酶(Proraega)，在16C温育12小时。通过在65"C加热20分钟然后在水上冷却终止反应。连接的cDNA用NotI限制酶消化，其是通过添加20徵升水，5徵升10xNotI限制绛緩冲液(NewEnglandBioiabs)和50单位NotI(NewEnglandBioUbs)，接着在371C温育2.5小时进行的.65C加热10分钟终止反应。经凝皎电泳在1xTBE中的0.8%SeaPlaqueGTP4氐溶化温度琼脂糖凝胶(FMC)上大小分级分离cDNA，以分离未连接的衔接子和小的cDNA。按照制造者的"i兑明，由切下0.7kb并用P-琼脂糖酶(NewEnglandBiolabs)从^&^:援出，并且于-20C添加2体积96%EtOH和0.1体积3MNaAc(pH5.2)沉淀12小时^i^阡cDNA的大小i^择。文库的构建通过离心回收定向的、选择了大小的cDNA，在70%EtOH中洗涤，千燥并悬浮在30nl的lOraMTris-HCl(pH7.5)，lraMEDTA中。按照制造厂商的说明通过MicroSpinS-300HR(Pharmacia)旋转;^行剿险过滤使cDNA脱盐'在10^1包含5^1双链cDNA(反应试管#1和#2)、15单位的T4连接酶(Proraega)以及30ng(试管im、40ng(试管并2)和40ng(试管#3，栽体背景对照)的BstXI-Notl裂解的pYES2.0栽体的连接緩冲液(30mMTris-HCl(pH7.8)、lOmMMgCL、L0raMDTT、0.5raMATP)中进行三种试验连接'通ii^ti6x:下溫育i2小时、在70x:下加热20分钟、然后向每个试管添加10^U的水进行连接反应。如上所迷把的每种连接混合物电穿孔进40^x1电感受态的(electrocompeteiU)大肠杆菌DH10B细胞(Bethesda研究实验室)中(S認brook等，(1989)分子免隆实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，NY).使用最优条件在包含库的大肠杆菌中建立文库。各库通过在LB+氨千青霉属素琼脂平板涂布转化的大肠杆菌并在37C下培养24小时产生15000-300G0克隆/平板制作'把^tnlLB+氨苄青審素添加到平板上并悬浮细胞。使细胞悬浮液于37匸下在50ml试管中振荡1小时。使用QIAGEN质粒试剂盒按照按照制造厂商的说明从细胞分离质粒DNA并在-20"C下保存。把得自各个库的纯化质粒DNA(100ng/nl)的等分试样通过电穿孔转4说啤酒糖酵母W3124中(Becker和Guarante(1991)蘇学方法，194:182-187)，把转化体平板接种于包含2%葡萄糖的SC琼脂上并在30i:下培养。阳性菌落的筌别在生长3-5天之后，把琼脂平板复制接种于一组包含0.1%AZCLHE纤维素的SC+半乳l尿嘧啶琼脂平板上。将这些平板在30C下培养3-7天。内切葡聚糖酶阳性菌落妄定为蓝环围绕的菌落。为了在琼脂上分离单个菌落，涂布得自fi^"阳性菌落的细胞，为了筌别产生内切葡聚糖酶的菌落，选择产生酶的单个菌落。阳性克隆的鉴定阳性克隆作为单个菌落获得，使用生物素化的多接头引物直接从酵母菌落扩增cDNA插入片段，通过磁性小珠(DynabeadM-280，Dynal)系统纯化，并通过使用链-末端方法(Sanger等(1977)美国科学院学报，74:5463-5467)和Sequenase系统(美国生物化学)测定每个cDNA克隆的5'-末端序列单个地确定其特征。使用荧光标记的终止子通过双脱氧链终止方法(Sanger等)测定得自两务逸的最长cDNA的核苷酸序列.通过如下所述转4^大肠杆菌救援(rescue)质粒DNA。<吏用AppliedBiosystems3"A自动测序仪按照制造厂商的i兑明用Taq/K^末端循环测序试剂盒(PerkinElraer，US)和pYES2.0多接头引物(Invitrogen，USA)或合成的寡核苷酸引物测定Qiagen纯4匕的质粒DNA(Qiagen，USA)的序列'序列数据的分析按照Devereux等进4f。在曲霉中表达的cDNA基因的分离把产生内切葡聚糖酶的酵母菌M种于在50ml玻璃试管中的20ralYPD培养液中.试管在30t:下振荡2天。通过在3000rpm下离心10分钟收获细胞。按照WO94/14953分离DNA并将其溶解在5(Hil水中。通过标准方法把DNA转4I^4大肠杆菌。^f吏用标准方法从大肠杆菌分离质粒DNA并通过限制酶分析进行分析。使用适当的限制酶切除cDNA插入片段并连接进曲霉表达栽体中。米曲霉或黑曲霉的转化如WO95/02043的16页，214亍-17页，124亍(本文一并参考)所述制备原生质体。把100pl的原生质体悬浮'液和5-25ng在10pLSTC(l.2M山梨醇，10mMTris-HC1，pH=7.5，lOmMCaCL)中的适当DNA混合将原生质体与p3SR2(携带A.nidulansamdS基因的质粒)混合'混合物在室温下放置25分钟。添加O.2ml60%PEG4000(BDH29576)、lOraMCaCl"10mMTris-HCl(pH7.5)并小心地混合(两次)，^J&添加0.85mL的相同溶液并小心地混合。混合物在室温下放置25分钟，在2500g下旋转15分钟，把沉淀悬浮在2ml的1.2M山梨醇中。在再次沉淀之后把原生质体涂布在最小的包含l.OM蔗糖(pH7.0)',lOmM乙St^ft为氮源以及20mMCsCl以抑制背景生长的平板上(Cove,生物化学学报，113(1966)5卜56)。于37C下培养4-7天之后，选择孢子并涂布以形成单个菌落。重复该过程，保存第二次再分离之后的单个菌落的孢子作为所定义的转化体。米曲霉转化体的试验把每个转化,种在10ml的YPM中并繁殖。在于37n下接种2-5天之后，除去lOral的上清液。如上所述通过AZCLHE纤维素筌别内切葡聚糖酶活性。用于评价本发明的DNA构建体的性质ii)的杂交条件测定核苷酸探针和同源DNA或RNA序列之间的杂交的^it务阵包括在5xSSC(标准柠檬酸盐)中预浸渍包含待杂交DNA片段或RNA的滤膜10分钟，滤膜在5xSSC(Sambrook等1989)、5xDenhardt's溶液(Sambrook等1989)、0.5。/。SDS和100ng/ml变性的声处理的給睛DNA(Sambrook等1989)中预杂交，然后在包含随机引物的(Feinberg，A.P.和Vogelstein,B.(1983)生物化学年评，132:6-13)、32P-dCTP-标记的(比活>1x10Vpm/Kig)的探针的相同溶液中于约45t:下杂交12小时u然后滤膜在2xSSC、0.5%SDS中洗涤两次30分钟，温度优选地不高于50X:，更优选地不高于55C，更优i^是不高于60t:,更优il^是不高于70X:，尤其是不高于75r。用于杂交的核苷酸探针是对应于分別在SEQ1DN0:1、4、6、8，、10、12或16中所示的DNA序列和/或分别可以从在,酒糖酵母DSM9770、DSM10082、DSM10080、DSM10081，大肠杆菌DSM10512、DSM10511、DSM10571或DSM10576中的质粒获得的DNA序列的内切葡聚糖酶编码部分的DNA序列。免疫交M应用于测定免疫交H应的抗体可以通过^t用纯化的纤維素酶制备。更具体地说，抗本发明的纤维素酶的抗血清可通过按照N.Axelsen在"定量免疫电泳手册"，Blackwel1科学出版社，1973，23章中或A.Johnstone和R-Thorpe，实践免疫化学，BLackweU科学出版社，1982(更具体地说在27-31页)中描述的方法制备.纯化的免疫球蛋白可从抗血清获得，如通过盐沉淀((NHO!S(K)并进行渗析和离子交换色谱(如在DEAE-Sephadex上)。蛋白质的免疫化学定性可通过Outcherlony双扩散分斗斤(O.Ouchteriony:试验免疫学手册(D.M.Weir,Ed.),BlackweU科学出版^土，1967,655-706页)、交叉免疫电泳(N.Axelsen等，同上，第3和4章)或火箭免疫电泳(N.Axetsen等，第2章)完成。培养基YPD:10g酵母提取物，20g蛋白胨，加H2O至900ml。高压灭菌，添加100rai20%的葡萄糖(无菌过滤的)。YPD:10g酵母提取物，20g蛋白胨，加H'0至900ral。高压灭菌，添加100ml20%的麦芽糖糊精(无菌过滤的)。10x碱盐(baselsalt):75g酵母^^(nitrogenbase),113g琥銷酸，68gNaOH，加H20至1000ml，无菌过滤。SC-URA:100ral10x碱盐，28ml无维生素的20%^"^^酸，10ml1%的色氨酸，加HzO至900ml，高压灭菌，添加3.6ml5X苏氨酸以及100ml20%葡萄糖或20%半孔糖。SC-URA琼脂SC-URA,添加20g/l琼脂.PD琼脂39g马铃薯右旋糖琼脂，DIFCO0013;添加去离子水至1000ml;高压灭菌(121C下15-20分钟)。PC琼脂马铃薯和胡萝卜(研磨，每种20g)，添加水至1000ml，煮沸1小时；琼脂(20g/1Merck1614);高压灭菌(121t:下20分钟)。PC液态培养l如PC琼脂，但没有琼脂。PD液态培养^:24g马钤薯右旋糖培养液，Difco0549,添加去离子水至1000ml;高压灭菌(121t:下15-20分钟)。具有纤维素的PC和PD液态培养l每1000ml添加30gSolcafloc(Dicacel^r从Dicalite—Europe—Nord，9000Gent，t匕矛'J时获得)。PB-9液态培养^:把12gRofec(Roquette10卜0441)和24g葡萄糖添加至1000nU水中；把pH值调整到5.5;每1000ml添加5ml矿物油和5gCaC(L。高压灭菌(121X:下40分钟)。YPG液态培养基4g酵母提取物(Dirco0127)，lgK隨恭rck4873)，0.5gMgSOr7H20Merck5886，15g右旋糖，Roquette101-0441,0.1mlPluronic(101—3088);添加去离子水至1000ml;高压灭菌(121x:下20分钟)稀释盐溶液(DS):制备两种母液P—母液13.61gKH恶;13.21g(NHO2P(^,17.42g添加去离子水至100ml。Ca/Mg母液7.35gCaCh.2H20，10.17gMgClr6訪，添加去离子水至100ml;把pH值调整至7.0;高压灭菌(121t:;20分钟)把0..5raiP-母液和0.imlCa/Mg母液混合添加去离子水至1000mlAZCLHE纤维素(Megazyrae，澳大利亚)。用途在洗涤和穿着过程中，染色的织物或衣物的染料通常渗色，从而使衣物看起来已褪色和穿旧。从织物表面除去纤维将部分地恢复织物初始的颜色和外》見。本文所使用的术语"颜色澄清"是指通过多次洗涤循环织物或衣物的初始颜色部分地恢复术语"除去丸状物"指从织物表面除去丸状物。术语"浸泡液体"指这样的一种含水的液体，要洗的衣物在进行常规洗涤过程前要浸泡在其中。浸泡液体可包含一种或多种通常用于洗涤或洗涤方法的纟且分。术语"洗液"指这样的一种含水的液体，在其中要洗的衣物进行洗涤过程，即通常是一种手工或在洗;^L中的化学或机械结合的作用。通常，洗^A粉剂或液体洗涤剂组合物的水溶液。术语"冲洗液体"指这样的一种含水的液体，为了冲洗要洗的衣物，即实质上从要洗的衣物中除去洗涤剂溶液，在其中浸泡并处理要洗的衣物，通常是在洗涤过程之后立即进行-冲洗液体可包含织物条理或软化组合物按照本发明的方法要洗的衣物可以是常规的可洗的衣物。优i4A，要洗的衣物的主要部分是缝合或未缝合的织物，包括从棉制造的编织物(knits)、编织物(wovens)、斜⑩棉布、纱线和毛巾、棉混纺物或天然或人造纤维素(如制自包含木聚糖的纤维素织物，如制自木浆)或其混合物。混合物的例子是具有一种或多种辅助材料的棉或人造纤维/纤维胶(如羊毛、合成纤维(如聚耽胺纤维、丙烯酸纤维、聚酯纤维、聚乙烯醇纤维、聚氯乙蜂纤维、聚偏二氯乙烯纤维、聚氨甲酸乙酯纤维、M纤维、aramid纤维)以及包含纤維素的纤维(如人造纤维/纤維胶、苎氛亚麻/亚麻布、黄氣乙酸纤维素纤维、LyoceU)。洗涤剂組^y按照本发明的一个方面，本发明的内切葡聚糖酶可典型地是洗涤剂组合物的组分。同样地，它们可以以非尘状粒剂、稳定液体或受保护的酶形式包括在洗、涤剂组合物中。非尘状粒剂可按照，如在US4,106,991和^"l，"2所(二者都属于NovoIndustriA/S)/>开的方法产生并可有可无地按照^域的方法包礼蜡状的表面盖覆剂的例子是平均分子量为1000至20000的聚(环氧乙烷)产物(聚乙二醇，PEG);具有16至50个环氧乙烷单位的乙M^匕的壬勤^;乙M化的脂肪醇(其中醇包含12至20个^J^、子，具有15至80个环氧乙烷单位)；脂肪醇；脂肪酸；脂肪酸的甘油单、双和三酸酯。在专利GBM83591中给出了通过流化>^技术制成的适于应用的形成薄片的表面盖覆剂的例子。如液态鲦制剂可按照已制定的方法通过添加多羟基化合物(如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼紀稳定。其它酶德定剂在本领域中是已知的。受保护的酶按照在EP238，216中公开的方法制备本发明的洗涤剂组合物可以是任何方便的形式，如粉剂、粒剂、糊剂或液体。液体洗涤剂可是水溶液，典型地包含多达70%的水和0-30%的有^剂，或非水溶液。洗涤剂组合物包含一种或多种表面活性剂，每种活化剂可以是阴离子、非离子、阳离子或两性离子的，洗涤剂通常包含0-50%阴离子表面活性剂，如线性^^笨嗜酸盐(LAS)、a-烯烃橫酸盐(A0S)、)^统酸盐(脂肪醇辟^酸酯)(AS)、脂肪醇乙M"^i酸盐(AEOS或AES)、仲坑烃碌酸盐(SAS)、a-疏代脂肪酸甲基酯、；^或烯^4^珀酸或皂。它可以包含0-40%的非离子表面活寸生剂，如脂肪醇乙l基化物(AEO或AE)、羧化的脂肪醇乙M^匕物、壬基酚乙M化物、H聚苷、歉基二甲胺氧化物、乙氡基化的脂肪酸单乙醇跣胺、脂肪酸单乙醇耽胺或聚羟烷脂肪酸^Jfe(如如在WO92/06154中所描述的)。洗涤剂组合物还可包含一种或多种其它酶，如淀粉酶、脂酶、角质酶、蛋白酶，过氧化物酶和氧化酶，如^l"。洗涤剂可包含1-65%洗涤剂助洗剂或配位剂，如滞石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸酯、柠檬酸盐、次^^^乙酸(NTA)、乙二氨四乙酸(EDTA)、二乙三胺五乙酸(DTMPA)、^&或烯基琥珀酸、可溶'liii酸盐或层珪酸盐(如得自Hoechst的SKS-6)。洗;M^也可无助洗剂，即实质上不含洗涤剂助洗剂。洗涤剂可包含一种或多种聚合物。例子是羧甲基纤维素(CMC)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚羧酸酯，如聚丙烯酸酯、马来^/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月^^酯/丙烯酸共聚物。洗涂剂可包含漂白系统，该系统包含H晶源，如与形成过酸的漂白活化剂(如四乙基乙二胺(TAED)或壬耽氧苯磺酸盐(NOBS))结合的过邻酸盐或过碳酸盐.另外，漂白系统可包^it酸，如耽胺、酰亚胺或巩型。本发明的洗条剂组合物的酶可以使用常规的稳定剂稳定，如多羟基化合物(如丙二醇或甘油)、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物，如芳族硼酸酷，组合物可按照在如WO92/19708和WO92/19709中所述制成制剂。洗涤剂也可包含其它常规的洗涤剂组份，如织物调理剂，包括粘土、泡,助剂、抑泡剂、抗腐蚀剂、污物悬浮剂、抗污物再沉积剂、染料、杀菌剂、荧光增白剂或香料。pH(于使用浓度下在水溶液中测量)通常是中性或威t生的，如在7-11的范围内。在本发明的范围之内洗涤剂组合物的具体形式包括<table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>2)—种制成粒剂的具有至少600g/l的堆密度的洗涤剂组合物，该组合物包含<table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>7)—种制成粒剂的具有至少600g/1的堆密度的洗涤剂组合物，该组合物包含<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table>0-3%16)如在1)-15)中所述的洗涤剂制剂，该制剂包含作为另外的组分或作为已经指出的漂白系统的替代物的稳定或胶囊化的过酸。17)如在l)、3)、7)、9)和12)中所述的去垢组合物，其中所:说的过硼酸盐被过碳酸盐替代。18)如在l)、3)、7)、9)、12)、14)和15)中所述的去垢组合物，该组合物还包含锰催化剂.猛催化剂可以是，例如在"用于低温漂白的有效的猛催化剂"，自然369，1994,637-639中所描述的一种化合物。19)制成非水溶液洗涤剂液体的去垢组合物，该组合物包含液态非离子表面活性剂如线性的烷M化伯醇、助洗剂系统(如磷酸盐)、酶和碱。洗涤剂也可以包含阴离子表面活性剂和/或漂白系统。内切葡聚糖酶可以以通常用于洗涤剂的浓度掺入。它包含在本发明的洗衣组合物中，纤维素酶可以以对应于每升洗液中0.0001-10mg(以纯4匕的酶蛋白质计算)的纤维素酶添加。按照本发明的另一个方面，内切葡聚糖酶可典型地是织物调节剂或软化组合物的组分。通常的软化组合物的例子在例如EP0233910中公开。坊织中的应用在另一个实施方案中，本发明涉M发明的内切葡聚糖酶在生物抛光过程的用途。生物抛光是纱表面的特异'汰处理，这种处理改进了织物的手感和外观的质量，而不失去织物可湿性。生物抛光最重要的作用可通过纟艮少起毛和形成丸状物、增加光彩/光泽、改进的织物手感、增加的耐用软度以及改变的吸水能力表征。生物抛光通常发生在4f织和编织的织物制造的湿处理之中。湿处理包含如下步騄脱浆、冲洗、漂白、洗涤、染色/印花和涂饰。在每个这样的步骤期间，织物或多或少地进行机械作用。通常，在针织和编织织物之后，织物进行到脱装阶段，其后为冲洗阶段等。脱装是从织物除去浆糊的作用。在机械织机上编织之前，为了增加弯曲的纱线的抗张强度，常常用浆糊淀粉或淀粉衍生物包被。在编织之后，装糊包被物在进一步处理织物之前必须除去以确保均匀和防洗效果。已知为了达到生物抛光的效果，需要溶纤和机械作用的组合。还已知当用纤维素酶处理和用软化剂的常规处理结合时可达到"超软化"。可以设想本发明的内切葡聚糖酶用于纤维素织物的生物抛光是有优势的，如可达到更彻底的抛光。生物抛光可通过应用例如在W093/20278中所描迷的方法获得。石洗裤以提供所需的织物颜色的局部发亮或通过餘&处理织物(具体来说是用"石洗的"外观(局部颜色磨损)。可以单独(如在US4，832，864中所公开的)或与比在传统的方法较少量的浮石一起或与珍珠岩一起(如在W095/09225中公开的)进行本发明的内切葡聚糖酶的处理.纸浆和紙上的应用在ii^纸浆工业中，本发明的内切葡聚糖酶有利地应用到如下方面-用于剥树皮^^W^转筒中剝树皮之前，用内切葡聚糖酶的预处理可降解形成层，从而有利于节能。-用于脱纤维因为纤维素酵对内部纤维表面的水解作用，在精制或打浆之前用内切葡聚糖酶处理含纤维素纤维的材料可导致能量消耗的减少。使用内切葡聚糖酶与使用已知的酶相比可导致改进的节能，因为人们相信本发明的酶组合物具有更高的穿透纤维壁的能力。-用于纤维改性，即纤维性质的改进，其中需要^跨纤维壁的部分水解，这需要更深的穿透酶(如为了使扭险的纤维更柔韧).迄今为止，纤维的深度处理对高产量的纸浆(如机械紙浆或再循环纸浆的混*)是不可能的'这归结于纤维壁结构的性质(因为纤维壁的孔基质的物理限制，该性质阻止S^子的通过).设想本发明的内切葡聚糖酶能渗入纤维壁。-排水改t造纸紙浆的排水能力可通过用水解酶(如纤维素酶)处理纸装得到改进.木素纤维素纸浆的处理可按照例如在WO91/M819、WO91/14822、WO92/18688和WO92/17573中的描iti^行'植物材料的降解在另一个实施方案中，本发明涉及按照本发明的内切葡聚糖酶和/或酶制剂用于植物材料(如细胞壁)降解的用途。本发明涉及为了增加产量在酒、水果或蔬菜汁中应用本发明新内切葡聚糖酶和/或酶制剂。按照本发明的内切葡聚糖务&可用于各种植物细自生的材料或废材料的齊&水解，如农业残余物，如麦秸杆、玉米穗轴、整抹玉米植物、核果壳、草、蔬菜壳、豆壳、谷壳、甜菜浆等。为了改进不同种类的加工、M其它组分的纯化或提^取(如从谷物中纯化P-葡聚糖或e-葡聚糖4氐聚物)、改进食物价值、减少水结合量、在废水植物中提高降解、提高(:jjcn^草保藏法的草和谷类的)转化等，可以降解植物材料。下列实施例i兑明本发明。实施例1通*达克隆检测了4种真菌的溶纤酶，这4种真菌属于子嚢菌纲的两个目之内的3个科；测定了相应的DNA序列；异源表i^通过液体发酵产生的酶在颜色澄清测定中进行特征分析，表明其具有良好的性能。4吏分离物CBS117.65、CBS478.94、NRRL8126和ATCC10523在振荡烧瓶培养器中在富含纤维素的马铃薯右旋糖培养液中生长，在26x:下培养5天(振荡M,150rpm)。ferre"r/s和Ko/wfe//aco〃"o/z7由/^y的内切葡聚糖膝的克J^fo表达分另,1分离f力e/wo/7力/7a、/fcre/z/o//w历,7^/e/ai^/aferre"r/s和"//"ofr/c/jo/o^的mRNA，这些生物体生长在含有纤维素的发酵培养基(振荡培养基以确保充分换气)中。在生长3-5^J^收获菌丝，立即把菌丝在液氮中冷冻，并且储存在-80X:下。在所描述的大肠杆菌中利用1%的栽体背景分別构建外"//0/7/"0/"3.fA"/^/^/"义cre迈o//"迈印.，7^/e/a"aferre"r/s和Ko/wteZ/a00//^0"/(^0/&;5的文库，每个il^中含有大约106个单个克隆.把每一个文库的一些集合的质粒DNA转化到酵母中，从每一个集合中得到了含有250-400个酵母菌落的50-100个平板'利用AZCLHE纤维素测定法在SC-琼脂平板上答别和分离内切葡聚糖酶-阳性菌落.从酵母菌落直接扩增cDNA插入物，并且利用以上材料和方法部分中描迷的方法进4亍4生质分析。S印IDNO:1显示了编码/^^//^/^力0,3Z力e/7770/)/7//3的内切葡聚糖膝的cDNA的DNA序列，SEQIDN0:1也显示了相应^J^^^列.从DSM9770的质粒中可以获得此cDNA。编码/lc,e麵/咖m.的内切葡聚糖酶的c隐的,序列列于seqidno:4中，相应^J^复宇列列于SEQIDNO:5中。从DSM10082的质粒中可以获得此c眼。编码77/>/a^3f"reW/7s的内切葡聚糖酶的cDNA的DNA序列列于SEQiDNO:8中，相应^J^酸序列列于SEQIDNO:9中。从DSM10081的质粒中可以获得此cDNA。编码K。/wfe"aco"e/o"ic/o油s的内切葡聚糖醉的c眼的■序列列于SEQ.IDNO:16中，相应#^酸序列列于SEQIDNO:17中。从DSM10571的质粒中可以获得该cDNA。从酵母菌落分离出总DNA，并且通过转化以上所述的大肠杆菌救援质粒DNA。为了在束曲霉属中表达内切葡聚糖酶，用适当的限制性内切酶消化DNA,在凝胶上进行片断分级分离，分别纯化与#yce//op/^/7orac6>//"o"/c/o/Ve;内切葡聚糖酶基因相应的片段，其后把基因连接到用适当的限制性内切酶消化的pHD414中，分别形成了质粒pA2C357、pA2C193、pA2C385和pA2C488在大肠杆菌中扩增DNA之后，把质粒转化到以上所述的米曲霉中。米曲霉转化体试验如上所迷试验争个转化体的内切葡聚糖酶的活性。一些转化体比米曲霉背景具有更大的内切葡聚糖酶活性。*明了在米曲霉中内切葡聚糖酶的有"达'利用YPM培养基在500ral銜阮中选#^接种了具有最高的内切葡聚糖酶活性的转化体.在发酵(为确保良好的通气进行充分的,)3-5天后，把培养'液以2000g离心10分钟，并且回收上清液.B.内切葡聚糖酶活性的测定可以测定内切葡聚糖酶相当于分析标准物的溶纤活性，并且以单位S-CEVU表示。溶纤酶水解CMC,因此减少了培养混合物的粘度。可以通过振动粘度计(例如法国Sofraser，MIVI3000)测定产生的粘度减弱。可以按照AF301.1分析方法进行以S-CEVU测量的溶纤活性的测定，这种方法可以向本申请人索取。通过测量样品的减少羧甲基纤维素(CMC)溶液粘度的能力，S-CEVU测定方法量化了样品中的催化活性。测定在纟OX:、pH7.5的条件下进行，同时利用了降4氐CMC底物粘度的相关的酶标准物。利用磷酸饱和纤维素(PASC)以SAVI单位测定内切葡聚糖酶活性的'测定方法定义1SAVI-U是形成一定量的还原碳水化合物(相当于每分钟lnmol的葡萄糖)的酶量。测定条件酶溶液0.5ml0.1M緩冲'液中的4g/PASC:2.0ml20分钟，40匸敏感性最大0.1SAVIli/raH大约1S-CEVU/ral(CMC粘^D最小0.01SAVIU/ral-大约0.1S-CEVli/ml还原糖形成的测定按照Lever,M.比色法测定碳水化合物的一种新反应(生物化学年报1972.vol47(273-279))进行还原基团的测定。通过把1.5克对羟笨甲酸氢酸(PHBILH)和5克酒石酸钠在100ml的2%氢氧化钠中混合制备试剂混合物。底物利用水冻丙酮和砩酸按照下面的方式制备PASC贮液。把5克纤维素(Avicel)用水湿润，加入150ml85°/。的冰冻正磷酸把混合物放置在冰浴中，緩'度撹拌l小时。然后加入IOOml水冻丙酮并且搅拌。把浆液转移到带有烧结的3号pyrex盘的Buchner过滤器中，并且用;水冻丙鲖洗涤三次，每次洗涤之后尽可能吸干。^J&把滤饼用500ml水洗涤两次，每次洗涤之后尽可能吸千把PASC与去离子水混合，使总体积达到300ml，均匀混合(使用超Turrax均化器)，并且保存在冰箱中(达一个月)。用緩冲液平衡底物20克碑酸饱和的纤维素PASC贮液以5000rpm.离心20分钟，倒出上清液；沉淀在30ml緩冲液中再悬浮并在5000rpm.下离心20分钟。倒出上清液，将总共60克的沉淀以5克纤维素/升的浓度悬浮在緩冲液中。pH8.5的测定緩冲液0.1M巴比妥。p'HIO的测定緩冲液0.1M甘氨酸。方法1.S^样品的^^释将酶溶液在与底物相同的緩冲液中稀释。2.酶反应将緩冲溶液中的底物在42X:下预热5分钟(2ml)。然后加入0.5rol酶溶液(稀释至0.2-1S-CEVU/ml)，混合5秒钟。通it^酶溶液中添加终止试剂获得酶空白。40^:下培养20分钟。通过加入0.5ml2%NaOH溶液并混合5秒钟终止反应。将样品以5000rpm.离心20分钟。将1ml上清液与0.5mlPHBAH试剂混合，并且煮淬10分钟。试管在水水浴中冷却。3.还原末端基团的确定使用分光光度计在410nm测量吸收率。通过在加入酶溶液之前加入氢氧化钠制备空白。利用在相同緩冲液中的5，10,和25mg/1浓度的葡萄糖和在煮沸之前加入PHBAH试剂获得葡萄糖标准曲线。利用标准曲线计算释放的还原葡萄糖当量。4.催化活性的计算测量410nm的吸收率1)标准曲线(葡萄糖)-(H，O)对葡萄糖的浓度2)酶样品(样品)-(空白)按照标准曲线计算葡萄糖浓度活寸生(SAVLLI/ml):X(mg葡萄糖/1)*稀幹液_180.16(葡萄糖的分子量)*20(分钟)C./e/77o/7力/的内切葡聚糖酶的纯化和性质分析将pA2C193转化的米曲霉在YPM培养基上培养4天。然后将液体离心并无菌过滤。利用20kD阈值的DOW膜GR61PP通过在AMIC0N室中的超滤作用浓缩样品。分析超滤浓缩物的S-CEVU/ml和SaviU/ral，得到下列结果<table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table>纯化把2毫升UF-浓缩物稀释5倍，以降低其离子强度，并通过0.22nm圓板过滤器过滤。将样品加入到用50raMTris/HCl緩冲液(pH7.5)平衡的MonoQHR/5Pharmacia柱上，流速为1毫升/分钟。在用緩沖液A洗MJiJ基线时，用含有lMNaCl(緩沖液B)的Tris/HCl緩冲液(pH7.5)，梯度洗脱是在1小时之内緩冲液B从0-50%变化。36分钟后，出现高峰复合物，收集每份lml的流份，将最初的10个流份在羧甲基纤维素/琼脂糖/刚果红的平板上显示纤维素酶活性。合并这些流份，并利用20kD阈值的D0W膜GR61PP通it^AMIC0N室中的超滤作用浓缩至3毫升将样品加入到用100raMTris/HCl緩冲液(pH6.35)平衡的HiLoad2660Superdex75TMprep梯度Pharmacia^LL,;线为1毫升/分钟。82分钟后，出现高峰，每份lml收集流份，最初的10个流份在羧甲基纤维素/琼脂糖/刚果红的平板上显示纤维素酶活性合并这些流份，得到的结果如下Aw=0.15A'ro/Am=1.62Mw(SDS)-22kDpl=3.5-5SDS-PAGE上的纯度=100%S-CEVUM=28.5S-CEVU/mg=436消光系数=54880(计算的)Mw(计算的)-22kD消光系数是以由所附的SEQIDNO:1(^J^^列)的序列计算的酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸的含量为基础。在NOVEXPre-Cast疑欧4-20%Tris-甘氨酸^JH1.0raraxlO孔上进行SDS-Page。在PharmacUPAG板(pH3.5-9.5)上进行IEF，由羧甲基纤维素-刚果红覆盖显现出活性。"和K:。"的测定在pH8-5和底物浓度多达8克/毫升的情况下，以与测定SAVI单,同的方式测定L和IU,。得到下列结果L为38/每秒，L为5g/1，磷酸饱和纤维素，pH8.5。在pH7.5时对羧甲基纤维素的比活性每毫克蛋白质436S-CEVU。D.Mf/er迈op//7a的内切葡聚糖酶的pH和温度分布图的确定在下列条件下测定pH的分布图通过把0.1MTri-碑酸钠与0.1M柠檬酸混合制备pH值在2.5-10.0之间的緩冲液。稀释纯化的内切葡聚糖酶以便确保测tl应在测定的线性范围内。底物是O.4%AZCL-HE-纤维素(MegaZyme)的悬液，其以1:1和柠檬酸/磷酸盐緩冲液混合，使最终的底物浓度为0.2%AZCL-HE-纤维素。向Eppendorf⑧1.5ml聚丙蜂管中的1ral底物加入10^1酵溶液，并在Eppendorf⑧控温热混合仪(Thermomixer)中培养15分钟，然后将蘇在另一热混合仪中95X:下热灭活20分钟离心，并将200^1的各上清液转移到96孔微量滴定板的各个孔中，通过ELISA读数—仪(LabsysterasMulUskanMCC/340)在620nra測量0D。最适pH的培养温度是30t:.对于每个pK值，三个管中都加入了餘并在热灭活之前培养，而一个管(空白)加入酶并立即热灭活。计算了三个培^#品的平均值，并减去空白值。测定了下列pH下分布:<table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table>可以看出内切葡聚糖Slr在pH4.0和8.0之间有60%以上的活性，最佳活'棘pH5.0-6.0温度分布在pH5.5下以相同的方式确定最佳温度。温度范围从30x:到sox:。对于每种温度，进行三个培养，并计算平均值。通过酶的即刻热灭活产生三个空白，并从培养的样品值减去空白的平均值。可以看出内切葡聚糖酶在50-7ox:时具有最佳活性。<table>tableseeoriginaldocumentpage90</column></row><table>E.以毁丝霉属纤维素酶(SEQIDNO.1)除去表面纤丝和从含有纤維素纤维的织物中突出的纤维为指标测量其对颜色的净化仪器Terg-0-tometer液体体积100ml樣伴150次/分钟的垂直搅拌器冲洗时间自来水5分钟洗涤温度40X:洗涤液体0.05M裤酸盐緩冲液pH:7.0洗涤时间30分钟重复2次酶毁丝霉属SEQIDNO.IB剂量500和2500S-CEVU/1织物2块旧的黑色100%棉布样品，5x6cm(0.9克)干燥滚动千燥评价由DatacolorE1repho反射分光光度计测量it^射(Remission)。将反射值计算威AL(Hanter实验室值)当纤维素酶除去表面纤丝和从纱中突出的纤维时，黑色织物的表面看起来更黑，并得到更低的L值。将所说的样品和对照样品(即没有酶洗涂的样品)比较没有纤维素酶500ECU/12500ECU/10.00-1.41-1.91△L值和对照样品比较.所得的数据显示在试验的条件下，没有CBD的毁丝霉属纤维素酶给出很好的颜色澄清作用.F.yl(FCe//0/7/7f/70r<2/^e/77K/7//7a的内切葡聚糖蘇和〃柳/c(/a//7M/e/7;的43kD内切葡聚糖蘇的基因融M的构建这两种构建的目的在于制造^,力e/77W/7力//3的内切葡聚糖酶的衍生物，这种书t生物具有接头和〃-//L90/evw(在W091/17243中公开)的43kD内切葡聚糖酶的CBD。^^/77W/7/7/7a的天然内切葡聚糖酶没有接头和/或纤维素结合域(CBD)。CM1:构建体1由Mf力e/7TO/7力/'/a的内切葡聚糖酶(225个^J^0和〃.//7so/e/^的43kD内切葡聚糖酶的72个C-末端氨基酸组成。CM2:构建体2由#-f力e/7H叩/j/7a的内切葡聚糖酶(225个^^劇和〃./V^o/e/^的43kD内切葡聚糖蘇的83个C-末端^t^酸組成'以从Taka-启动子转录内切葡聚糖蘇基因的方法将〃./'"so/e/7s的43kD内切葡聚糖酶cDNA克隆到pHD414中。形成的质粒命名为pCaHJ418.以相4议的方法将M^7e/7zwp///a的内切葡聚糖酵的cDNA克隆到pHD414中，形成的质粒命名为pA2C193。CCGGAGAGCTGGTGCTGCTGGAGGGACGGGAGCAGCCGCTCTTGGACGTGAGCTCCG一3'引物3:5'-引物4:CGGCAGGGAAGTTGCCGTCGTCGTTACGGGAGCAGCCGCTCTTGGACGTGAGCTCCG引物1:引物2Taka-pro.引物:AMG-term.引物:5,CAACATCACATCAAGCTCTCC-3,5,CCCCATCCTTTAACTATAGCG_3,200710181634.1说明书第69/184页通过如Higuchi等(lb88)描迷的PCR重叠延伸方法构建内切葡聚糖酶融合体。构建体1:反应A:利用聚合SS^^应(PCR)扩增引物1和AMG-term.引物之间的pCaHJ418的片段OV.//7w/e/^的43kD内切葡聚糖酶的接头和CBD部分)。反应B:pA2C193中的Taka-pro引物和引物2之间的片段(MMe/wop力/7a的内切葡聚糖醉基因)的PCR扩增。反应C:在整个側翼区引物(即Taka-pro引物和AMG-term.引物)存在的情况下，在第三个PCR中利用前面的两个纯化的片断。构建体2--利用同样的方法，其中引物3和引物4分別替代引物1和引物2。纯化反应C中扩增的片段，以限制酵XbaI和BsstEII消化。将纯化的消化片段连接在以限制酶XbaI和BsstE11消化的pA2C193上。用连接的质粒转化大肠杆菌菌抹DH5aF'(新英格兰生物实验室)的感受态细胞，并分离包含基因融合体的克隆。通过DNA测序验伍克隆部分的序列。SEQIDNO:2A和SEQIDNO.3A显示了两个构建体的基因序列。在如Perkin-Elmer推荐的标准条件下进行聚合Sl^^应。反应A和B以942分钟开始，之后是20个循环(30秒钟，94X>，30秒钟，50C;1分钟，72X:)，并以72C4分钟结束。反应C以(2分钟，94t:;1分钟，52X:;和2分钟，72X:)开始，之后是15个循环(30秒钟，94TC;30秒钟，52r;90秒钟，72t:)，并以72'C4分钟结束。如上面所述，将这两个构建体转化到米曲霉中。G.克隆的带有纤维素结合域的纤维素酶的纯化和性质分析发酵后，从生产菌的胞外液分离回收克隆产物。然后，在含pH7.5的卩0raM碑酸钠的浆液中使用150克的微晶纤维素，通过亲合层析高度纯化大约1克的纤维素酶。将所i兑的微晶纤维素与M约1克纤维素酶的粗发酵液混合。在4t:下混合20分钟后，将所说的徵晶纤维素酶^大小为50x200讓的总体积将柱用200ral緩冲液洗涤，然后在相同的緩冲液中以0.5MNaCl洗涤直到不再有蛋白质洗脱液。然后以500mt20咖的Tris(pH8.5)洗涤.最后以r/。三乙胺(pH11.8)漠脱纯化的全长酶。将;5Ufe下来的蘇溶液调至pH8，并利用带有膜D0WGR61PP(阈值为20kD的聚丙烯)的Amicon室浓缩至每毫升含有5rag以上的蛋白质。纯化的纤维素膝t生质分析如下<table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table>通过SDS-PAGE分析纤维素酶的分子量，并利用Pharmacia的标准LMW蛋白质标记试剂盒计算纤维素酶的分子量。分子量明显高于编码氨基酸的组成的分子量，这是因为接头区是0-糖基化的，结果导致高分子量。使用Pharmacia两性电解质PAG板(pHl5至9.5)并再使用带有已知PI的蛋白质的Pharmacia试剂盒确定PI。利用已知吸收率的色氨酸、酪氨酸和半胱氨酸以氨基酸组成为基础计算摩尔消光系数。利用羧甲基纤维素作为底物，以0.5pH为间隔在40t:下培养20分钟并计算还原糖的形成而获得pH活性分布图。计算了不同pH下的相对活性，表中包含有超过50%相对活性的间隔点。利用应用生物系统模型W3A测序仪确定了纯化的纤维素酶的N-末端。按照制造商的说明操作此蛋白质测序仪.两个纤维素酶被封阻，这是因为形成致热谷氨酸盐的N-末端谷氨酖胺，无法检测致热谷氨酸盐，并且其阻断了进一步的测序。利用MicroCalc公司的具有连续扫描速率的MC热量计(calorimeter),并将温度以每小时90t:的速率从20t:升至90x:,在中性ph(7.o)下进行DSC差示扫描量热法。产生抗体。利用毁丝霉属、顶孢霉属和梭孢壳属的纤维素酶在兔中产生抗体。将0.1毫克纯化的溶解在0.9%NaCl溶液中的纤维素酶在注射前与弗氏佐剂混合。以一周间隔将兔免疫10次通过好^酸铵沉淀(25%饱和>纯化免疫球蛋白G组分(IgG)。在水中溶解沉淀，然后对乙酸钠緩冲液(pH5.0，50mM)(随去离子水的改变而改变)进4亍彻底透片斤。过滤后，IgG组分由叠氮化钠(O.01%)稳定。利用琼脂平板中的免疫扩散，三个纤维素酶都和其同源的抗血清形成单一的免疫沉淀物，在3个克隆的纤维素酶和抗其它两种纤维素酶产生的抗血清之间没有见到沉淀。在緩冲液中测量构建体l内切葡聚糖酶(SEQIDNo.2)除去表面纤丝和除去含纤维素纤维的织物中突出的纤维的性能仪器Terg-0-toraeter液体体积100ml搅拌150次/分钟(rpm)冲^b时间自来水5分钟、洗涤温度40匸水^Jl:1raMCaCL洗条液体0.05M磷酸盐緩冲液pH:7.0洗涤时间30分钟重复2次织物2块旧黑色100%棉布样品，5x6cm干燥滚动干燥评价由MacbethColorEye7000反射分光光度计测量光的反射。将反射值计算成AL(Hanter实验室值)。当由纤维素酶除去表面纤丝和除去纱中突出的纤维时，黑色织物的表面看起来更亮，并得到更低的L值。结果<table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table>所得的数据显示在试验的条件下，本发明的酶给出很好的颜色澄清度。H-III.在緩冲'液中测定^/"fe/hco7/er/"/c/w/^s的内切葡聚糖酶(SEQIDNo.n)除去表面纤丝和除去含有纤维素纤维的织物中突出的纤维的性能仪器Terg-0-tometer液体体积100ml搅幹150次/分钟，垂直撹拌冲洗时间自来水5分钟洗涤温度40匸洗涤液体Q.05M磷酸盐緩冲液pH:7.0洗涤时间30分钟重复2次剂量2.5S-CEVU/ml织物2块旧黑色100%棉布样品，5x6cm(0.9克)干燥滚动干燥评价由t)atacolorElrepho反射分光光度计测量光的反射。将反射值计算成AL(Hanter实验室值).当由纤维素酶除去表面纤丝和除去纱中突出的纤维时，黑色织物的表面看起来更黑，并得到更低的L值。将此样品和对照样品(即没有酶洗涤的样品)比较没有纤维素酶有纤维素酶0.00-0.57.和对照样品比较的AL反射值。所得的数据显示在试验条件下，纤维素酶给出很好的颜色澄清度.H-IV.在高pH高栽洗涤剂中测量克隆的7Z/e/aWa/er/"e^/7s和//"ew卯/"迈m.cbs478.94的纤维素蘇除去表面纤丝和除去含有纤维素纤维的织物中突出的纤维的'汰能仪器rTerg-O-tometer液体体积150ral150次/分钟，垂直,冲洗时间自来水10分钟洗涤温度35r洗涤液体1.Og/l的US型HDG(沸石/苏打助剂，阴离子/非离子重量比〉2.5)pH:10.0i^A:1.0mMCaCh0.34mMMgCl洗涤时间12分钟重复6次织物2块旧黑色棉布样品，5x6ctn(约150g/m')2块深色4十织棉布样品，5x6cm(约600g/m2)干燥滚动干燥评徐由DatacolorElrepho反射分光光度计测量光的反射'将反射值计算成AL(Hanter实验室銜'当由纤维素酶除去表面纤丝和除去纱中突出的纤维时，黑色织物的表面看起来更黑和更好，并得到更低的L值。分别试验了777/e/a"srer薦"/:(SEQIDNO:9)和/fc簡謝.鹏s/.CBS478.94(SEQIDNO:5)的克隆纤维素酶的不同剂量(分别称为A和B)。结果:<table>tableseeoriginaldocumentpage97</column></row><table>所得的数据显示在试验条件下，两种纤維素酶都给出很好的颜色澄清度。H-V.测量从77/.e/a"a"/ve"r/:和"/e細/w/BCBS478.94以及构建体1(SEQIDNo.2)克隆的纤维素酶除去表面纤丝和除去含纤维素纤维的织物中突出的纤维的性能仪器Terg-O-toraeter液体体积150ml挽拌15Q次/分钟，垂直,冲洗时间自来水10分钟洗涤温度35Ci^A:1.0mMCaCL0.34mMMgCl洗涤液体2.Og/1的HDL(中性，柠檬酸助剂HDL,非离子/阴离子重量比>0.5)pH:7.0洗涤时间30分钟重复2次织物2块旧黑色棉布样品，5x6cm(约150g/m2)2块深色4f织棉布样品，4x7cra(约600g/m2)干燥滚动干燥评价由DatacolorElrepho反射分光光度计测量光的反射。将反射值计算成AL(CIE实验室值)。当由纤维素酶除去表面纤丝和除去纱中突出的纤维时，黑色织物的表面看起来更黑和更好，并得到更低的L值。分别试验了7T/e/ar/afe/"/"e^f/7s(SEQIDNO:9)和Jcre/70/2/i//77CBS478.94(SEQIDNO:5)及构建体1(SEQIDNO:2)的克隆纤维素酶的不同剂量(分别称为A和B及C)。结果<table>tableseeoriginaldocumentpage98</column></row><table>所得的数据显示在试验条件下，所有的纤维素酶都给出很好的颜色澄清度L.应用T7/e/ay/aferresfr/s和/lcre/wo/7/〃/T7s/.及构建体1(SEQiDNO.2)的内切葡聚糖酶对斜紋粗棉布修整实验仪器洗涤机WascatorFL120液体体积2Q升织物1.1kg在+汰粗棉布织物，14.50Z100%棉布脱浆10分钟，55X:，pH750mlAquazyme120L2.5g/l磷酸盐緩冲液磨蚀2小时；pH和温度根据下表变化:<table>tableseeoriginaldocumentpage99</column></row><table>灭活15分钟，80匸lg/1碳酸钠冲洗在冷的自来水中，三个冲洗循环，各5分钟评价利用Texflash2000作为磨蚀水平的测量手段，在420nm下测定织物的反射。用本发明的不同内切葡聚糖酶处理斜^棉布织物，结果列于下表:<table>tableseeoriginaldocumentpage99</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage100</column></row><table>在斜紋粗棉布实验中，所有试验纤維素酶都显示极好的性能，尽管每一种酶有其自身的作用方式。当在斜紋粗棉布实验中应用SEQIDNO:2的酶时，可能达到较高的磨蚀水平，同时强度损失很小。当使用SEQLDNO:9的酶处理斜紋粗棉布时，可以达到非常高的洗褪故果，几乎使织物达到漂白的外观。当使用SEQIDNO:5的酶进行斜紋粗棉布实验时，在较低的最佳温度下，能达到很高的磨蚀水平，这^1得可能减少加热并节约能源J./4cre/776>/7/〃/77禾口777/e/<3K/<3/e/vexfr/s的克隆纤纟#素蘇用于Lyocelt纤维的生物抛光以商品名Tencel出售的Lyocell纤维是在以水为基础的溶剂中由木浆纤维素纺成的，所用的溶剂较用于正常粘胶纤维产生的溶剂更有利于环保。然而，当把此种纤维加工成织物时，其有形成纤丝的趋势，这种情况在织物表面可见，并称为"绒毛"。利用纤维素酶，有可能永久地除去这种暴露的绒毛状的纤维，极大地改进成品织物的外观，这种处理一般称为"生物抛光"。本发明的内切葡聚糖酶尤其适于除去Lyocell表面的纤维。材料和方法纺织底物或者是100%编织的或者是不同种的深蓝色的针织运动衫的Tencel。为了提高视觉故果，黑色的和编织的运动衫是优选的，这使评价简单4匕。编织的70/30Tencel/Rayon也可以限量4吏用。或者以200ml的恥溪，利用Launder-0-meter完成测定；或者以20升的賴>莫，利用Wascator完成测定。处理时间是wascator中55r，60分钟；LOM中60-90分钟。緩沖液为2g/l的乙酸钠(用醋酸调整pH至5)。织物和液体的比率是l:10,但是在Uunder-0-meter中，4吏用了20个直径Mrara的钢球(每个11克)，以获得足够的;W^蚀效果。生物抛光后，立即在2g/1的碳酸钠中80t:下进行灭活15分钟，之后用冷水冲洗。利用从1到5的绒毛分值评价所得的结果，其中1代^始材料的纤丝的外观，5礼表高质量的外观，其表面上没有可见的纤维。既然内切纤维素酶是特别针对表面处理的，重量的损失低于2%，因此此项不包括在评价的指标中。评价了两种纤维素蘇/^厂eww7/卿m.(seq[DNO.5)和7T/e/a^3M厂厂es"",IDNO.9)的克隆纤維素酶.两种纤维素餘对Tencel及Tencel混合的织物都能去纤丝。利用本发明的内切葡聚糖酶，除去的只是很小的纤丝，而当利用木霉属的酸'〖生纤维素酶混合物时，除去的是整个纤维。因此，利用本发明的内切葡聚糖酶时，被处理织物的强度损失保持在最小水平。下列剂量给出了良好的去纤丝作用，即绒毛分值为4或者以上每克织物15s-cevu的/^/"e历朋/〃/t7m.纤维素醉(seqldN0:5);和每克织物10S-CEVU的77e/a〃a纤维素酶(SEQIDNO:9)。实施例2通过表达克隆以及通过PCR克隆检测由植物病原体产生的新的溶纤臶，这种植物病原体从大豆种子中分离出来，并鉴定为船c/y/7力oy7/z7a产生供PCR的生物量和表达克隆的方法使CBS281.96的分离物在振荡烧瓶培养器中在富含纤维素马铃薯右旋糖培养液中生长，，在26X:下培养5天(振荡条件150rpm)。A.船cro//7cw/'/7ap/ase<9///a的内切葡聚糖绛的克^r^表达从船cro/j/cw/朋；/aseo〃/7a分离mRtU,这种病原体生长在包含纤維素的发酵培养基中，挽拌以确保通气良好。在生长3-5天之后收获菌丝，立即在液氮中冷冻，并保存在-80C。按所述方法，用1%的载体背景在大肠杆菌中构建約cr"力o/w/朋/7/m化o7/朋的含有大约10'单个克隆的文库。用一些库的质粒DNA转化酵母，并从每一个库中获得包含250-400个酵母菌落的50-100个平板。鉴定内切葡聚糖酶阳')"生菌落，并通过AZCLHE纤维素测定方法在SC琼脂平板上分离.从酵母菌落上直接扩增cDNA插入物，并如上面的材料和方法部分的描iiii行其性质分析。SEQIDNO:10中显示了编码内切葡聚糖蘇的cDNA的DNA序列，SEQIDNO:11中显示了相应的^^酸序列。从DSM10512质粒中能够获得该cDNA。从酵母菌落分离总DM，并通过转化如上述的大肠杆菌救援质粒DNA。为了在曲霉属中表达所说的内切葡聚糖酶，用适当的限制酶消化所说的DNA，在M上对各个片断进行分级分离，将相应于内切葡聚糖酶基因的片段纯化。将得到的基因连接到用适当的限制酶消化的pHD414上，结果形成质粒pA2C477。在大肠杆菌中进行DNA扩增之后，用所说的质粒转化上述的米曲霉.通过杂交筛选cDNA文库和阳性克隆的特征分析利用随机引物标记的/^<3杧0//加的PCR产物作为杂交探针筛选大肠軒菌中的/Vacn/7々o/77/"a/7/aseo//〃3cl)NA文库的大纟勺6000克l^^成单位(c.f.u.)。如材料和方法部分中的描述产生PCR产物通过对cDNA4垂入物末端进行测序和通过确定两条链中最长的cDNA的核芬^f列而确定阳性cDNA克隆。SEQIDNO:10显示了编码内切葡聚糖酶的cDNA的DNA序列，SEQIDNO:11显示了相应的^^^列，B./^c/7/7A0/n/;2ap/73seo/z'加的内切葡聚糖酵和〃w/w/co/a//2s0/e"s的43kD内切葡聚糖酶基因融M的构建制备一种构建体的目的是制造尨^<3"0//朋的内切葡聚糖酶的+汴生物，这种衍生物具有〃./ywo7e/:(在W091/17243中公开)的43kD内切葡聚糖餘的接头和CBD。"/^"eo//^的天然内切葡聚糖蘇没有接头和/或纤维素结合域CBD。此构建体由/7/<^//加的内切葡聚糖蘇(223个氨基酸)和〃./"so/e/^的43kD内切葡聚糖酶的72个C-末端^^酸组成。将〃.//7M/e/^的43ld)内切葡聚糖酶的cDNA以此内切葡聚糖酶基因从Taka-启动子转录的方式克隆到pHD414中形成的质粒命名为pCaHj418。将编码#-p力3化o〃朋的内切葡聚糖酶的cDNA作为BstXI/NotI片段克隆到pYES2.0中，形成的质粒命名为pClC477。引物引物1:5'-GGTCGCCCGGACTGGCTGTTCCCGTACCCCCTCCAGCAGCACCAGCTCTCCGG-3'引物2:5'-CCGGAGAGCTGGTGCTGCTGGAGGGGGTACGGGAACAGCCAGTCCGGGCGACC-3'pYES2.0F.HT引物5'—CGGACTACTAGCAGCTGTAATACG-3'AMG-term.引物5'-CCCCATCCTTTAACTATAGCG-3'通过如Higuchi等(1988)描述的PCR重叠延伸方法构建内切葡聚糖酶融合体。反应A:利用聚合SI^反应(PCR)扩增引物1和AMG-term.引物之间的pCaHj418的片段(〃.//7M/e^的43kD内切葡聚糖酶的接头与CBD部分)。反应B:pYES2.0F.HT引物和引物2之间的pClC477的片段(#./7力3"0//朋的内切葡聚糖酶基因)的？01(扩增。反应C:在整个側翼区引物(即pYES2.0F.HT引物和AMG-term.引物)存在的情况下，在第三个PCR中利用前面的两个纯化的片段。纯化反应C中扩增的片段，以限制酶XbaI和BamHI消化。将纯化的消化片段连接在以限制酶XbaI和BaraHI消化的pHD414上。用连接的质粒转化大肠杆菌菌抹DH5aF'(新英格兰生物实验室)的感受态细胞，并分离包含基因融合本的菌落.通过DNA测序验伍克隆部分的序列'在如Perkin-Elraer推荐的标准^H^下进行聚合Sl^^应。反应A和B以94X:2分钟开始，之后是20个循环(30秒钟,94TC;30秒钟，52C;1分钟，72X:)，并以72X:4分钟结束。反应C以(2分钟，94X:;l分钟，52X:;和2分钟，72C)开始，之后是20个循环(30秒钟，94X:;30秒钟，，52C;90秒钟，72X:),并以72r4分钟结束。如上面所述，将#建体转化到米曲霉中。实施例3//"e銜//咖和粪生粪壳的内切葡聚糖酶的克l^表达。表达克隆的生物量的产生方法使CBS478.94的分离物和ATCC52644分别在振荡烧瓶培养器中在富含纤维素的马铃薯右旋糖培养液中生长，在26X:下培养5天(振荡条件150rpm).分别从/fc/"e/ffo/2/wzw.CBS478.94和粪生粪壳ATCC52644中分离mRNA，这两种生物体生长在包含纤维素的发酵培养基中,挽拌以确保通气良好.在生长3-5天之后收获菌丝，立即在液氮中冷冻，并保存在-80"C。如上所述，用1%的栽体背景在大肠杆菌中分別构建/(C/"e/^/7/z7/T7m.cbs478.94和粪生粪壳ATCC52644(每个含有大约106单个克隆)的文库。用每一个文库中一些集合质粒DNA转化酵母，并从每一个集合中获得包含250-400个酵母菌落的50-100个平板。鉴定内切葡聚糖酶阳性菌落，并通过AZCLHE纤维素测定方法在SC琼脂平板上分离。从酵母菌落上直接扩增cDNA插入物，并如上面的材料和方法部分的描述进行其性质分析。SEQIDN0:6中显示了编码//cre/ra/7/〃/z7的内切葡聚糖酶的cDNA的DNA序列，SEQIDNO:7中显示了相应的^^l亭列。从DSM10080的质粒中能够获得此cDNA。SEQIDNO:19中显示了编码粪生粪壳的内切葡聚糖酶之cDNA的部分DNA序列(cDNA的5'末端的核普^列)，SEQIDNO:20显示了相应的氨基酸序列.从DSM10576的质粒中能够获得此cDNA.从酵母菌落分离总DNA，并通过转化如上述的大肠杆菌^L援质粒DNAu为了在曲霉属中表达所说的内切葡聚糖酶，用适当的限制酶消化所说的dna,在^M上对各个片断进行分级分离，将分别相应于^cre/z70/7/鹏和粪生粪壳的内切葡聚糖酴基因的片段纯化。将得到的基因连接到用适当的限制酶消化的pHD414上，结果分别形成质粒pA2C371和pA2C502。在大肠杆菌中进行DNA扩增之后，用所i兑的质粒转化上述的米曲霉。实施例4a.由pcr克隆^//3/戶6//"sca6e//aCBS280.96的内切葡聚糖酶使CBS280.96的分离物在静态的烧瓶培养器中含小^J良的培养基(每烧瓶300g小M添加"0ml的盐溶紀上生长，其中，在26C下培养6天。培养后，以蒸镏水抽提小:^(每烧瓶300ni1)，并在l。/。琼脂糖(LUex琼脂糖Medinova)中检验提取物的内切葡聚糖酶活性(0.rMza-HE-纤维素(megazyrae))。在pH为3.0,7.0和9.5的平板上現察活性。从如上所述生长的CW"//^///中分离mRNA。在生长3-5天之后收获菌丝，立即在液氮中冷冻，并保存在-80t:。如上所述，用l%栽体背景，在大肠杆菌中构建&//7//^///1"4^//3(每个含有大约106单个克隆)的文库，利用随机引物"P-标记的C.sca/e/A3的PCR产物作为杂交探针，筛选大肠扦菌中的6V/V2//7e〃/ssca6e//3cDNA文库的大约10000克隆形成单位(c.f.u.)。如材料和方法部分中的描述产生PCR产物.通过对cDNA插入物末端进行测序和通过确定两务逸中最长的cDNA的核芬l宇列而确定阳性cDNA克隆。SEQIDN0:12显示了编码内切葡聚糖酶的cDNA的DNA序列，SEQIDN0:13显示了相应的M^列。可以从DSM10511中的质粒获得此cDNA。从酵母菌落分离总DNA,并通过转化如上述的大肠杆菌救援质粒DNA。为了在曲霉属中表达所说的内切葡聚糖酶，用适当的限制皭消化所说的DNA，在g上对各个片段进行分级分离，将分别相应于所说的内切葡聚糖酶基因的片段纯化。接下来将得到的基因连接到用适当的限制酶消化的pHD414上，结果形成质粒pA2C475。在大肠杆菌中进行DNA扩增之后，用所说的质粒转化上述的米曲霉。Cr//7//7e///ssca6e//3的内切葡聚糖酵和〃w/27/co/a//75ro/e/JS/'/7so/e/2s的43kDa的内切葡聚糖酶的接头/CBD区的基因融^的构建Cr//7/pe//"sc^e/"的天然内切葡聚糖酶既没有接头也没有纤维素结合域(CBD)。此外，全长cDNA在编码内切葡聚糖酶的开放读框(ORF)的上游包含ATG起始密码子，这可能导玫基于异源cDNA表达的混杂翻译的起始，如在酵母(哞酒酵母)和丝状真菌(米曲霉)中。这样，利用通过重叠延伸的剪接(S0E)已经构建了Cr/7/'/7e//2、sc^e/h的内切葡聚糖酶和〃咖/co/a//m/e/w的43kD的内切葡聚糖蘇的接头/CBD区(在WO91/17243中公开)的两个基因融合体(Horton等，1989)。构建体1由编码C"<3&//<3的内切葡聚糖酶的226个残基的cDNA组成，此cDNA通过PCR与〃.//^o/e/7S的编码位于〃.//jso/e/^43kD内切葡聚糖酶的COOH-末端的接头和CBD区(72个#^紛的cDNA的3'-末端连接。第二个杂交构建体和前迷的基因构建体相同，只是通过PCR缺失了推定的信号肽的前5'个残l结果使信号肽变短，此信号M第二个框内起始密码子开始。质粒枸建体质粒pClC475包含C"a6e//3的全长cDNA，将其克隆到BstXI/NoU-切口酵母表达栽体pYES2.0中；质粒pClC144包含〃.//w/e/^的全长cDNA,将其克隆到pYES2.O的BstXi位点上。经重叠延伸的剪接利用50-100ng的pClC475为冲莫板，各300-350pmol的正向引物(正向引物l:5'-CCCCAAGCTTGACTTGGAACCAATGGTCCATCC-3';正向引物2:5'二CCCCAAGCTTCCATCCAAACATGCTTAAAACGCTCG-3')，250pmol的反向引物DNA热循环仪(Landgraf，德国)和2.5单位的Taq聚合每(Perkin-Eimer，Cetus，USA)，在PCR緩沖液(IOmMTris-HC1，pH8.3;50mMKC1;1.5mMMgCL;0.01%明胶；包含每种dNTP200pM)中产生编码C"We//<3的内切葡聚糖酶的核心区的两个PCR片段。利用循环方式(94匸变性l分钟；55匸退火2分钟；72t:延伸3分钟)进行三十个PCR循环。利用100ng的pClC144作为模板，250praol的正向引物(5'-CACTAATATCTCGGGC-TGTGTTCGTAAACCCTCCAGCAGCACCA-GCTCTCCGGTC-3'),250pmol的pYES2.0反向引物(5'-GGGCGTGAATGTAAGCGTGACATA-3')，DNA热循环仪(Landgraf，德国)和2.5单位的Taq聚合酶(Perkin-Elmer，USA)，在PCR緩冲液(10mMTris—HC1，pH8.3;50raMKC1;1.5mMMgCL;0.01%明胶；包含每种dNTP200(nM)中产生编码〃.//wo/e/w的内切葡聚糖酶的接头和CBD的PCR片段。如上文进行三十个PCR循环。将PCR产物在O.7%低胶凝温度的琼脂糖凝皎(SeaPlaque，FMC)中进行电泳，从凝皎中切割目的片段，并按照制造商的说明通过琼脂糖酶(新英格兰生物实验室，美国)处理，之后是笨酚抽提和在-20n下通itira入2体积的96%EtOH和0.1体积的3MNaAc乙醇沉淀12小时回收目的片段。通it^两种组合的PCR緩冲液(10niMTris-HCl，pH8.3;50raMKC1;1.5mMMgCL;0.01%明胶；包含每种dNTP200nM)中组合上述的重叠PCR片段(每个模板约50ng)产生6W/7/'/e〃""a6e〃a的内切葡聚糖酶和〃〃/z//"/a//wo/ey的43kD的内切葡聚糖酶的接头/CBD区的重组杂合基因。利用DNA热循环仪(Landgraf,德国)和2.5单位的Taq聚合酶(Perkin-Elmer，Cetus，USA)进行SOE反应。利用循环方式(94C变性l分钟；55C退火2分钟；72。C延伸3分钟)进行二个PCR循环，终止反应，向反应混合物中加入各末端引物(正向引物l:5'-CCCCAAGCTTGACTTGGAACCAATGGTCCATCC-3';正向引物2:5'-CCCCAAGCTTCCATCCAAACATGCTTAAAACGCTCG-3';反向引物5'-GGGCGTGAATGTAAGCGTGACATA-3')，利用循环方式(94X:变寸生1分钟；55匸退火2分钟；72t:延伸3分钟)进行另外三十个PCR循环。用于米曲霉中异源表达的表达盒的构建将PCR产生的重组片段在0.7。/。低胶凝溫度的琼脂糖^m(SeaPlaque，FMC)中进行电泳，从凝胶中切割目的片段，并按照制造商的说明通过琼脂糖酶(新英格兰生物实验室，美国)处理，之后是笨酚抽提和在-20C下乙醇沉淀12小时回收目的片段。以HindIII和XbaI进行DNA片段消化，将DNA片段连接在^'/7^n//^/-切割的pHD414栽体上，之后按照制造商的说明将构建体电穿孔到大肠杆菌DH10B细胞(生命技术，美国)中。如材料和方法部分所描述的，从两务逸测定形成的基因融合体的核苷酸序列，SEQIDN0:14A和15A。如所描述的，这些构建体可以转4匕米曲霉。实施例5从46个丝状真菌和单轴真菌(raonocentricfungi)中用PCR;J^测所il的溶纤酶类型，这些真菌代表23个科的32个属，属于7个纲的15个目，总而言之包括真菌的所有4个组子嚢真菌、担子真菌、壶真菌和M真菌5.1材料1.棉色二孢菌抹的保藏，保藏号CBS274.962.〃/05770,a(b//^r3/z//(Hawksw等)Hawksw等菌抹的保藏号NKBC1444，4.AscobolusstictoideusSpeg.菌抹的保藏号Q026(NovoNordisk保藏中心)分离自鹅粪，Svalbard，挪威5.5"acco办o/ws^///t^e//:^f,〃cDi^cc.菌抹的保藏保藏号CBS275.966.爽孢青霉,e//w7e/物种的保藏号ATCC623967.产黄青霉r/KW菌抹的保藏号ATCC94808.77e厂/77cwycesve/"/"wcc^w5"Pugh等菌抹的保藏保藏号CBS285.969.鹿角团炭角菌厶e"/w/7/e菌抹的保藏保藏号CBS284.9610.点孔座壳exZJF/.参见A.Munk:丹麦/yre"卿'c"es，DanskBotaniskArkiw，Vo117，1195711.AWw//s/orw/7sp分离自在中国云南省昆明植物园中生长的山茶的叶片(茶科,Guttiferales)分离自海上样品，Bahamas13.蛇形镰孢57er6a^/r菌抹的保藏号IFO446714.早熟禾镰孢recUlTr.物种的保藏号ATCC6088315.腐皮镰孢^3".,&cc.S/i/f/《〃a/s.菌抹的保藏号IMI107.51116.番茄尖镰孢"3cC5V7/d.《〃a/7s.菌抹的保藏号CBS645.7817.尖银抱A35"5V7V0/^菌抹的保藏号CBS744.7918.链孢粘帚霉C/7/啦/》J^w〃菌抹的保藏号ATCC1052319./VeC/a/7//e<2Z//7g/e/菌株的保藏，保藏号CBS279.9620.大孢粪壳勿e"附/f/物种的保藏号AT(X6025521.灰腐质霉TVaee/物种的保藏号ATCC2272622.黑腐质霉o/T/r/l菌抹的保藏号CBS819.73菌抹的保藏号ATCC2808524.777/e/ai//s//7e厂/770/7力//3,e/"^AS157/7^e/7(另寸名6'0/777ascw菌抹的保藏号CBS174.70，IMI145.13625.67<30^/"/"力//7〃/77厂oecw/K//51517/77〃/7/5"acca/YZoef/f/a厂C力3/物种的保藏号ATCC6237326.5y^/7as/^/W3^/7/'/e/75751菌抹的保藏号NKBC1515(曰本大学，profeTubaki保藏中心)27.管毛壳/^"e/菌株的保藏号CBS799.8328.巴西毛壳勘〃^ae/1尸o"a/菌抹的保藏号CBS122.6529.墙毛壳Co油菌抹的保藏号CBS163.5230.C力aefo/77/."/77F/rescey^M^gafra菌抹的保藏号CBS547.7531.A7^n57ora577菌抹的保藏保藏号CBS272.9632./V/^rc^/7ora57分离自33.Z/a/70"/esy"ge/7es/a菌抹的保藏保藏号CBS278.9634.葫芦科刺盘孢^3wer/'/7/^7〃sW〃a/We^另'j名围小丛壳Ksr0/"6/c〃/a/"e/e/h'/751efff7/7sfead物种的保藏号ATCC5260935.黑胶耳Fr.菌抹的保藏保藏号CBS277.9636.;KJ峰层孔菌"J/7/".菌株的保藏保藏CBS276.9637.绵皮孔菌属(？)菌抹的保藏号CBS283.9638.纟沐囊壸菌WeSs/y》粉/^/^、c/e/"菌抹的保藏保藏号CBS282.9639.Z力/zcv77wcor/^y/7/w51(X//7flr/"y)5Ic///jioer別名微小毛霉菌抹的保藏号IFO457840.闪光须霉"朋zeM/77Ye《力e/z7》厶e船/w/e/"菌抹的保藏号IFO481441弗雷生刺枝霉,77e*/77《AeM緒'er菌抹的保藏号NRRL230542.粉红单端孢菌抹的保藏号IFO537243.6b/]/of/ec/咖^nctop力/fe分离自中国云南省昆明的鲜恭法物的叶片44.菌抹的保藏物保藏号CBS271.96Coelomycete，分离自牙买加Christiana的ArtocarpusaltUis的叶片(桑科，lirticales)45.菌抹的保藏物保藏号CBS273.96Coeloraycete，分离自牙买加ii4i斯山的Pimentadioica(杉^|^良考+，Myrtales)的叶片46.菌抹的保藏号CBS270.96Coeloraycete,分离自生长在牙买加达拉斯山的Pseudocaly咖aal1iaceura(Bignoniaceae，Solanaies)的叶片5.2方法菌抹的保持和生物量的产生将菌抹保持在培养i(9cra)中的琼脂或斜面上(参见培养基表PCA和PDA)。在以下生长条件之下在樣瓶中培养44种菌沐如PC、PD和PB9或YPG的普通培养基(参见培养基表)；培养时间3至9天；温度26t:;rpm在175-150之间。使14号菌抹(,.声5e)在小麦麸上生长15天(26X:;静态)。使38号菌抹在加有1cm'高压灭菌滤纸片的稀释的盐溶液(DS/2)中生长。活性试验在由"/o琼月旨糖(HSB，Litex琼月旨糖，Medinova)制成的0.1。MZCL-HE-纤维素(Megazyrae)平板(14cm培养皿)上试验活性。所有试验均以3份进行，即将AZCL-HE-纤维素溶解在三种緩冲液中，调节至pH3,7或9.5(使用各种比例的以下两种组分一水柠檬酸单水合物，Merck产品号100244(21.0g)，溶解在水中，使总体积为1000亳升；0.1Mdodecabrohydrate三钠，Merck产品号6578(38g)，溶解在水中，{吏总体积为1000毫升。在临用前混合。收获生物量通过过滤(根据真菌的生长调节滤器网眼，最细的用于具有高度孢子形成菌丝体的真菌，例如/^^/7咖j/^.)收获生物量。将在滤器上的生物量刮至无菌塑料袋中，并立即冷冻(掩没到液氮中)。5.3结果I.使用材料和方法中描述的PCR筛选与扩增技术，获得了下列部分cDNA序列Acco6o/wsG^7"e〃M的cD&cc.CBS275.96:SEQIDNO:21(和在SEQIDNO:22中的推定的M^列)；T7e，/Z7,c"rer藩歸sCBS285.96:SEQIDNO:23(和在SEQIDNO:24中的推定的#^#列)；鹿角团炭角菌CBS284,96:S印IDNO:25(和在SEQIDNO:26中的推定的a^列)；番茄尖镰孢CBS645.78:SEQIDNO:27(和在SEQIDNO:28中的推定的M睃字列)；〃ec"/'aCBS279.96:SEQIDNO:29(和在SEQIDNO:30中的推定的^*列)；灰腐质霉ATCC22726:SEQIDNO:31(和在SEQIDNO:32中的推定黑腐质霉CBS819.73:SEQIDNO:33(和在SEQIDNO:34中的推定C/a^/o/vV7//〃y77厂oecw/7o7ss/'/7〃/77ATCC62373:SEQIDNO:35(和在SEQmNO:36中的推定的M^宇列)；S"/7a^c^/7orato/7i."e/w/jNKBC1515:SEQIDNO:37(和在SEQIDNO:38中的推定的#^酸序列)；/V/>rosporasp.CBS272.96:SEQIDNO:39(和在SEQIDNO:40中的推定的g^列)；弗雷生刺枝霉SEQIDNO:41(和在SEQIDNO:42中的推定的^tJ^黑胶耳CBS277.96:SEQIDNO:43(和在SEQIDNO:44中的推定Co/7/oMec/"/z7:SEQIDNO:45(和在SEQIDNO:46中的推定的絲餅列)；保藏物CBS271.96:SEQIDNO:47(和在SEQIDNO:48中的推定的狄耕列)；保藏物CBS270.96:SEQIDNO:49(和在SEQIDNO:50中的推定的棉色二孢CBS274.96:SEQIDNO:51(和在SEQIDNO:52中的推"7g環/7訓C1444:SEQIDNO:53(和在SEQIDNO:54中的推定的Ml亭列)；疾孢青霉ATCC62396:S印IDNO:55(和在SBQIDNO:56中的推点孔座壳SEQIDNO:57(和在SEQIDNO:58中的推定的^J^^列)；蛇形镰孢，IFO4467:SEQIDNO:59(和在SEQIDNO:60中的推定77/e/3r/a/77e/77W//7/7aCBS174.70:SEQIDNO:61(和在S印IDNO:62中的推定的^^f列)；管毛壳CBS799.83:SEQIDNO:63(和在SEQIDNO:64中的推定f/ae/o/7/〃/7K/7"esce/s:SEQIDNO:65(和在SEQIDNO:66中的j扭葫芦孝+刺盘"fe:SEQIDNO:67(和在SEQIDNO:68中的推定的^^餅列)；闪光须霉SEQIDNO:69(和在SEQIDNO:70中的推定的#^*列)；和粉红单端孢SEQIDNO:71(和在SEQIDNO:72中的推定的4J^酸序列)。II.《吏用材料和方法中描迷的PCR筛选与扩增技术，获得了部分编码本发明的酶的部分cDNA序列，按照布达佩斯条约保藏了质粒大肠杆菌，DSM10583，保藏日1996年3月13日；来源于粉红单端孢的cDNA;大肠杆菌，DSM10584，保藏曰1996年3月13曰；来^f、于S/s/Msfc^para//7e/7〃/、的cDNA;大肠杆菌，DSM10585，保藏日1996年3月13日；来源于(7力ea"/77/〃/z7/wmrw/z7的cDNA;大肠杆菌，DSM10587，保藏日1996年3月13日；来源于粪生粪壳的cDNA;大肠杆菌，DSM10588，保藏日1996年3月13曰；来源于未筌别的菌抹CBS273.96的cDNA;大肠杆菌，DSM10586，保藏曰1996年3月13曰；来源于5"po/^7pe"/ss/7的c隨。粗上清液的颜色澄清作用在正常的洗涤期间，织物常常褪色。然而，如果织物用<^色澄清的纤维素酶洗涤，則织物的外观得到改善，原来的颜色得到更好地保持或保留.—t、^T4*沾志A沐Mirr沐W清作用,装置液体体积梭拌冲洗时间洗涤温度洗涤液pH洗涤时间重复酶剂量织物干燥Terg-o-toraeter100毫升用垂直搅拌器150次/分钟在自来水中5分钟40x:0.05M蜂酸盐緩冲液7.030分钟2次以下所示菌抹的粗上清液200,500,1000或2500S-CEVU/1的两种剂量2块旧黑100%棉布，5x6cm(O.9克)滚动干燥评价经DatacotorElrepho反射分光光度测量v^射。以AL(Hunter实验值)计算反射。当从纱突出的表面纤丝和纤维被纤维素酶除去时，黑色的织物的表面显得更黑，获得更低的L值。将样品与一种对照样品(即不用酶洗涤)比较。以下显示了与对照样品比较的ALR反射值'ECU/1菌抹2005002,250Q13.蛇形镰孢n.t.-O.71n.t.-l.2815.腐皮镰孢n.t.-0.96n.t.-l.3724.7"力/</3厂/<3/"/e/77(9/7力//<-O.30n.t.-1.25n.t.25.n.t-l.79n.t.-2.1837.SpongipeLiis()n.t.一l.Oln.t.-1.6339.///zo则corn丄-1.90n丄-2.6641.弗雷生刺枝霉n.t.-0.17n.t.-1.3345.保藏号CBS273.96n.t.-1.31n.t.-1.20数据表明，在试验条件下，所有菌株都给出良好的澄清作用(n.t.=在这一剂量下未试验)。序列表(l)一般信息(n申请人(A)姓名NovoNordiskA/S(B)街il:NovaAUe(C)城巿DK-2880Bagsvaerd(E)国家.'丹麦(F)邮区代码(ZIP):DK-2880(G)电话+4544448888Ol)传真+4544493256(ii)发明名称新的内切葡聚糖酶(iii)序列数72(iv)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算杌[BM-PC兼g^JL(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentInRelease#1.0,IJ(EPO)(2)SEQIDNO:1A的4言息(i)序列特征(A)长度891个g对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型cDNA(vi)原始来源(A)生物体哞酒糖酵母(B)菌椒瞎9770(xi)序列描迷:SEQIDNO:1A:AAAGAAAGGCTCTCTGCTGTCGTCGCTCTCGTCGCTCTCGTCGGCATCCTCCATCCGTCC60GCCTTTGATAACCCGCTCCCCGACTCAGTCAAGACGACGCATACTTGGCACCATGCATCT120CTCCGCCACCACCGGGTTCCTCGCCCTCCCGGTCCTGGCCCTGGACCAGCTCTCGGGCAT180CGGCCAGACGACCCGGTACTGGGACTGCTCJCAlAGCCGAGCTGCGCCTGGCCCGGCAAGGG240CCCCTCGTCTCCGGTGCAGGCCTGCGACAAGAACGACAACCCGCTCAACGACGGCGGCTC300CACCCGGTCCGGCTGCGACGCGGGCGGCAGCGCCTACATGTGCTCCTCCCAGAGCCCCTG360GGCCGTCAGCGACGAGCTGTCGTACGGCTGGGCGGCCGTCAAGCTCGCCGGCAGCTCCGA420GTCGCAGTGGTGCTGCGCCTGCTACGAGCTGACCTTCACCAGCGGGCCGGTCGCGGGCAA480GAAGATGATTGTGCAGGCGACCAACACCGGTGGCGACCTGGGCGACAACCACTTTGACCT540GGCCATCCCC-GGTGGCGGTGTCGGTATTTTCAACGCCTGCACCGACCAGTACGGCGCTCC600CCCGAACGGCTGGGGCGMICGCTACGGCGGCATCCATTCCAAGGAAGAGTGCGAATCCTT660CCCGGAGGCCCTCAAGCCCGGCTGCAACTGGCGCTTCGACTGGTTCCAAAACGCCGACAA720CCCGTCGGTCACCTTCCAGGAGGTGGCCTGCCCGTCGGAGCTCACGTCCAAGAGCGGCTG780CTCCCGTTAAGAGGGAAGAGAGGGGGCTGGAAGGACCGAAAGATTCAACCTCTGCTCCTG840CTGGGGAAGCTCGGGCGCGAGTGTGAAACTGGTGTAAATATTGTGGCACACACAAGCTAC900TACAGTCCGTCTCGCCGTCCGGCTAACTAGCCTTGCTGCGGATCTGTCCAAAAAAAAAAA960(2)SEQIDNO:IB的信息(U序列特征(A)长度225个氛基酸(B)类型g酸(C)链型单链(D)拓朴结构线性(iU分子类型蛋白质(xi)序列描迷SEQIDNO:IB:MetHi_8LeuSerALaThrThrGlyPheLeuALaLeuProValLeuAla151015LeuAspGinLeuSerGlylieGlyGinThrThrArgTyrTrpAspCys202530CysLysProSerCysAlaTrpProClyLysGlyProSerSerProVal354045GinAlaCysAspLysAsnABpAsnProLeuAsnAspGlyGlySerThr505560AxgSerGlyCysAspAlaGlyGlySerAlaTyrMetCysSerSerGLn65707580SerProTrpAlaValSerAspGluLeuSet:TyrGlyTrpAlaALaVaL859095LysLeuAlaGlySerSerGluSerGinTrpCysCysAlaCysTyrGlu10010511〇LeuThrPheThrSerGlyProValAlaGlyLysLysMetlieValGin115125AlaThrAsnThrGlyGlyAspLeuGlyAspAsnHiePheAspLeuAla13013S140lieProGiyGlyGlyVal5lyliePheAsnALaCysThrAspGinTyr145150155160GlyA"ProProAenGLyTrpGlyAspArgTyrGlyGlyIHisSer16517017SLysGluGluCysGluSerPheProGluAlaLeuLysProGlyCysAsn180185190TrpArgPheAspTrpPheGinAenAlaAspAanProSerVaLThrPhe195200205GinGluValAlaCyBproSerGluLeuThrSerLysSerGlyCysSer210215220225(2)SEQIDNO:2A的孑言息(n序列特征(A)长度894个g对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓朴结构线性(ii)分子型cDNA(vi)原始来源(A)生物体"构建体1"(xi)序列描述SEQIDNO:2A:ATGCATCTCTCCGCCACCACCGGGTTCCTCGCCCTCCCGGTCCTGGCCCTGCACCAGCTC60-TCGCGCATCGGCCAGACGACCCGGTACTGGGACTGCTGCAAGCCGAGCTCCGCCTGGCCC120GOCAAGGGCCCCTCG丁CTCCGGTGCAGGCCTGCCACAAGAACCACKACCCGCTCAACGAC180GGCGGCTCCACCCGGTCCGGCTGCGACGCGGGCGCCAGCGCCTACATGTGCTCCTCCCAG240AGCCCCTGGGCCGTCAGCGACGAGCTGTCGTACGGCTGGGCGGCCGTCAAGCTCGCCGGC300AGCTCCGAGTCGCAGTGGTGCTGCGCCTGCTACGAGCTGACCTTCACCAGCGGGCCGGTC360GCGGGCAAGAAGATGATTGTGCAGGCGACCAACACCGGTGGCGACCTGGGCGACAACCAC420TTTGACCTGGCCATCCCCGGTGGCGGTGTCGGTATTTTCAACGCCTGCACCGACCAGTAC480GGCGCTCCCCCGAACGGCTGGGGCGACCGCTACGGCGGCATCCATTCCAAGGAAGAGTGC540GAATCCTTCCCGGAGGCCCTCAAGCCCGGCTGCAACTGGCGCTTCGACTGGTTCCAAAAC600GCCGACAACCCGTCGGTCACCTTCCAGGAGGTGGCCTGCCCGTCGGAGCTCACGTCCAAG660AGCGGCTGCTCCCGTCCCTCCAGCAGCACCTAGCTCTCCGGTCAACCAGCCTACCAGCACC720AGCACCACGTCCACCTCCACCACCTCGAGCCCGCCAGTCCAGCCTACGACTCCCAGCGGC780TGCACTGCTGACAGGTGGGCTCAGTGCGGCGGCAATGCCTGGAGCGGCTGCACCACCTGC840GTCGCTGGCAGCACTTGCACGAAGATTAATGACTGGTACCATCAGTGCCTGTAG894(2)SEQIDNO:2B的信息:(i)序列特征(A)长度297个M酸(B)类型氣l酸(C)链型单链(D)拓朴结构线'汰(ii)分子类型蛋白质(x)序列描述SEQIDNO:2B:MetHisLeuSerALaThrThrGLyPheLeuftAaLeuProVaLLeuMa151015LeuAspGinLeuSerGlylieGlyGinThrThrArgTyrTrpAspCys202530CysLysProSerCyaAlaTrpProGlyLysGlyProSerSerProVal354045GinAlaCyaAapLyaAanAspAanProLeuAsnAspGlyGlySerThr5055-60ArgSerGlyCysAspALaGlyGlySerAlaTyrMet:CysSerSerGin65707S80SerProTrpA"V"SerAspGluLeuSerTyrGLyTrp"aAlaV"LyeLeuALa8SGlySerSerGlu100Ser90GinTrp105CysCysAla95CysTyrGlu110LeuThrPheThrSerGlyProVaiAlaGlyLys乙ysMetlieValGLrUS120125AlaThrAsnThrGlyGlyAspLeuGlyAspAenHisPheAspLeuAla130135140lieProGlyGlyGlyValGlyliePheAsnALaCysThrAspGLnTyr145150155160GiyAlaProProAsnGlyTrpGlyAspArgTyrGlyGly工leHisSer16517017SLysGluGluCysGluSerPheProGiuAlaLeu乙ysProGlyCysAsn180185190TrpArgPheABpTrpPheGinAsnAlaAspAsnProSerValThrPhe200205GinGluVal_AlaCyBProSerGl_uLeuThrSer乙ysSerGlyCysSer21021S220ArgProSerSerSerThrSerSerProVaLAsnGinPro丁hrSerThr22523023S240SerThrThrSerThrSerThrThrSerSerProProValGinProThr2"250255ThrProSerGlyCysThrAlaGLuArgTrpAlaGinCysGlyGiyAsn260265270GlyTrpSerGiyCyBThrThrCysV""aGlySerThrCysThrLys2752B0285lieAanAspTrpTyrHi_aGinCyaLeu290295(2)SEQ[DNO:3A的4言息:(i)序列特征927个威基对核酸单链(A)长度(B)类型(C)链型(D)拓朴结构线性(ii)分子型cDNA(vi)原始来源(A)生物体"构建体2"(xi)序列描述:SEQIDNO:3A:ATGCATCTCTCCGCCACCACCGGGTTCCTCGCCCTCCCGGTCCTGGCCCTGGACCAGCTC60TCCCGCATCGGCCAGACGACCCGGTACTGGGACTGCTGCAAGCCGAGCTGCGCCTGGCCC120CCCAAGGCCCCCTCCTCTCCGGTGCAGGCCTGCGACAAGAACGACAACCCGCTCAACGAC180GGCGGCTCCACCCGGTCCGGCTGCGACGCGGGCOGCAGCGCCTACATGTGCTCCTCCCAG240AGCCCCTGCGCCG丁CAGCGACGAGCTGTCGTACGGCTGGGCGGCCGTCAAGCTCGCCGGC300AGCTCCGAGTCGCAGTGGTGCTGCGCCTGCTACGAGCTGACCTTCACCAGCGGGCCGGTC360GCGGGCAAGAAGATGATTGTGCAGGCGACCAACACCGGTGGCGACCTGGGCGACAACCAC420TTTGACCTGGCCATCCCCGGTGGCGGTG丁CGGTATTTTCAACGCCTGCACCGACCAGTAC480GGCGCTCCCCCGAACGGCTGGGGCGACCGCTACGGCGGCATCCATTCC^AGGAAGAGTGCGAATCCTTCCCGGAGGCCCTCAAGCCCGGCTGCAACTGGCGCTTCGACTGGTTCCPJVAAC600GCCGACAACCCGTCGGTCACCTTCCAGGAGGTGGCCTGCCCGTCGGAGCTCACGTCCAAG660AGCGGCTGCTCCCGTAACGACGACGGCAA(f，TCCCTGCCGTCCAGATCCCCTCCAGCAGC720ACCAGCTCTCCGGTCAACCAGCCTACCAGCACCAGCACCACGTCCACCTCCACCACCTCG780AGCCCGCCAGTCCAGCCTACGACTCCCAGCGGCTGCACTGCTGAGAGGTGGGCTCAGTGC840GGCGGCAATGGCTGGAGCGGCTGCACCACCTGCGTCGCTGGCAGCACTTGCACGAAGAT丁900AATGACTGGTKCCATCAGTGCCTGTAG927(2)SEQIDNO:3B的信息(i)序列特征(A)长度:(B)类型(C)链型308个H酸絲酸单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQIDNO:3B:MetHisLeuSerAlaThrThrGlyPheLeuAlaLeuProValLeuAli151015LeuABpGinLeuSerGlylieGiyGLnThrThrArgTyrTrpAspCy￡202530CysLysProSerCysAlaTrpProGlyLysGlyProSerSerProVaL354045GinAlaCysAspLysAsnAspAsnProLeuAsnAspGlyGlySerThr505560ArgSerGlyCysAspAlaGlyGlySerALaTyrMetCysSerSerGin65707580SerProTrpALaValSer:ABpGluLeuSerTyrGlyTrpAlaAlaVal859095Ly曰LeuAlaGlySerSerGluSerGinTrpCysCysAlaCysTyrG1l100105110LeuThrPheThrSerGlyProValAlaGlyLysLysMetlieValGlr115120125AlaThrAsnThrGlyGlyAspLeuGLyAspAsnHi^sPheAspLeuALa130135140lieProGLyGlyGLyVaLGLyILePheAsnAiaCysThrAspGinTyr14S150155160GlyAlaProProAsnGly丁r:pGlyAspArgTyrGlyGlylieHisSer165170175LysGluGluCysGluSerPheProGluAlaLeu乙ysProGlyCysAsn180185190TrpAxgPheAspTrpPheGinAsnAlaAspAsnProSerrValThrPhe195200205GLnGluValAlaCysProSerGLuLeuThrSerLysSerGLyCysSer210215220ArgAsnAspAspGlyAsnPheProALaVaLGLnIProSerSerSer22523023S240ThrSerSerProValAsnGinProThrSerThrSerThrThrSerThr24S250255SerThrThrSerSerProProValGinProThrThrProSerGLyCys260265270ThrAlaGLuAxgTrpAlaGinCysGLyGlyAsnGlyTrpSerGlyCys275280285ThrThrCysValAlaGlySerThrCysThrLysILeAsnAspTr:pTyr29029S300HisGinCyBLeu305(2)SEQIDNO:4的fl息(i)序列特征(A)长度888个威基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓朴结构线性(ii)分子型cDNA(vi)原始来源(A)生物体,酒糖酵母，DSM10082(xi)序列描述SEQIDNO:4:CCAGTGTGCTGGAAAGCCTTCGTGCTGTCCCCGACGTATCCCTGACCGCCATGCGTTCCA60CCAGCATCTTGATCGGCCTTGTTGCCGGCGTCGCTGCTCAGAGCTCTGGCTCTGGCCATA120CAACCAGGTACTGGGACTGCTGCAAGCCCTCATGCGCCTGGGATGAGAAGGCGGCTGTCA180GCCGGCCGGTCACAACATGCGACAGGAACAACAGCCCCCTTTCGCCCGGCGCTGTGAGCGGCTGCGACCCCAACGGCGTTGCATTCACCTGCAACGACAACCAGCCTTGGGCCGTAAACA300ACAATGTCGCCTACGGTTTTGCGGCTACCGCCTTCCCTGGTGGCAATGAGGCGTCGTGGT360GCTGTGCCTGCTATGCTCTTCAATTCACATCCGGCCCCGTTGCTGGCAAGACGATGGTTG420TGCAATCCACCAACACTGGCGGAGATCTCAGCGGCACTCACTTCGATATCCAGATGCCCG25480gtggaggtctcgocatcttcgacggctgcaCCCCGCAGTTCGGCTTCACGTTCCCCGGCA54030ACCGCTACGGCGGTACCACGAGCCGCAGCCAGTGCGCCGAGCTGCCCTCCGTCCTCCGTG600ACGGCTGCCACTGGCGTTACGAC丁CGTTCAACGATGCCGACAACCCCAACG丁CAACTGGC66035GCCGCGTCCGATGCCCGGCGGCCCTCACGAACCGCTCCXGCTGCG丁CCGCAACGACGACA720acagctaccccgtct丁cgagCCCGOCACGOGCACCCCGCCGACCCCCACGACCACGACTA40780CCAGCTCCCCtcctcagcccaccaacggcggagccggcggcac丁丁c丁cctcac丁ggggcc840AGTGCGGCGGCCAGGGCTGGTCTGGCCCGAcggcctgtgccggtgggtcgacctgcaacc900tgatcaacccgtgctactcccagtgcattccckactaagtgatccgggcattgcggtcga5960aag<kk;accgTTAGTCGACAAG<3cccagccagacctcaggcaggtggctgccatggcaga102010ttgtatatagtcttccgagtacatactattgaatgkaaataagagcggctcgga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CysAspAlaGlyGlyGlyAlaTyrMet202530CysSerSerHisSerProTrpAlaValSerAspSerLeuSerTyrGly354045TrpAlaAlaValArglieAlaGlyGinSerGlu-55(2)SEQIDNO:61的信息(i)序列特征(A)长度150个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓朴结构线性(ii)分子型cDNA(vi)原始来源(B)菌抹r力/eA3"'aMe/wo//〃a,CBS174.70(xi)序列描述SEQIDNO:61:AACGACAACCCCATCTCCAACACCAACGCTGTCAACGG丁TGTGAGGGTGGTGGTTCTGCT60TACGCTTGCTCCAACTACTCTCCCTGGGCTGTCAACGATGACCTTGCCTACGGTTTCGCT120GTTACCAAGATCTCCGGTGGCTCCGAGGCC150(2)SEQIDNO:62的信息(i)序列特征(A)长度50个氨基酸(B)类型氛基酸(C)链型单链(D)拓朴结构线性(n)分子类型肽(xi)序列描述SEQIDNO:62:AsnAspAsnProlieSerAsnThrAsnAlaValAsnGlyCysGluGly151015GlyGlySerAlaTyrAlaCysSerAsnTyrSerProTrpAlaValAsn202530AspAspLeuAlaTyrGlyPheAlaValThrLysGlyGlySer3540.eSer45(2)SEQIDNO:63的信息(i)序列特征(A)长度180个#对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓朴结构线性(H)分子型cDNA(vi)原始来源:(A)生物体:管毛壳，CBS799.83(xi)序列描述SEQIDNO:63:GTCAATCAGCCCATCCGAACGTGTAGTGCCAACGACTCGCCCTTGTCCGACCCAAATACC60CCAAGTGGCTGTGACGGTGGTAGCGCCTTCACTTGTTCCAACAACTCCCCGTGGGCAGTC120GATGACCAGACAGCTTATGGCTTTGCGGCAACAGCCATCAGTGGCCAGTCCGAGAGCAGC180(2)SEQIDNO:64的信息:(i)序列特征(A)长度60个a酸(B)类型H酸(C)链型单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述:SEQIDNO:64:ValAsnGinProlieArgThrCysSerAlaAsnAspSerProL^euSer151015AspProAsnThrProSerGlyCysAspGlyGlySerAlaPheThrCys202530SerAsnAsnSerProTrpAlaValAspAspGinThrAlaTyrGlyPhe354045AlaAlaThrAlalieSerGlyGinSerGluSerSer505560(2)SEQIDNO:65的4言息(i)序列特征(A)长度159个i^t(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓朴结构线性(ii)分子型cDNA(vi)原始来源C/w"頻'鹏Wre鮮/w，CBS547.75(xi)序列描述SEQIDNO:65:ACCTGCGACAAGAAGGACAACCCCATCTCTGATGCCAACGCCAAGAGCGGCTGTGATGGC60GGTTCTGCTTTCGCCTGCACCAACTACTCTCCCTTCGCCGTCAACGACAACCTCGCCTAC120GGTTTCGCTGCCACCAAGCTTGCTGGAGGCTCCGAGGCT159(2)SEQIDNO:66的j言息(i)序列特征(A)长度53个氨基酸(B)类型M酸(C)链型单链(D)拓朴结构线性(i0分子类型肽(xi)序列描述SEQIDNO:66:ThirCysAspLysLysAspAsnProlieSerAspAlaAsnAlaLysSer15GlyCysAspGlyGlySerAlaPheAlaCysThrAsnTyrSerProPhe202530AlaValAsnAspAsnLeuAlaTyrGlyPheAlaAlaThrLysLeuA-la"40"GlyGlyGluAla50(2)SEQIDNO:67的4言息(i)序列特征(A)长度81个g对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓朴结构线性(ii)分子型cDNA(vi)原始来源(B)菌沐葫芦科刺盘孢(xi)序列描述SEQIDNO:67:ACCTGCTACGCCAATGACCAGCGCATCGCCGACCGCAGCACCAAGTCCGGCTGCGACGGC60GGCTCGGCCTACTCCTGTTCT81(2)SEQIDNO:68的4言息(i)序列特征(A)长度27个#^酸(B)类型'.g酸(C)链型单链，(D)拓朴结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQIDNO:68:ThrCysTyrAlaAsnAspGinArglieAlaAspArgSerThrLysSer151015GlyCysAspGlyGlySerAlaTyrSerCysSer2025(2)SEQIDNO:69的信息(n序列特征(A)长度160个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(W拓朴结构线性(H)分子型cDNA(vi)原始来源(B)菌沐闪光须霉(xi)序列描述SEQIDNO:69:ACCTGTGACAAGAAGGACAACCCCATCTCA^ACTTGAACGCTGTCAACGGTTGTGAGGGT60GGTGGTTCTGCCTTCGCCTGCACCAACTACTCTCCTTGGGCGGTCAATGACAACCTTGCC'120TACGGCTTCGCTGCAACCAAGCTTGCCGGT_GGCTCCGAGG160(2)SEQIDNO:70的信息(i)序列特征(A)长度53个氨基酸(B)类型氣基酸(C)链型单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQIDNO:70:ThrCysAspLysLysAspAsnProlieSerAsnLeuAsnAlaValAsn151015GlyCysGluGlyGLyGlySerAlaPheAlaCysThrAsnTyrSerPro202530TrpAlaValAsnAspAsnLeuAlaTyrGlyPheAlaAlaThrLysLeu354045AlaGlyGlySerGlu50(2)SEQIDNO:71的4言息(i)序列特征(A)长度165个^fct(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓朴结构线性(ii)分子型cDNA(vi)原始来源粉红单端孢，IFO5372(xi)序列描述SEQIDNO:71:CCAGTAGGCACCTGCGACGCCGGCAACAGCCCCCTCGGCGACCCCCTGGCCAAGTCTGGC60TGCGAGGGCGGCCCGTCGTACACGTGCGCCAACTACCAGCCGTGGGCGGTCAACGACCAG120CTGGCCTACGGCTTCGCGGCCACGGCCATCAACGGCGGCACCGAG165(2)SEQIDNO:72的信息(n序列特征(A)长度55个氨基酸(B)类型l基酸(C)链型单链(D)拓朴结构线性(n)分子类型肽(xi)序列描述SEQIDNO:72:ProValGlyThrCysAspAlaGlyAsnSerProLeuGlyAspProLeu151015AlaLysSerGlyCysGluGlyGlyProSerTyrThrCysAlaAsnTyr202530GinProTrpAlaValAsnAspGinLeuAlaTyrGlyPheAlaAlaThr354045AlalieAsnGlyGlyThrGlu5055参考文献本发明的背景GB-A-1368599EP-A-0307564EP-A-0435876W091/17243WO91/10732WO91/17244WO95/24471WO95/26398酶学方法，1988，Vol.160，p.200-391(Wood,W.A.和Kellogg,S.T.编).Beguin，P.，"纤维素降解的分子生物学"，徵生物学年评(1990)，Vol.44，pp.219-248.Henrissat，B.，"纤维素酶和它们与纤维素的相互作用"，纤维素(1994)，Vol.1，pp.169—196.T.-M.Enveri，"微生物纤维素酶"，W.M.Fogarty,徵生物膝和生物技术，应用考牛学出版4土，183-224(1983).BSguin，P.和Aubert，J-P.,"纤维素的生物降解"，FEMS徵生物学回顾13(1994)25-58.Sheppard，P.O.等，"保守纤维素酶家族特异性序列在克隆Fusariumoxysporum纤维素酶同系物cDNA上的用途，基因，(1994)，Vol.15,pp.163-167.Saloheimo，A.等，"经在酵母中表达分离的7Wc力o&厂鹏reese/的新的小内切葡聚糖酶基因，eg/i1',分子生物学(1994)，Vol.13(2)，pp.219-228.■Arsdeli，J.N.等，(1987)Trichode簡reesei内切葡聚糖酵[在啤酒糖酵母中的克隆、特征确定和表达，生物/技术5:60-64.PenttUU，M.等，(1986)Trichoderraareesei纤维素酶基因之间的同源性内切葡聚糖酶I基因的完整的核苷^f列，基因15:253-263.Saloheimo，M.等，(1988)EG111，一种新的Trichodermareesei内切葡聚糖酶基因和酶两者的特机基因63:11-21.Gonz"es，R.等，"Trichodermalongibrachiatumeg〃基因的克隆、序列分析和在酵母中的克隆"，应用徵生物生物学(1992),VoL38，pp.370-375.Ooi，T等"棘孢曲霉的纤维素蘇(FI-CMCase)cDNA的克隆和序列分析"Curr.Genet.(1990),voL.18，pp.217-222.Ooi，T等，"编码AspergiUusacuieatus纤维素酶(F卜CMCase)的基因的完整的核苷絲列"核酸研究(1990),vol.18,No.19,P.5884.Xu，G.等，"多种厌氧rumen真菌Neocalliraastixpatriciarum纤维素酵cDNA在大肠杆菌中的克隆和表达"，遗传微生物学杂志(1992)，vol,138，pp.1413-1420.Xu，G.等，"新的编码具有高的内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和木聚糖酶活寸生的三>^多功能催4匕区的NeocalUraasUxpatriciarum多糖类水解酶c隨(ce/f,遗传微生物学(1992)，voL138，pp.2397-2403.Zhou，L.等，"厌氧真菌Neocallimastixpatriciarum的无内含子ce/"编码模式家族内切葡聚糖酶"，生物化学杂志(1994),voL.297，pp.359-364.Dalb小ge，H.和Heldt-Hansen，H.P.，"用于真菌酶基因有效表达克隆的新方、法"，Mol.Gen.Genet.(1994)，vol.243，pp.253—260.AU，B.R.S等，"厌氧真菌Piromyces的纤维素酶和半纤维素酶构成多蛋白纤维素-结合复合物和被多基因家族编码"，FEMS徵生物学通讯(1995)，vot.125，No.1，pp.15-21.日本DNA数据库(DDBJ).Wang,H.Y.和Jones，R.W."phytopathogenic真菌他c/7/7/咖/'朋/7力"eo///73内切葡聚糖Sl^编码基因的克隆、特征确定和功能性表达"，基因，158:125128,1995.Wang，H.Y.和Jones,R.W.:"从phytopathogenic真菌船crop力咖//73/j/a"o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和绵皮孔菌属CS^cy^/pe///》)。17.按照权利要求16的酶制剂，其中所i兌的酶是可以从属于由以下种的菌#^^得的黑J^耳(iloV/a^7a/2f/w/ow)、(7/7"//^///5sca6e7/a、;Mf"层孑L菌C^。迈"/b迈e"^3Wz/i")和叫；优r^ifc是可以从以下菌抹获得的黑胶耳CBS277.96、"<^e//aCBS280.96、^J^层孔菌CBS276.96和^>0/^/>5///、s/.CBS283.96。18.—种酶制剂，该S^制剂实质上由具有溶纤活性的酶组成，所述酶是可以vM^于壸菌门(CAK"/ff/o迈yco&)的菌^J^得的，这种酶包^4t自以下序列的MM列XaaThrArgXaaPheAsp5Caa1234567,'XaaThrArgXaaTyrAspXaa123'456■7和)XaaThrArgXaaTrp.AspXaa1234567其中，在4号位置上，Xaa是Trp、Tyr或Phe;和在1和7号位置上，Xaa是20个天然#^*基中的>^一个。19.按照权利要求18的酶制剂，其中在7号位置上的#^^基是半J!^酸(Cys)。20.按照权利要求18的Sl^J剂，其中在1号位置上的^4^M自天冬氨酸(Asp)、苏氨酸(Thr)和丙氨酸(Ala)。21.按照权利要求18_20之任一的酶制剂，其中所述的酶包含具有以下序列的由13个aM基组成的第一肽ThrArgXaaXaaAspCysCysXaaXaaXaaCysXaaTrp12345678910111213和具有以下序列的由5个a^基组成的第二肽TrpCysCysXaaCys12345中，第一序列的3号位置上，^J^^Trp、Tyr或Phe;第一序列的4号位置上，^酸是Trp、Tyr或Phe;第一序列的8号位置上，g酸是Arg、Lys或His;第一序列9、10和12号的各位置上，在第二序列的4号位置上，酸是20个天然#^#基中的任何一个。22.按照权利要求18-21^:任一的g^"〗剂，其中所i兑的酶是可以A^于壶菌纲(C4rmV/湖j^"e》的菌^lt得的，优^^是可以>^于由以下目的菌^l^得的壶菌目(07"^^'a/")、5Wze/io迈yce"/es、肋壶菌目他，c/^r/a/es)和芽枝霉目(》/a"oc/ad/a/e力。23.按照权利要求22的酶制剂，其中所说的酶是可以从属于i^/zeZ/oa^cefaceae科的菌抹获得的，优选的是可以从属于嚢壶菌属0力/加;力/j^〃力的菌抹获得的，更优选的是可以从属于红根嚢壶菌(^ko;/i7c〃s/wea)的菌抹获得的，尤其是可以从红根嚢壶菌CBS282.96获得的。24.—种酶制剂，该酶制剂实质上由具有溶纤活性的酶组成，所述酶是可以M于^^菌门U^咖yco")的菌^t得的，这种酶包含选自以下序列的#^^列XaaThrArgXaaPheAspXaa1234567.;XaaThrArgXaaTyrAspXaa1234-567J和"XaaThrArgXaaTrpAspXaa1234567其中，在4号位置上，Xaa是Trp、Tyr或Phe;和在1和7号位置上，Xaa是20个天然J^^基中的任何一个。25.按照权利要求24的酶制剂，其中在7号位置上的a^基是半其在在在在絲酸(Cys)。26.按照权利要求24的酶制剂，其中在1号位置上的a^基选自天冬氨酸(Asp)、苏氨酸(Thr)和丙氨酸(Ala)。27.按照权利要求24-26之任一的酶制剂，其中所述的酶包含具有以下序列的由13个M^基组成的第一肽ThrArgXaaXaaAspCysCy$.-XaaXaaXaaCysXaaTrp12345678910111213■和具有以下序列的由5个M^基组成的第二欣TrpCysCysXaaCys12345中，第一序列的3号位置上，M酸是Trp、Tyr或Phe;第一序列的4号位置上，Trp、Tyr或Phe;第一序列的8号位置上，#J^^AArg、Lys或His;第一序列9、10和12号的#置上，在第二序列的4号位置上，M^20个天然#^^基中的*时一个'28.按照权利要求24-27^^任一的酶制剂，其中所，说的酶是可以A^于接合菌纲(々^z^c^e》的菌抹获得的，优选的是可以从属于毛霉目鋒c/es)的菌#^得的。29.按照权利要求28的SH^J剂，其中所说的酶是可以城于由毛霉科(J/〃coracea)和枝霉科(rA3咖2V/aceae)的菌^J^得的，优选的是可以A^于由根毛霉属W力/zo/zw/cor)、须霉属(？Arco迈/ces)和刺枝霉属(C力a"ay,77"边)的菌#1^得的。30.按照权利要求29的酶制剂，其中所i兌的酶是可以从属于由y力/zo迈wcor;^/〃^、闪光须霉CP力7c0迈yces/7"e/s)、弗雷生刺枝霉(Oa"os"0^"迈/>6"/7//)的菌^_得的，优i^是可以Mj^于由以下菌抹的菌梯J^得的A^/zcrawcor/ws/〃usIF04578、闪光须霉IF04814和弗雷生刺枝霉NRRL2305。31.—种酶制剂，该酶制剂实质上由具有溶纤活'逸的SI组成，所述酶是可以从属于由Jrc力ae^co迈7ce^、盘菌纲.(i/sc0迈7c"e力、其在在在在/fer巡/a5^o/ffji^es、腔菌纲(丄ocw/o3sco迈7ee^)和不整嚢菌纲CP/ec&迈j^We》的菌;^^得的，这〕种酶包^4自以下序列的^^^列XaaThrArgXaaPheAspXaa1234567,.XaaThrArgXaaTyrAspXaa1234567,*和XaaThrArgXaaTrpAspXaa1234567其中，在4号位置上，Xaa是Trp、Tyr或Phe;和在1和7号位置上，Xaa是20个天然a^基中的任何一个。32.按照权利要求31的S^"剂，其中在7号位置上的a絲基是半缝酸(Cys)。33.按照权利要求31的酶制剂，其中在1号位置上的g^基选自天冬氨酸(Asp)、苏氨酸(Thr)和丙氨酸(Ala)。34.按照权利要求31-33之任一的酶制剂，其中所述的酶包含具有以下序列的由13个g自基组成的第一肽ThrArgXaaXaaAspCysCysXaaXaaXaaCysXaaTrp1234567891011—1213和具有以下序列的由5个a^基组成的第二肽TrpCysCysXaaCys12345其中，在第'一序列的3号位置上，^酸是Trp、Tyr或Phe;在第一序列的4号位置上，a^Trp、Tyr或Phe;在第一序列的8号位置上，Arg、Lys或His;在第一序列9、10和12号的#置上，在第二序列的4号位置上，酸是20个天然M酸残基中的任何一个'35、按照权利要求31-M之任一的SH"剂，其中所说的酶是可以M于由以下目的菌抹Jl得的盘菌目(户ez/za7es)、户/y^/s迈a^ies、座嚢菌目36.按照权利要求35的酶制剂，其中所说的酶是可以从属于由以下科的菌抹获得的葫芦霉科(CtfCuW/"r/aceae)、斑痣盘菌科(^Fr/s鹏&ceae)、粪盘菌科C^co&o/3cese)和发菌科(7Wc力oc咖ace3e);优选地是由属于由以下属的菌抹产生的色二孢属(历》/6^/a)、Wemy/^erojw/s、〃/os/70,a、壳球^&>^(船croj9力咖2'加)、粪盘菌属(J5w6o/〃s)、5^cco6o/ws、青霉属CPe刀/ci7//—和37.按照权利要求36的酶制剂，其中所说的酶是可以从属于由以下种的菌抹获得的棉色二孢(/^》/o"iagoss7p/加)、Wcmsr/^e,,^<s/7.、Wc^ora6//^t譜//、胞cro/7力咖/加、^co6o7w51、5^cco6W^力./WeZ/iAy、疾抱青霉(户e"/ci7/Z咖mm/ci7/c^z/忠)、产黄青霉(/te//c/"/鹏c力rj^SY^e/咖)和7&orao/z^"pwtwco^stw;优选地是可以从属于由以下菌抹的菌抹获得的棉色二孢CBS274.96、〃Awpora6//^r諸//NKBC1444、胞"o/;力咖/加pAa<yeo///wCBS281.96、A"o6o/m^///We//wCBS275.96、疾孢青霉ATCC62396、产黄青霉ATCC9480和77ei7270边/cesKerrwcos^CBS285.96。38.—种酶制剂，该酶制剂实质上由具有溶纤活性的酶组成，所述酶是可以从属于由间座壳目("/a;wr"/e力、岌角菌目Ur/ar/s/e》、7y/c/ca/j/aer/a和黑症-菌目C^//"cAw<2的菌抹^:得的，这种酶包*自以下序列的#^^列XaaThrArgXaaPheAspXaa1234567,'XaaThrArg'XaaTyrAspXaa1234567;和XaaThrArgXaaTrpAspXaa1234567其中，在4号位置上，Xaa是Trp、Tyr或Phe;和在1和7号位置上，Xaa是20个天然^^1^^基中的任何一个。39.按照权利要求38的酶制剂，其中在7号位置上的^^g基是半絲酸(Cys)。40.按照权利要求38的酶制剂，其中在1号位置上的#^,基选自天冬氨酸(Asp)、苏氨酸(Thr)和丙氨酸(Ala)。41.按照权利要求38-40之任一的酶制剂，其中所述的酶包含具有以下序列的由13个M^基組成的第一肽ThrArgXaaXaaAspCysCysXaaXaaXaaCysXaaTrp丄2345678910111213和具有以下序列的由5个#^#基组成的第二肽TrpCysCysXaaCys12345其中，在第一序列的3号位置上，Trp、Tyr或Phe;在第一序列的4号位置上，Trp、Tyr或Phe;在第一序列的8号位置上，M乾乏Arg、Lys或His;在第一序列9、10和12号的Ki置上，在第二序列的4号位置上，酸是20个天然a^基中的任何一个。42.按照权利要求38-41:^任一的酶制剂，其中所、说的SI是可以从属于由以下科的菌林的菌抹获得的炭角菌科Uy/ar2'"eae)、黑腐皮壳科(^"sceae)和"c力oraceae，优i^Nfc是可以于由以下属的菌#^_得的间座壳属("/"orz^e)、刺盘孢属(6W/eM"/c/咖)、黑孢属W^ro柳ra)、炭角菌属U>/"ia)、^油7/，r咖和孑L座壳属(尸aro/7/a)。43.按照权利要求42的酶，其中所i兌的酶是可以M于由以下种的菌抹获得的"/，rf力es/，/ze".a、葫芦科刺盘孢(6W/efofr/由迈/age/7sr/wzz)、A7^ro印ora、鹿角团炭角菌U>/a/7a力j770A7/0/2)、yVb^/zy/y^/^r^z/和,j、孑L座壳(尸oro//a/w/CaA3)，优选地是可以M^于由以下菌抹的菌^t得的"/a/7or^e;^/^e/e5"/aCBS278.96、葫声科刺盘孢ATCC52609、A7^rosporaCBS272.96和鹿角团炭角菌CBS284.96。44.一种酶制剂，该酶制剂实质上由具有溶纤活性的酶组成，所述酶是可以y^y萬于由小赤壳科(Afec"/aceae),粪壳科GSbiY/ar/aceae),毛壳科菌抹和属于顶孢霉属(Jcrezffo/7/咖)，粘帚霉属(67/oc/W/"迈)，i"c7^3//"/w范，柱^1^(6^///^ro(^r;7朋)和周刺座霉属(&/""//<3)的菌抹获得的，il种酶包^^自以下序列的m^酸亭列XaaThrArgXaaPheAspXaa1234567,.XaaThrArgXaaTyrAspXaa12345.67和XaaThrArg'XaaTipAspXaa123.4567其中，在4号位置上，Xaa是Trp、Tyr或Phe;和在1和7号位置上，Xaa是20个天然M^基中的任何一个。45.按照权利要求44的酶制剂，其中在7号位置上的g^基是半il^酸(Cys)。46.按照权利要求44的酶制剂，其中在1号位置上的M^M自天冬氨酸(Asp)、苏氨酸(Thr)和丙氨酸(Ala)。47.按照权利要求44-46之任一的酶制剂，其中所述的酶包含具有以下序列的由13个a^基組成的第一肽Tl;rArgXaaXaaAspCysCys.XaaXaaXaaCysXaaTrp12■345678910111213和具有以下序列的由5个a^基组成的第二肽TrpCysCysXaaCys2345中，第一序列的3号位置上，Trp、Tyr或Phe;第一序列的4号位置上，^酸是Trp、Tyr或Phe;第一序列的8号位置上，Arg、Lys或His;其在在在在第一序列9、10和12号的Ki置上，在第二序列的4号位置上，酸是20个天然^J^i^基中的任何一个。48.按照权利要求44-47之任一的酶制剂，其中所说的酶是可以从属于由以下属的菌抹获得的柱孢属(6W//2^Ycar^/7)、丛赤壳属(#e"r/3)、周刺座霉属(&/〃"//3)、粪壳属(5or&r/a)、梭孢壳属(r力/e/37ia)、Sypastospora、毛壳属(6^ef咖/wz)、毁丝霉属旨ce7/》/力fMra)、5^F"/W咖、"acforr力/iJ咖、粘帚霉属(C7ioc/ad/咖)、顶孢霉属(Jcre咖//咖)。49.按照权利要求48的酶制剂，其中所说的酶是可以从属于由以下种的菌抹获得的Wy"^"ocar;70i7s/7.、Afe"r/a"/"ea、PWu,e"a、粪生粪壳(5brc^Wa/7肌？o/a)、大孢粪壳Cforfl^r/a分,5^o^/7orato/7/"e/57s、67s由iT力ii2咖/"oecw/^/7^/迈咖、墙毛壳f力er卿/7力//3、链孢祐帚霉(67/o^d/z//zc"e"w/""/z)、Scj^Z/^/mMei7zw/7力i73和J^re边朋/w/z优i^fc是可以/M^于由以下菌抹的菌抹获得的链孢粘帚霉ATCC10523和CBS227.48、^"r/a//"eaCBS279.96、F<x/"fe//<2co7/"orr/c/w/ctesCBS400.58、粪生粪壳ATCC52644、大孢粪壳ATCC60255、r力/eh"'a^rre"r"NRRL8126、77/e/ar2."/e/YBo/;A//aCBS174.70、墙毛壳CBS163.52、C/ae飾/咖FimycmyCBS547-75、C力a"湖/〃迈6ra"7/e""、CBS122.65、C力a"咖/鹏cu/72'co/or咖CBS799.83、to/ne/"細C1515、^7adorr力/y3咖/becw/7C^s/迈鹏ATCC62373、妙ce/一/^力oraf力er迈0p力/7aCBS117-65、^cj^3/7^/2'咖f力er巡o/7力//4ATCC28085和Jore/zk/iw迈早CBS478.94<50.—种酶制剂，该酶制剂实质上由具有溶纤活性的酶组成，所述酶是可以M^于由番蒜錄孢(,usar/咖/yc。pers/"')、/^ar/w迈/^si/7ora、腐皮^:孢(尸iAyar/咖so/a//)、蛇形镰孢(/^iAar/"zzs/7^7/o/f/es)、早熟禾镰孢(尸"sar/"迈戶e)、黑腐质霉(〃膨Wa/2'^resce/力和灰腐质霉G7鹏y"/a^r"ea)的菌梯J^得的，这种酶包>^自以下序列的#^^列:xaaThrArgXaaPheAspXaa1234567XaaThrArgXaaTyrAspXaa1234567,..和XaaThrArgXaaTrpAspXaa1234567其中，在4号位置上，Xaa是Trp、Tyr或Phe;和在1和7号位置上，Xaa是20个天然M^基中的任何一个。51.按照权利要求50的酶制剂，其中在7号位置上的M^基是半J^酸(Cys)。52.按照权利要求50的S^^剂，其中在1号位置上的M^M自天冬氨酸(Asp)、苏氨酸(Thr)和丙氨酸(Ala)。53.按照权利要求50-52之任一的酶制剂，其中所述的酶包含具有以下序列的由13个^tJ^^基組成的第一肽ThrArgXaaXaaAspCysCysXaaXaaXaaCysXaaTrp123456789■101112i3和具有以下序列的由5个U^基组成的第二肽TrpCysCysXaaCys12345其中，在第一序列的3号位置上，a酸是Trp、Tyr或Phe;在第一序列的4号位置上，#J^lTrp、Tyr或Phe;在第一序列的8号位置上，^J^是Arg、Lys或His;在第一序列9、10和12号的#置上，在第二序列的4号位置上，酸是20个天然M^基中的任何一个。54.按照权利要求53^L任一的酶制剂，其中所说的酶是可以从属于由以下菌林的菌抹获得的番痴尖錄抱(尸"sar/咖0je75^0r咖7/co/ers/"')CBS645.78、尖^^孢pa^277oraCBS744.79、腐皮镰孢IMI107.511、蛇形镰孢IFO4467、早熟禾镰孢ATCC60883、黑腐质霉CBS819.73和灰腐质霉ATCC22726。55.按照权利要求14-17、21-23、27-30、34-37、41—43、47-49、53和54之任一的酶，其中在第一序列的9号位置上的狄絲絲自脯氨酸、苏氨酸、幾氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、笨丙氨酸、甘氨酸、半;i^酸、天冬《、谷氨SfcJ疾、酪氨酸、丝氨酸、甲磁裒酸和色氨酸，优选地选自脯氨酸和苏氨酸。56.按照权利要求14-17、21—23、27-30、34-37、41-43、47-49、53和54之任一的酶，其中在第一序列的10号位置上的gg基选自脯氨酸、苏氨酸、纈氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬耽胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丝氨酸、甲磁氨酸和色氨酸，优M是丝氨酸。57.按照权利要求14-17、21-23、27—30、34-37、41—43、47-49、53和54^^任一的酶，其中在第一序列的12号位置上的a^^M自脯氨酸、苏氨酸、缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、半a酸、天冬酖胺、谷氨跣胺、酪氨酸、丝氨酸、甲磁氨酸和色氨酸，优i^i也选自丙氨酸^"氣酸。58.按照权利要求14-17、2卜23、27—30、34-37、41-43、47-49、53和54之任一的酶，其中在第二序列的4号位置上的a^基选自脯氨酸、苏氨酸、缦氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、笨丙氨酸、甘氨酸、半皿酸、天冬跣胺、谷氨StJ疾、酪氨酸、丝氨酸、甲磁袁酸、色氨酸、谷氨酸和天冬氨酸，选自丙氨酸、甘氨酸和谷氨^Jfe'59.按照权利要求14-17、21-23、27-30、34—37、41-43、47-49、53和54之任一的酶，其中在笫一序列的第3号位置上的M^基是酪氨酸；或在第4号位置上的#^^基是色氨乾或在第8号位置上的氨基絲基是赖氨酸。60.—种DM构建化该构建体编码按照权利要求11-59之任一的酶。61.按照权利要求14-17、21-23、27—30、34-37、41-43、47—49、和54之任一的酶制剂，其中所i兌的第一序列包M自以下序列的a絲列ThrArgTyxTrpAspCysCysLysProSerCysi^tlaTrp123456789101112137ThrArgTyrTrpAspCysCysLysThrSerCysAlaTrp12345678910111213,.—ThrArgTyrTrpAspCysCysLysProSerCysGlyTrp1234567891011121362.—种提供微生物菌抹的方法，所述菌抹包含编码存在于按照权利要求1-9、11-59和61之任一酶制剂中的酶的基因，该方法包括在标准条件下与图1所示的任何保守区的寡核苷酸杂交(例如PCR扩增)。63.按照权利要求62的方法，其中所说的寡核苷酸包含编码包含在选自以下序列的肽中的至少五肽的核苷酸亭列a.ThrArgXaaXaaAspCysCysXaaXaaXaaCysXaaTrpXaa12,34'5678'91011121314在3或4在号位置上的#^酸是Trp、Tyr或Phe;在8号位置上的^^酸是Arg、Lys或His;在9、10、12和14号位置上的^^酸分别是20个天然M^基中的任何一个；和b.TrpCysCysXaaCysTyr123456在4号位置上的M酸是20个天然^^^基中的^T一个；和c.XaaProGlyGlyGlyXaaGlyXaaPhe1234567891号位置上的g酸是Met或lie;6和8号位置上的M酸分别是Leu、Ile或Val;和d.GlycysXaaXaaArgXaaAspTrp^(aa"123456789在3号位置上的M^l20个天然^^g基中的^K一个-，在4和6号位置上的g酸分別是Trp、Tyr或Phe;并且在9号位置上的^J^^I:Phe或Met。64.按照权利要求62的方法，其中所说的寡核苷酸包含互补于权利要求63的序列的核普M^列。65.按照权利要求63的方法，其中所说的暮法苷酸相应于选自以下PCR引物的PCR引物有义，5'-CCCCAAGCTTACIA/cGITAC/tTGGGAC/tT'gC/tTGC/tAAA/gA/cC-S'反义l，5,-CTAGTCTAGATAVoCiAIGCVoCAVoCAcC-3';反义2,5,-CTAGTCTAGAAAIAA/G/TICCIAA/C/0ICCICCICCIGG_3',.和','反义3，5，-CTAGTCTAGAIAACCAA/0TCAA/0A/TAIC0/TCC-3'.66.—神DM构建体，该构建体包^^编码显示溶纤活性^L^的DNA序列，所述DNA序列包括a)SEQIDNO:1中所示的DNA序列和/或可以>^哞酒糖酵母DSM9770中的质粒获得的DM序列，或者b)SEQIDNO:1中所示的DM序列的类似物或可以从哞酒糖酵母DSM9770中的质粒获得的DNA序列的类似物，该类似物i)同源于，优选地至少70y。同源于SEQIDNO:1中所示的DM序列和/或可以从哗酒糖酵母DSM9770中的质棒获得的DM序列，ii)在本文所描述的条-件下与SEQIDNO:1中所示的DM序列和/或可以A^哞酒糖酵母DSM9770中的质粒获得的DM序列的相同核苷酸探针杂交，iii)编码一种多肽，该多肽同源于，优逸地至少65y。同源于由一种DNA序列编码的多肷，所述DM序列包含SEQIDNO:1中所示的DNA序列和/或可以从哞酒糖酵母DSM9770中的质^H得的DNA序列，iv)编码一种多肽，该多肽是与一种抗纯化内切葡聚糖酶的抗体免疫学>^应性的，所述内切葡聚^^酶由SEQIDNO:1中所示的DNA序列或可以从啤酒糖酵母DSM9770中的质粒获得的DNA序列编码.67.按照权利要求66的DM构建來其中所述的DM序列是从一种DNA文库分离的或者是以该DNA文库为基础产生的，所述DNA文库是属于毛壳科的菌椒优M是属于毁丝霉属的菌歉特别是属于脱""迈0"力//3的菌朱尤其是^f力er迈op力i7aCBS117.65的文库。68.—种DNA构建体，该构建体包含编码显示内切葡聚糖酶活性:^的DM序列，所述DNA序列包括a)SEQIDNO:4中所示的DNA序列和/或可以从哞酒糖酵母DSM10082中的质粒获得的DNA序列，或者b)SEQIDNO:4中所示的DNA序列的类似物或可以从哞酒糖酵母DSM10082中的质粒获得的DNA序列的类^f以物，该类似物i)同源于，优选地至少70。/。同源于SEQIDNO:4中所示的DM序列和/或可以从哞酒糖酵母DSM10082中的质粒H得的DNA序列，ii)在本文所描述的条件下与SEQIDNO:4中所示的DM序列和/或可以从啤酒糖酵母DSM10082中的质M得的DNA序列的相同核苷酸^:针杂交，iii)编码一种多肽，该多肽同源于，优选地至少60y。同源于由一种DNA序列编码的多ftt所述DNA序列包含SEQIDNO:4中所示的DM序列和/或可以从哞酒糖酵母DSM10082中的质粒获得的DNA序列，iv)编码一种多狀，该多肽是与一种抗纯化内切葡聚糖酶的抗体免疫学反应性的，所述内切葡聚糖酶由SEQIDNO:4中所示的DM序列或可以从啤酒糖酵母DSM10082中的质粒获得的DNA序列编码-69.按照权利要求68的DNA构建朱其中所述的DNA序列是v^—种DNA文库分离的或者是以该DNA文库为基础产生的，所述DNAib^是属于肉座菌科(Ay/70creaceae)的菌抹，优选地是属于顶孢霉属的菌抹，特别是Jc酒o刀/t;迈印.CBS478.94的il^。70.—种DNA构建^s该构建体包含编码显示内切葡聚糖酶活性之酶的DM序列，所述DM序列包括a)SEQIDNO:6中所示的DM序列或可以从啤酒糖酵母DSM10080中的质粒获得的DNA序列，或者的DNA序列的类似物或可以^J年酒糖酵母DSM10080中的质粒获得的DM序列的类似物，该类似物i)同源于，优逸也至少65。/。同源于SEQIDNO:6中所示的DNA序列或可以从哞酒糖酵母DSM10080中的质粒获得的DNA序列，ii)在本文所描述的条件下与SEQIDNO:6中所示的DM序列或可以从哞酒糖酵母DSM10080中的质粒获得的DNA序列的相同核苷酸探针杂交，iii)编码一种多肽，该多肽同源于，优选地至少70。/。同源于由一种DNA序列编码的多欣，所述DNA序列包含SEQIDNO:6中所示的DNA序列或可以从啤酒糖酵母DSM10080中的质粒H得的DNA序列，iv)编码一种多肽，该多肽是与一种抗纯化内切葡聚糖鲦的抗体免疫学A^应性的，所述内切葡聚糖酶由SEQIDNO:6中所示的DNA序列或可以从哞酒糖酵母DSM10080中的质粒获得的DNA序列编码。71.按照权利要求70的DNA构建化其中所述的DNA序列是从一种DM文库分离的或者是以该DNA文库为基础产生的，所述DNA文库是属于fi^"o/z/ceae科的菌沐优i^是属于顶孢^v^的菌沐特別是力cre迈o//咖CBS478.94的M。72.—种DNA构建朱该构建体包含编码显示内切葡聚糖酶活性^J^的DNA序列，所述DM序列包括a)SEQIDNO:8中所示的DM序列或可以v^，年酒糖酵母DSM10081中的质粒获得的DNA序列，或者b)SEQIDNO:8中所示的DNA序列的鮝似物或可以从哞酒糖酵母DSM10081中的质粒lt得的DNA序列的类似物，该类似物i)同源于，优选fe至少75y。同源于SEQIDNO:8中所示的DNA序列或可以从啤酒糖酵母DSM10081中的质粒获得的DM序列，ii)在本文所描述的条件下与SEQIDNO:8中所示的DNA序列或可以从哞酒糖酵母DSM10081中的质粒获得的DNA序列的相同核苷酸探针杂交，iii)编码一种多肽，该多肽同源于，优逸地至少70y。同源于由一种DNA序列编码的多肽，所述DNA序列包含SEQIDNO:8中所示的DNA序列或可以从哗酒糖酵母DSM10081中的质粒获得的DNA序列，iv)编码一种多欣，该多版是与一种抗纯化内切葡聚糖酶的抗体免疫学　;^应'li的，所迷内切葡聚糖酶由SEQIDNO:8中所示的DM序列或可以从啤酒糖酵母DSM10081中的质粒获得的DNA序列编码。73.按照权利要求72的DNA构建体，其中所述的DNA序列是从一种DM文库分离的或者是以该DNA文库为基础产生的，所述DNAi^是属于毛壳科的菌歉优i4^;^属于r力2'e/a^a^rrestr/s的菌朱特别是7T/e/ar/afe/Te""腿L8126的iL^。74.—种DNA构建化该构建体包含编码显示内切葡聚糖酶活性^JI的DNA序列，庐斤述DNA序列包括a)SEQIDNO:10中所示的DNA序列或可以从;tJ^杆菌DSM10512中的质粒获得的DNA序列，或者b)SEQIDNO:10中所示的DNA序列的类似物或可以从大肠杆菌DSM10512中的质粒获得的DNA序列的类似物，该类似物i)同源于，优逸地至少65X同源于SEQIDNO:IO中所示的DNA序列或可以从大肠杆菌DSM10512中的质粒获得的DM序列，ii)在本文所描述的条件下与SEQIDNO:10中所示的DNA序列或可以从大肠杆菌DSM10512中的质粒获得的DNA序列的相同核普酸探针杂交，iii)编码一种多狀，该多狀同源于，优i^fc至少55X同源于由一种DM序列编码的多肽，所述DM序列包含SEQIDM):IO中所示的DM序列或可以从:^杆菌DSM10512中的质粒获得的DM序列，iv)编码一种多肽，该多肽是与一种抗纯化的内切葡聚糖酶的抗体免疫学反_应'法的，所迷内切葡聚糖酵由SEQIDNO:10中所示的DM序列或可以从:U^杆菌DSM10512中的质粒获得的DNA序列编码。75.按照权利要求74的DNA构建朱其中所述的DNA序列是从一种DNA文库分离的或者是以该DNA文库为基础产生的，所迷DMiL^是属于斑痣盘菌科的菌歉优M是属于壳球孢属的菌歉特别是属于胞cr叩力tMi加//，o//"s的菌昧尤其是乂CBS281.96的^>^。76.—种DNA构建朱该构建体包含编码显示内切葡聚糖酶活性^#的隨序列，所述DNA序列包括a)SEQIDNO:12中所示的DM序列或可以从:杆菌DSM10511中的　质粒获得的DM序列，或者b)SEQIDNO:12中所示的DM序列的类合又物或可以从大肠杆菌DSM10511中的质粒lt得的DNA序列的类似物，该类似物i)同源于，优^ifc至少60。/n同源于SEQIDNO:12中所示的DNA序列或可以从大肠杆菌DSM10511中的质粒获得的DNA序列，H)在本文所描迷的条件下与SEQIDNO:12中所示的DNA序列或可以从大肠杆菌DSM10511中的质粒获得的DNA序列的相同核苷酸探针杂交，iii)编码一种多Jlt该多肽同源于，优选fe至少60y。同源于由一种DM序列编码的多At所述DM序列包含SEQIDNO:12中所示的DNA序列或可以从大肠杆菌DSM10511中的质粒获得的DM序列，iv)编码一种多肽，该多肽是与一种抗纯化内切葡聚糖酶的抗体免疫学反应性的，所述内切葡聚糖酶由SEQIDNO:12中所示的DM序列或可以从:^杆菌DSM10511中的质粒^l得的DM序列编码。77.按照权利要求76的DNA构建A其中所述的DNA序列是从一种DNA文库分离的或者是以该DNA文库为基础产生的，所述DNA文库是属于口蘑科的菌抹，优选地是属于毛皮伞属的菌抹，特别是属于CW/2/》e//"的菌狐尤其是C.sca6e//aCBS280.96的iL^。78.—种DNA构建体，该构建体包含编码显示内切葡聚糖酶洽汰:^的DNA序列，所迷DNA序列包括a)SEQIDNO:16中所示的DNA序列或可以从大肠杆菌DSM10571中的质粒获得的DM序列，或者b)SEQIDNO:16中所示的DM序列的类似物或可以从大肠杆菌DSM10571中的质粒获得的DNA序列的类似物，该类似物i)同源于，优逸地至少70。/。同源于SEQIDNO:16中所示的DNA序列或可以从大肠杆菌DSM10571中的质粒获得的DM序列，ii)在本文所描述的条件下与S印IDNO:16中所示的DM序列或可以从大肠杆菌DSM10571中的质粒获得的DNA序列的相同核苷酸探针杂交，iii)编码一种多肽，该多狀同源于，优选地至少60y。同源于由一种DM序列编码的多欣，所述DNA序列包含SEQIDNO:16中所示的DM序列或可以从雄杆菌DSM10571中的质粒获得的DM序列，iv)编码一种多肽，该多肽是与一种抗纯化内切葡聚糖酶的抗体免疫学>^应性的，所述内切葡聚糖酶由SEQIDNO:16中所示的DM序列或可以从:^杆菌DSM10571中的质粒获得的DNA序列编码。79.按照权利要求78的DNA构建体，其中所述的DM序列是从一种DNA文库分离的或者是以该DM文库为基础产生的，所述DNA文库是属于周刺座霉属的菌朱优i^fc是属于ro/We/hcoy/e/^/Lr/Woicfes的菌朱特另'Jco""o"oc力o^/esCBS權.58的文库。80.—种DNA构建化该构建体包含编码显示内切葡聚糖酶活性^JI"的DNA序列，所述DNA序列包括a)SEQIDNO:19中所示的DNA序列或可以从大肠杆菌DSM10576中的质粒获得的DNA序列，或者b)SEQIDNO:19中所示的DNA序列的类似物或可以从大肠杆菌DSM10576中的质粒获得的DNA序列的类似物，该类似物i)同源于SEQIDNO:19中所示的DM序列或可以从大肠杆菌DSM10576中的质^lt得的DNA序列，U)在本文所描述的条件下与SEQIDNO:19中所示的DNA序列或可以从;^杆菌DSM10576中的质粒获得的DM序列的相同核香酸探针杂交，iii)编码一种多肽，该多肽同源于由一种DNA序列编码的多肽，所述DNA序列包含SEQIDNO:19中所示的DM序列或可以从大肠軒菌DSM10576中的质^t得的DNA序列，iv)编码一种多肽，该多肽是与一种抗纯化内切葡聚糖酶的抗体免疫学反应性的，所迷内切葡聚糖酶由SEQIDNO:19中所示的DM序列或可以从JU^杆菌DSM10576中的质粒获得的DNA序列编码'81.按照权利要求80的DM构建体，其中所述的DNA序列是从一种DNA文库分离的或者是以该DNA文库为基础产生的，所述DNAi^M于粪壳科的菌^优狄是属于粪壳属的菌朱特別属于粪生粪壳的菌椒尤其是粪生粪壳ATCC52644的i^。82.按照权利要求66-81之任一的DM构建化该构建体还_包含编码纤维素-结^^域的DNA序列。83.权利要求82的DM构建氛该构建体还包含编码纤维素-结合域(CBD)的DNA序列，所述纤维素-结^、域和由所述DM构建体之DNA序列编码的酶的酶核心(催化活',是可絲连接的。84.—种重组表达载朱该载体包^^按照权利要求62-83之任一的DNA构建体。85.—种细胞，该细胞包含按照权利要求66-83之任一的的DM构建体或按照权利要求84的重组表达载体。86.按照权利要求85的细胞，该细胞是真核细胞，特别真菌细胞，如酵母细胞或丝状真菌细胞，或所逸基因所来源的内源性细胞。87.按照细胞权利要求86的细胞，其中所i兌的细胞属于曲霉属(^perw'"u;)、(尸"wr/w边)或木霉属(7Wc/Oflter鹏)的菌抹，特别是禾^^#:孢(,wsariwyz^razw'T/esr^zd、，累曲霉C^/7er^77/ws"/ger)或米曲88.—种产生显示内切葡聚糖酶活性的酶的方法，该方法包括在可以产生所迷酶的务阵下，培养按照权利要求85-87之任一的细胞，并从培*中回收所述的酵。89.—种显示内切葡聚糖酶活性的酶，该酶a)由按照权利要求66-83之任一的DNA构建体编码，b)由按照权利要求88的方法产生，或c)是与一种抗纯化内切葡聚糖酶的抗体免疫学反应性的，所述内切葡聚糖酶由序列表SEQIDNO:1、4、6、8、10、12、16、19^_任一所示的DNA序列编码。90.—种使要洗的衣物颜色澄清的方法，该方法包括用包^^按照权利要求1-9、11-61和89之任一的酶制剂的浸泡、洗涤或冲洗液体处理要洗的衣物。91.按照权利要求90的方法，其中所说的要洗的衣物用洗;^L处理.92.按照权利要求90或91的方法，其中所说的内切葡聚糖酶^器循环使用条件下，以每升液体1到1000S-CEVU,优i^fc是5到200S-CEVU的有效量存在于浸泡、洗涤或冲洗液体中。93.按照权利要求90-92:^任一的方法，其中所说的浸泡、洗涤或冲洗液体的最适pH在4和11之间，优i^fe在6和10.5之间。94.按照权利要求90-93之任一的方法，其中温度在15"和60t:之间。95.按照权利要求90-94之任一的方法，其中所，说的浸泡、洗涤或冲洗液体还包含一种或多种选自蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、淀粉酶、脂酶、过氧化物酶和^S^的酶。96.—种洗^J且合物，该组合物包含:接照权利要求1-9、11-61和89之任一的酶制剂，以及选自表面活性剂、助洗剂化合物和织物软化剂的化絲。97.按照权利要96的洗衣組合物，该组合物还包含一种或多种选自蛋白酶、淀粉酶、脂酶、纤维素酶、木聚糖酶、过氧化物酶和*的酶。98.按照权利要求97的组合物，其中所说的表面活性剂是非离子、阴离子、阳离子、两性离子、两，Ml兼性表面活性剂。99.按照权利要求98的组合物，其中所说的织物软化剂是阳离子或非离子^t化剂，优M是季^f匕合物，并且其可以进一步包含或不包含一种或多种选自表面活性剂、电解质、緩冲液、抗氧剂和液态载体的化合物。100.按照权利要求l-9、11-61和89之任一的酶在降解或修饰植物材料(例如细胞壁)上的用途。101.按照权利要求l-9、U-61和89之任一的酶在处理织物原料或织物，优M是在防止背染、生物抛光或"石洗"纤维素织物中的用途。102按照权利要求1-9、1卜61和89之任一的酵在处理纸浆，优选地是在剥树皮、脱纤维、纤维改性、S^^墨或改善排水中的用途。103.—种酶制剂，该制剂富含按照权利要求l-9、11-61和89的显示溶纤活性的酶。104.按照权利要求103的^l剂，该制剂还包含一种或多种选自半乳聚糖酶、木聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、果胶乙酰酷酶、聚丰乳糖醛酸酶、鼠李半乳糖搭酸酶、果,解酶、M酸盐裂解酶、内切葡聚糖酶、果胶甲酯酶、蛋白酶、脂酶、淀粉酶、角质酶、过氧化物酶、漆酶、纤维二糖水解酶和转谷氨,酶的酶。全文摘要一种在洗涤剂，洗涤，纺织和造纸纸浆应用中性能良好的酶制剂，该制剂实质上由具有溶纤活性的酶组成，所述酶包含具有序列ThrArgX3X4AspCysCysX8X9X10CysX12TrpX14(其中X3和X4各自分别是Trp、Tyr或Phe；X8是Arg、Lys或His；X9、X10、X12和X13各自是20个天然氨基酸残基中的任何一个)的14个残基的第一氨基酸序列和具有序列TrpCysCysXX4Cys(其中XX4是20个天然氨基酸残基中的任何一个)的5个残基的第二氨基酸序列，其条件是在第一氨基酸序列中，(i)当X12是Ser时，X14不是Ser，和(ii)当X12是Gly时，X14不是Ala。文档编号C12N9/42GK101173263SQ20071018163公开日2008年5月7日申请日期1996年3月18日优先权日1995年3月17日发明者L·N·安德森,L·朗厄,M·S·考皮宁,M·伊哈拉,M·肖莱恩,R·I·尼尔森,S·F·拉森,S·塔卡基申请人:诺沃奇梅兹有限公司