粘膜炎莫拉氏菌basb111多肽和多核苷酸的制作方法

专利名称：粘膜炎莫拉氏菌basb111多肽和多核苷酸的制作方法
技术领域：
本发明涉及多核苦酸(本文中称"BASB111多核苷酸")、它们编 码的多肽(本文中称"BASB111"或"BASB111多肽")、重组物质以 及它们的制备方法。在另一个方面，本发明涉及使用这种多肽和多核 苷酸包括抵抗细菌感染的疫苗的方法。再一方面，本发明涉及检测某 些病原体感染的诊断试验。
背景技术：
粘膜炎莫拉氏菌(粘膜炎布兰汉氏球菌)是一种能经常从人的上 呼吸道分离到的革兰氏阴性细菌。它导致几种疾病，主要是嬰幼儿中 耳炎和老年人肺炎。它也引起鼻窦炎和医院内感染，偶尔还会引起侵 袭性疾病。
中耳炎从病例数量和其后遗症来讲是重要的儿童疾病。在美国年 发病350万例以上，据估计80%的儿童在3岁之前会罹患中耳炎至少 一次(Klein, JO (1994) Clin. Inf. Dis., 19:823 )。如未得到治疗或转为 慢性，会导致暂时(中耳积液时)或永久(听神经损害)的听力丧失。 在婴儿中，这种听力丧失会导致说话延迟。
从患有中耳炎的儿童中耳分离的菌抹主要有三种肺炎链球菌、 非典型性流感嗜血杆菌(NTHi)和粘膜炎莫拉氏菌。它们在60%到90
%的病例中存在。近期研究表明，中耳炎病例中，肺炎链球菌和非典 型性流感嗜血杆菌均占约30 % ，粘膜炎莫拉氏菌约占15 % ( Mruphy, TF (1996) Microbiol. Rev. 60:267)。从中耳中也可分离到其它细菌(B型 流感嗜血杆菌、酿脓链球菌等)，但频度低得多(2%或更低)。
流行病数据显示，中耳中发现的病原体引起中耳炎必需首先定居 在上呼吸道；但是，发病还必需有其它因素(Dickinson, DP etal. (1988) J. Infect Dis., 158:205, Faden, HL et al., (1991) Ann. Otorhinol. Laryngol.
100:612)。这对引起细菌经咽鼓管迁移到中耳然后开始炎症至关重要。 这些因素迄今仍不清楚。据推测，诸如病毒感染后免疫系统暂时性异 常可能引起不能控制呼吸道定居(Faden, HL et al (1994) J. Infect. Dis. 169:1312)。另一种解释是，暴露于环境因素之下使某些儿童中更为重 要的定居得以发生，而这些儿童因为中耳中持续存在病原体而对中耳 炎更为敏感(Murphy, TF (1996) Microbiol. Rev. 60:267 )。
对粘膜炎莫拉氏菌的免疫应答知之甚少。按时从0到2岁的幼儿 鼻咽分离的菌抹的分析表明，他们经常获得和清除新菌抹。这表明在 细菌定居的儿童中建立了针对该细菌的有效免疫应答(Faden, HL et al (1994) J. Infect. Dis. 169:1312)。
在大部分测试的成人中筌定到了杀菌抗体(Chapman, AJ et al. (1985) J. Infect. Dis. 151:878 )。粘膜炎莫拉氏菌不同菌林抵抗血清杀 菌活性的能力存在差异 一般，从患病个体中分离的菌抹较仅仅携带 该细菌的个体分离的菌林的抗性更强(Hoi, C et al (1993) Lancet 341:1281, Jordan, KL et al. (1990) Am. J. Med. 88 (suppl. 5A):23S)。血 清抗性因此可以被认为是细菌毒力因子。中耳炎病愈后的儿童血清中 可以见到调理活性。
除了 OMP Bl、 UspAl和UspA2 (Chen D. et al. (1999), Infect. Immuno. 67:1310)夕卜，人体中这些不同的免疫应答针对的抗原尚未鉴 定，OMP Bl是一种84 kDa的蛋白，其表达受铁调控，可以被肺炎患 者血清识别(Sethi, S, et al. (1995) Infect Immuno. 63:1516 )。
粘膜炎莫拉氏菌表面存在的一些其它膜蛋白已经使用生化方法鉴 定，或者揭示了他们在诱导保护性免疫中的潜在意义(综述见Murphy, TF (1996) Microbiol. Rev. 60:267)。在小鼠肺炎模型中，针对其中的一 些成员(UspA, c叩B)的抗体的存在有利于迅速清除肺炎感染。另一 种多肽(OMP CD)在粘膜炎莫拉氏菌菌林中高度保守，与铜绿假单 胞菌的孔蛋白具有同源性，而后者已被证实对动物模型中的该细菌有 效。
在过去几十年中，粘膜炎莫拉氏菌的发病率有了很大的提高。这 已被归咎为多重抗生素抗性菌抹的出现和具有较弱的免疫系统的人群 体的增加。分离到对某些或所有标准抗生素具有抗性的菌抹已不再鲜 见。这种现象就使我们产生了针对这种微生物的新型抗微生物试剂、
疫苗、药物篩选方法和诊断试验的永不满足的需求。

发明内容
本发明涉及BASBlll特别是BASBlll多肽和BASBlll多核苷
酸、重组物质以及它们的制备方法。在另一个方面，本发明涉及使用 这种多肽和多核苷酸的方法，包括微生物疾病的预防与治疗及其他。 在一个进一步的方面，本发明涉及检测与微生物感染有关的疾病及与 这样的感染有关的症状的诊断试验，例如检测BASBlll多核苷酸或 多肽的表达或活性的试验。
通过阅读下面的描述和本公开的其他部分，本领域的技术人员将 很容易理解在本发明公开的精神和范围之内的各种改变和修饰。


图1显示了通过SDS-PAGE分离的纯化重组DASBlll的蛋白印 迹。其中A是考马斯染色，B是抗His免疫试剂染色。 图2显示了用兔抗血清检测DASB111的蛋白印迹。 图3显示了在莫拉氏菌细胞裂解物中存在抗DASB111的蛋白印
具体实施例方式
如下文的详细介绍，本发明涉及BASBlll多肽和多核苷酸。具 体地说，本发明涉及粘膜炎莫拉氏菌的BASBlll的多肽和多核苷酸。 本发明尤其涉及具有分别列于SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2的核 苷酸和氨基酸序列的BASBlll。应当理解，在后面的序列表中列举为 "DNA"的序列代表本发明的一个实施方案的举例，因为普通的技术 人员知道，这样的序列通常被用作多核苷酸，包括多核糖核苷酸。 多肽
在本发明的一个方面，提供了在这里被称为"BASBlll"和 "BASBlll多肽"的粘膜炎莫拉氏菌的多肽，及其在生物学、诊断、
预防、临床或治疗上有用的变体，以及含有它们的组合物。
本发明进一步提供 (a)含有这样一种氨基酸序列的分离多肽，该氨基酸序列与SEQ ID
NO: 2的氨基酸序列至少有85%的同一性，更优选至少90%的同 一性， 更优选至少95%的同一性，最优选至少97-99%的同一性或完全相同；
(b) 由含有如下一种多核苷酸序列的分离多核苷酸编码的多肽，该 多核苷酸序列分别与SEQ ID NO: 1的整个长度具有至少85%的同一 性，更优选至少90%的同一性，更优选至少95%的同一性，更优选至 少97-99%的同 一性或完全相同；或者
(c) 由含有如下一种多核苷酸序列的分离多核苷酸编码的多肽，该 多核苷酸序列编码这样一种多肽，这种多肽与SEQ ID NO: 2的氨基 酸序列至少有85%的同一性，更优选至少90%的同一性，更优选至少 95%的同一性，最优选至少97-99%的同一性或完全相同；
SEQ ID NO: 2中提供的BASB111多肽是来自粘膜炎莫拉氏菌菌 抹MC2931 (ATCC 43617)的BASB111多肽。
本发明还提供BASB111多肽的一种免疫原性片段，即BASB111 多肽的一个连续的部分，它与含有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的多 肽具有相同或基本上相同的免疫原性活性。也就是说，该片段(必要 时可与一种载体偶联)能够产生能识别BASB111多肽的免疫应答。 这种免疫原性片段可包括诸如缺少N-末端前导序列和/或跨膜区域和/ 或C-末端锚定区域的BASB111多肽。在一个优选的方面，根据本发 明的BASB111的免疫原性片段包含基本上一种多肽的所有胞外结构 域，其中该多肽与SEQ ID NO: 2在SEQ ID NO: 2的整个长度上至 少有85%的同一性，更优选至少90%的同一性，更优选至少95%的同 一性，最优选至少97-99%的同一性。
片段是这样一种多肽，它具有与本发明的任何多肽的任何氨基酸 序列的一部分而不是全部完全相同的氨基酸序列。就BASB111多肽 而言，片段可以是"独立存在，，，或处于一个较大的多肽中，在一个 单独的较大多肽中组成一个部分或区域，优选是一种单个的连续区 域。
优选的片段包括，诸如具有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的一个 部分的截短的多肽或其变体，例如包括氨基末端和或羧基末端氨基酸 序列的连续残基系列。用或在一种宿主细胞中制备的本发明的多肽的 降解形式也是优选的。更优选的是具有结构或功能特征的片段，例如 含有ot螺旋和a螺旋形成区域、(3折叠和P折叠形成区域、转角和转角形
成区域、线团和线团形成区域、亲水区域、疏水区域、OC两亲性区域、 P两亲性区域、柔性区域、表面形成区域、底物结合区域和高抗原性 区域的片段。
更优选的片段包括含有如下氨基酸序列的分离多肽，该氨基酸序
列具有SEQIDNO: 2的氨基酸序列的至少15、 20、 30、 40、 50或100 个连续氨基酸；或含有如下氨基酸序列的分离多肽，该氨基酸序列具 有从SEQIDNO: 2的氨基酸序列截短或缺失的至少15、 20、 30、 40、 50或100个连续氨基酸。
本发明的多肽片段可用于通过肽合成制备相应的全长多肽；因 此，这些片段可用作制备本发明的全长多肽的中间体。
特别优选的是变体，其中以任何组合方式取代、缺失或添加了几 个、5-10、 1-5、 1-3、 l-2或l个氨基酸。
本发明的多肽或免疫原性片段可以是"成熟"蛋白形式，或者可 以是一种较大蛋白如前体或融合蛋白的一部分。通常优选包含含有分 泌或前导序列、前序列、能协助纯化的序列如多组氨酸残基，或能在 重组制备过程中起稳定作用的额外序列。而且，还考虑加入外源性多 肽或脂类尾巴或多核苷酸序列以增加最终分子的免疫原性能力。
在一个方面，本发明涉及遗传工程制备的可溶性融合蛋白，这种 融合蛋白含有本发明的一种多肽或其片段以及各亚类免疫球蛋白 (IgG、 IgM、 IgA、 IgE)的重链或轻链的恒定区的各种部分。优选的 是，免疫球蛋白是人IgG特别是IgGl的恒定区部分，而融合发生在 铰链区。在一个特別的实施方案中，Fc部分可简单地通过引入一个切 割序列而去除，这种切割序列可用血凝因子Xa切割。
而且，本发明涉及通过遗传工程制备这些融合蛋白的方法，以及 涉及它们在药物婦选、诊断和治疗中的应用。本发明的一个进一步的 方面还涉及编码这种融合蛋白的多核苷酸。融合蛋白技术的例子可在 国际专利申请Nos. W094/29458和W094/22914中发现。
蛋白质可通过化学方法接合，或以重组融合蛋白的形式表达，这 种融合蛋白形式能比非融合蛋白在一种表达系统以较高水平制备。融 合配体可帮助提供T辅助表位(免疫性融合配体)，优选的是能被人 识别的T辅助表位；或者能帮助蛋白比原来的重组蛋白以较高产量进 行表达的T辅助表位(表达增强子)。融合配体优选既是一种免疫性 融合配体，又是表达增强子配体。
融合配体包括来自流感嗜血杆菌的蛋白D和来自流感病毒的非结
构蛋白NS1 (血凝素)。另一种融合配体是被称为LytA的蛋白。优选 使用该分子的C末端部分。LytA来自肺炎链球菌，它合成一种N-乙 酰-L-丙氨酸酰胺酶…LytA酰胺酶(由lytA基因编码(《基因》43( 1986) 265-272页})，后者是一种自溶素，它特异性地降解肽聚糖骨架中的 某些键。LytA蛋白的C末端区域负责与胆碱或某些胆碱类似物如DEAE 的亲和性。这种特性已被用于发展能用于融合蛋白表达的大肠杆菌C-LytA表达质粒。在其氨基端含有C-LytA片段的杂合蛋白的纯化已经 有介绍{《生物技术》10巻(1992) 795-"8页}。可以使用LytA分子 中在C末端发现的重复部分，从残基178开始，例如残基188-305。
本发明还包括前面提到的多肽的变体，即通过保守性氨基酸取代 与参照物不同的多肽，其中一种残基被另 一种具有相似特征的残基取 代。典型的这种取代在如下氨基酸之间Ala、 Val、 Leu和lie; Ser 和Thr;酸性残基Asp和Glu; Asn和Gin;石威性残基Lys和Arg;或 芳族残基Phe和Tyr。
本发明的多肽可以任何合适的方式进行制备。这种多肽包括分离 的天然产生的多肽、重组制备的多肽、合成制备的多肽、或用这些方 法的组合制备的多肽。制备这种多肽的方法在本领域是熟知的。
本发明的多肽更优选来自粘膜炎莫拉氏菌，但它也优选可获自相 同分类学属的其他生物体。本发明的多肽还可获自诸如相同分类学科
或目的生物体。 多核苷酸
本发明的一个目的是提供编码BASB111多肽的多核苷酸，特别 是编码这里被称为BASB111的多肽的多核苷酸。
在本发明的特别优选的实施方案中，多核苷酸包含一个编码 BASB111多肽的区域，该区域包含一个列于SEQ ID NO: l的序列， 它包括一个全长的基因或其变体。
SEQ ID NO: 1中提供的BASB111多核苷酸是来自粘膜炎莫拉氏 菌菌才朱MC2931 (ATCC43617)的BASB111多核苷酸。
本发明的一个进一步的方面提供了编码和/或表达BASB111多肽 和多核苷酸特别是粘膜炎莫拉氏菌的BASB111多肽和多核苷酸的分
离核酸分子，包括诸如未加工的RNAs、核酶RNAs、 mRNAs、 cDNAs、 基因组DNAs、 B-和Z-DNAs。本发明的进一步的实施方案包括在生 物性、诊断性、预防性、临床或治疗性有用的多核苷酸和多肽以及含 有它们的组合物。
本发明的另一个方面涉及至少包括一个全长基因的分离多核苷 酸，该基因编码一种具有SEQ ID NO: 2的推定氨基酸序列的 BASBlll，以及与其密切相关的多核苷酸及其变体。
在本发明的另 一个特別优选的实施方案中，提供了 一种来自粘膜 炎莫拉氏菌的BASBlll多肽，它包括或由SEQIDNO: 2的氨基酸序
列或其变体组成。
使用这里提供的信息，例如SEQ ID NO: 1列出的多核苷酸序列， 本发明的编码BASBlll多肽的多核苷酸可使用标准的克隆和筛选方 法获得，例如使用那些用于从细菌中克隆和测序染色体DNA片段的 方法以粘膜炎莫拉氏菌作为起始物质，接着获得一个全长克隆。例如， 为获得本发明的一种多核苷酸序列，例如SEQ ID NO: l中给出的多 核苷酸序列，通常使用 一种来自部分序列的放射性标记的寡核苷酸， 优选17-mer或更长，对大肠杆菌或其他合适宿主中的粘膜炎莫拉氏菌 的染色体DNA克隆文库进行筛选。携带与探针相同DNA的克隆接着 用严紧杂交条件进行区分。通过用根据原来的多肽或多核苷酸序列设 计的测序引物对这样用杂交方法鉴定的单个克隆进行测序，就有可能 在两个方向延伸多核苷酸序列，从而确定全长的基因序列。这种测序 常规使用诸如由质粒克隆制备的变性的双链DNA来进行。合适的技 术见aniatis, T., Fritsch, E.F.和Sambrook等《分子克隆实验室指南， 第二版》Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York ( 1989 )。(具体见杂交筛选1.90和变性双链DNA模板测序 13.70)。也可应用直接的基因组DNA测序来获得全长的基因序列。为 说明本发明，SEQ ID NO: 1列出的每个多核苷酸都从来自粘膜炎莫 拉氏菌的DNA文库中发现。
而且，SEQ ID NO: 1中列出的每个DNA序列都含有一个编码如 下蛋白的开放阅读框，该蛋白含有SEQ ID NO: 2中列出的氨基酸残 基数目，其推导的分子量可使用本领域技术人员熟知的氨基酸残基的 分子量数值进行计算。
SEQ ID NO: 1的多核苷酸位于SEQ ID NO: 1的起始密码子的核 苷酸1和从核苷酸829开始的终止密码子之间，编码SEQ ID NO: 2
的多肽。
在一个进一步的方面，本发明提供一种分离的多核苷酸，该核苷 酸包括或由以下组成
(a) —种多核苷酸序列，它与SEQ ID NO: 1分别在SEQ ID NO: 1 的整个长度上至少有85%的同一性，更优选至少90%的同一性，更优 选至少95%的同一性，最优选至少97-99%的同一性或完全相同；或
(b) —种编码一种多肽的多核苷酸序列，该多肽与SEQIDNO: 2的 氨基酸序列分别在SEQ ID NO: 2的整个长度上具有至少85%的同一 性，更优选至少90%的同一性，更优选至少95%的同一性，更优选至 少97-99%的同一性或100%完全相同。
编码本发明的 一 种多肽的多核苷酸，包括来自除粘膜炎莫拉氏菌 以外的种类的同源物或同源进化物，可通过一种包括以下步骤的方法 来获得在严紧杂交条件下(例如使用45-65°C的温度范围，SDS的 浓度为0.1-1%)用一种标记的或可检测的探针对合适的文库进行筛 选，其中探针包含或由SEQ ID NO: 1的序列或其一个片段组成，并 分离含有所说多核苷酸序列的全长基因和/或基因组克隆。
本发明提供一种在其整个长度上与SEQIDNO: 1的编码序列(开 放阅读框)相同的多核苷酸序列。本发明还提供单独的成熟多肽或其 片段的编码序列以及与另 一个编码序列在一个阅读框内的成熟多肽或 其片段的编码序列，另 一个编码序列的例子为编码一种前导或分泌序 列、前-、原-或前原-蛋白的序列。本发明的多核苷酸也可含有至 少一种非编码序列，包括但不限于，诸如至少一种非编码的5'和3'序
列，例如转录但不翻译的序列、终止信号(例如rho-依赖和非rho-依 赖的终止信号)、核糖体结合位点、Kozak序列、稳定mRNA的序列、 内含子和聚腺苷酸化信号。多核苷酸序列也可包含编码额外氨基酸的 额外编码序列。例如，可以编码一种能促进融合多肽纯化的标记序列。 在本发明的某些实施方案中，标记序列是一种6组氨酸肽，由pQE载 体提供(Qiagen， Inc.),见Gentz等《美国科学院院刊》86: 821-824， (1989 )中的介绍；或是一种HA肽尾巴(Wilson等，《细胞》37: 767 (1984 );两种标记序列都可用于纯化与它们融合的多肽。本发明的
多核苷酸还包括但不限于，包含一种结构基因和其天然相连的控制基 因表达的序列。
编码SEQ ID NO: 2的BASBlll多肽的核苷酸序列可以与SEQ ID NO: 1的核苷酸1至828所含的多肽编码序列相同。另外，它可以是 这样一种序列，即由于遗传密码丰余(简并性)也编码SEQ ID NO: 2的多肽。
用于此处，"编码一种多肽的多核苦酸" 一词涉及包括一种编码本 发明的多肽的序列的多核苷酸，本发明的多肽具体说是一种细菌多 肽，更具体说是粘膜炎莫拉氏菌BASBlll多肽，它具有SEQIDNO: 2所列的氨基酸序列。该词还涉及这样一种多核苷酸，它包括编码该 肽的一个单一的连续区域或非连续区域(例如被整合的噬菌体、整合 的插入序列、整合的载体序列、整合的转座子序列或因RNA编辑或 基因组DNA重排所打断的多核苷酸)以及另外的区域，这种另外的 区域也可含有编码和/或非编码序列。
本发明进一步涉及这里介绍的多核苷酸的变体，这种变体能编码 具有SEQ ID NO: 2的推定氨基酸序列的多肽的变体。本发明的多核 苷酸的片段可用于诸如合成本发明的全长多核苷酸。
更加特别优选的实施方案是编码BASBlll变体的多核苷酸，该 变体具有在SEQ ID NO: 2中几个、少数、5至10、 1至5、 1至3、 2、 1或没有氨基酸被以任何组合方式取代、修饰、缺失和/或添加的 BASBlll多肽的氨基酸序列。在它们中尤其优选的是并不改变 BASBlll多肽的特性和活性的沉默取代、添加和缺失。
本发明的更优选的实施方案是与编码具有SEQ ID NO: 2列出的 氨基酸序列的BASBlll多肽的多核苷酸在其整个长度上至少有85% 相同的多核苷酸；以及与这种多核苷酸互补的多核苷酸。就此而言， 特别优选的是在整个长度上至少有90%的同一性的多核苷酸，而在这 些特别优选多核苷酸中，至少有95%的同一性的多核苷酸更为优选， 而且在这些至少有95%的同一性的多核苷酸中，至少有97%相同的多 核苷酸更优选，同样在它们中，至少有98%和至少有99%相同的多核 苷酸尤其更加优选，其中至少有99%相同的多核苷酸更优选。
优选的实施方案是编码基本上保留了 SEQ ID NO: 1的DNA编 码的成熟多肽的相同生物功能或活性的多肽的多核苷酸。根据本发明的特定优选实施方案，本发明提供能与BASB111多 核苷酸序列例如SEQ ID NO: 1的多核苷酸序列杂交，尤其是在严紧 条件下杂交的多核苷酸。
本发明进一步涉及能与这里提供的多核苷酸序列杂交的多核苷酸 序列。就此而言，本发明特别涉及能在严紧条件下与这里介绍的多核 香酸杂交的多核苷酸。用于此处，"严紧条件，，和"严紧杂交条件" 的意思是杂交只发生在序列之间至少有95%优选至少有97%相同时。 严紧杂交条件的一个具体例子是在42。C在一种溶液中温育过夜，该 溶液包括50%曱酰胺、5x SSC ( 150 mM NaCl、 15 mM 4宁檬酸钠)、 50 mM磷酸钠(pH7.6)、 5x Denhardt，s溶液、10%葡聚糖石克酸酯和20 微克/ml的变性剪切鲑精DNA，接着在O.lx SSC中在约65°C时洗涤 杂交支持物。杂交和洗涤条件是众所周知的，并在Sambrook等《分 子克隆实验室指南，第二版》Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor, New York ( 1989 )中特别是ll章中举例。溶液杂交也 可用本发明提供的多核苷酸序列进行。
本发明还提供含有或由这样一种多核苷酸序列组成的多核苷酸， 该多核苷酸序列通过用一种探针在严紧杂交条件下筛选一种合适的文 库并分离所述多核苷酸序列来获得，其中文库含有SEQ ID NO: l列 出的多核苷酸序列的完整基因，而探针具有SEQ ID NO: l列出的所 说多核苷酸序列的序列。可用于获得这样 一 种多核苷酸的片段包括诸 如本文的其他部分详细介绍的探针和引物。
如本发明在这里的其他部分对多核苷酸试验的讨论，例如，本发 明的多核苷酸可用作RNA、 cDNA和基因组DNA的杂交探针来分离 编码BASB111的全长cDNAs和基因组克隆，并分离与BASB111基 因具有高同一性特别是高序列同一性的其他基因的cDNA和基因组克 隆。这种探针一般具有至少15个核苷酸残基或碱基对，这种探针优 选具有至少30个核苷酸残基或碱基对，也可具有至少50个核苷酸残 基或碱基对。特别优选的探针具有至少20个核苷酸残基或碱基对， 并少于至少30个核苦酸残基或碱基对。
BASB111基因的编码区可通过使用SEQ ID NO: 1提供的DNA 序列合成一种寡核苷酸探针进行篩选来分离。然后使用与本发明的基 因序列互补的标记寡核苷酸筛选一种cDNA、基因组DNA或mRNA
文库，来确定该探针杂交的文库成员。
对本领域的技术人员来说，有几种方法是可以使用和熟知的，可
以用来获得全长DNAs或延伸短的DNAs,例如以cDNA末端快速扩 增(RACE)方法为基础的方法(见诸如Frohman等，《美国科学院院 刊》85: 8998-9002, 1988 )。这种技术的最近修改，例如Marathon 技术(Clontech Laboratories Inc.)，明显简化了对较长cDNAs的寻找。 在Marathon 技术中，cDNAs用从一种选择的组织中抽提的mRNA 制备，并在每个末端连上一种"接头"。然后使用基因特异的和接头 特异的寡核苷酸组合进行核酸扩增(PCR)来扩增"丢失"的DNA 的5'末端。然后使用"巢式"引物重复PCR反应，巢式引物即设计 来与扩增产物的内部退火的引物(通常为与接头序列的3'退火的一种 接头特异性引物和与所选择的基因序列的5'退火的一种基因特异性引 物)。然后用DNA测序对该反应的产物进行分析，通过将产物直接与 已有的DNA连接产生一个完整的序列，或者使用设计5'引物的新序 列信息进行一个单独的全长PCR，来构建一个全长的DNA。
本发明的多核苷酸和多肽可用作诸如发现疾病特别是人疾病的治 疗和诊断的研究试剂和物质，如同这里与多核苷酸试验有关的讨论。
本发明的多核苷酸是衍生自SEQ ID NO: 1序列的寡核苷酸，它 们可用于这里介绍的方法，但更优选用于PCR，用来确定这里鉴定的 多核苷酸是否全部或部分能在细菌或感染组织中转录。应当理解，这 种序列也可用于诊断感染的阶段和所获得病原体的感染类型。
本发明也提供编码这样一种多肽的多核苷酸，这种多肽是一种成 熟蛋白加上另外的氨基或羧基末端氨基酸、或成熟多肽内部的氨基酸 (例如，当成熟形式含有一个以上的多肽链时)。这种序列可在将一 种蛋白从前体加工成成熟形式时起作用，可允许蛋白运输，可延长或 缩短蛋白的半寿期，或可便于蛋白用于试验或制备时的操作。通常在 体内时，另外的氨基酸可通过细胞酶从成熟蛋白上加工除去。
对于本发明的每一种和所有的多核苷酸，都提供一种与之互补的 多核苷酸。这些互补多核苷酸优选与它们互补的每一种多核苷酸完全 互补。
一种含有多肽的成熟形式与 一种或多种原序列融合的前体蛋白可 能是该多肽的无活性形式。当除去原序列时，这种无活性的前体一般
被激活。在活化前， 一些或所有的原序列可被除去。这种前体一般被 称为蛋白原。
核苷酸除了用标准的A、 G、 C、 T/U表示外，"N"也可用来描述 本发明的特定多核苷酸。"N"指4种DNA或RNA核苷酸的任何一个 都可出现在DNA或RNA序列的该指定位点，但优选N不是一种核 酸，当它与相邻的核苦酸位置组合在一起，当按正确的阅读框阅读时， 在该阅读框中产生一种成熟前的终止密码子。
总而言之，本发明的多核苷酸可编码一种成熟蛋白、 一种成熟蛋 白加一种前导序列(它可被称为一种前蛋白)、含有一种或多种非前 蛋白的前导序列的原序列的成熟蛋白的前体、或原蛋白的前体前原蛋 白，其具有一种前导序列和一种或多种原序列，它们通常在产生多肽 的活性和成熟形式的加工过程中被除去。
根据本发明的 一个方面，提供本发明的多核苷酸在治疗性或预防 性目的特别是遗传免疫方面的应用。
本发明的多核苷酸在遗传免疫方面的应用优选使用一种合适的传
递方法，例如直接将质粒DNA注射进肌肉(Wolff等《人类分子遗传
学》(1992 ) 1: 363， Manthorpe等，《人类基因治疗》(1983 ) 4: 419);
将DNA与特异性蛋白载体复合后进行传递(Wu等，《生物化学杂志》 (1989 ) 264: 16985 )，将DNA与磷酸钓共沉淀(Benvenisty&Reshef, 《美国科学院院刊》(1986 ) 83: 9551 );将DNA用各种形式的脂质
体包裹(Kaneda等，《科学》(1989 ) 243: 375 );粒子轰击(Tang等， 《自然》(1992 )356: 152， Eisenbraun等《DNA与细胞生物学》(1993 )
12: 791)以及使用克隆的逆转录载体进行体内感染(Seeger等，《美
国科学院院刊》81: 5949 )。
载体、宿主细胞、表达系统
本发明还涉及含有本发明的多核苷酸的载体、用本发明的载体进
行了遗传工程改造的宿主细胞以及通过重组技术制备本发明的多肽。
无细胞翻译系统也可用于使用来自本发明的DNA结构物的RNAs制
备这样的蛋白。
本发明的重组多肽可使用本领域技术人员熟知的方法由含有表达 系统的遗传工程宿主细胞进行制备。因此，在一个进一步的方面，本 发明涉及含有本发明的多核苷酸的表达系统、用这种表达系统遗传工
程改造的宿主细胞以及用重组技术制备本发明的多肽。
为进行本发明的多肽的重组制备，宿主细胞可通过遗传工程改造 来整合表达系统或其部分或本发明的多核苷酸。将多核香酸导入宿主
细胞可通过多种标准实验室手册介绍的方法来完成，例如Davis等《分 子生物学基本方法》(1986 )和Sambrook等《分子克隆实验室指南， 第二版》Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York ( 1989 )，例如磷酸钩转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、载体转 染(transvection)、显微注射、阳离子脂介导的转染、电穿孔、转导、 划痕接种、轰击导入和感染。
合适宿主的代表性例子包括细菌细胞如链球菌、葡萄球菌、肠球 菌、大肠杆菌、链霉菌、蓝细菌、枯草芽孢杆菌、粘膜炎莫拉氏菌、 流感嗜血杆菌和粘膜炎莫拉氏菌的细胞；真菌细胞如克鲁维氏酵母、 糖酵母等酵母、白色假丝酵母和曲霉等担子菌的细胞；昆虫细胞如果 蝇S2和草地夜蛾Sf9的细胞；动物细胞如CHO、 COS、 HeLa、 C127、 3T3、 BHK、 293、 CV-1和Bowes黑素瘤细胞；以及才直物细胞如4果子 植物或被子植物的细胞。
多种表达系统可用于制备本发明的多肽。这种载体包括染色体型、 游离型、病毒型衍生载体，例如由细菌质粒、细菌噬菌体、转座子、 酵母游离体、插入元件、酵母染色体元件、病毒如杆状病毒、乳多空 病毒如SV40、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、伪狂犬病毒、微小RNA 病毒、逆转录病毒和甲型病毒衍生的载体或由它们的组合物衍生的载 体，例如由质粒和噬菌体遗传元件书f生的载体，如粘粒和噬菌粒。表 达系统结构物可含有调节以及引起表达的控制区域。就这个方面一般 来说，任何适合于维持、增殖或表达多核苷酸和/或在一种宿主中表达 一种多肽的系统或载体都可用于表达。合适的DNA序列可通过任何 熟知的和常规的技术插入到表达系统中，例如Sambrook等《分子克 隆实验室指南》(上文)中列出的技术。
在真核细胞重组表达系统中，为使翻译蛋白分泌到内质网层中、 周质间或胞外环境中，可将合适的分泌信号整合到表达的多肽中。这 些信号对多肽来说可以是内源性的，或者也可以是异源性的。
本发明的多肽可通过熟知的技术从重组细胞培养物中回收和纯 化，这些技术包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸抽提、阴离子或阳离子交换
层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟基磷灰石
层析和凝集素层析。更优选将金属离子亲和层析(IMAC)用于纯化。 熟知的用于蛋白重新折叠的技术可用于当多肽在胞内合成、分离和/或 纯化过程中变性时活性构象的再生。
表达系统也可是一种重组的活孩i生物，例如一种病毒或细菌。目 标基因可插入到活的重组病毒或细菌的基因组中。接种和体内感染这 种活的载体将导致抗原的体内表达和免疫应答诱导。用于此目的的病 毒和细菌是诸如痘病毒(例如痘苗病毒、禽痘病毒、金丝雀禽痘病毒)、 甲病毒(辛德毕斯病毒、塞姆利基森林病毒、委内瑞拉马脑脊髓炎病 毒)、腺病毒、腺伴随病毒、微小RNA病毒(脊髓灰质炎病毒、鼻病 毒)、疱渗病毒(水痘带状疱渗病毒等)、李斯特氏菌、沙门氏菌、志 贺氏菌、奈瑟氏菌、BCG。这些病毒和细菌可以是毒性的、或用各种 方法减毒来荻得一种活疫苗。这种活疫苗也是本发明的一个部分。
诊断、预测、血清分型和突变试验
本发明还涉及将本发明的BASB111多核苷酸和多肽用作诊断试 剂。在真核细胞特别是哺乳动物细胞尤其是人细胞中检测BASB111 多核苦酸和/或多肽可为诊断疾病、疾病阶段或感染生物体对药物的应 答提供一种诊断方法。真核细胞，特别是哺乳动物细胞，尤其是人细 胞，特别是那些感染或怀疑感染了含有BASB111基因或蛋白的生物 体的细胞，可在核酸或氨基酸水平通过多种熟知的技术以及这里提供 的方法进4于4全测。
用于预测、诊断或其他分析的多肽和多核苷酸可获自假定感染和/ 或感染个体的机体物质。来自任何这些来源的多核苷酸尤其是DNA 或RNA可直接用于检测，或者可在分析前使用PCR或其他任何扩增 技术进行酶促扩增。RNA特别是mRNA、 cDNA和基因组DNA也可 以相同方式使用。使用扩增方法，通过对生物体的所选多核苷酸的基 因型进行分析，可对感染性或个体中存在的定居生物体的种类和菌株 进行鉴定。缺失和插入可通过扩增产物与一种选自相关生物体的参考 序列的基因型相比的大小变化进行检测，优选与相同属的不同种或相 同种的不同抹进行比较。点突变可通过将扩增DNA与标记的BASB111 多核苷酸序列进行杂交来鉴定。对于DNA或RNA来说，通过DNase 或RNase消化分别可将非常或明显匹配的序列与匹配不佳或明显^"配
的双体区分开来，或者通过检测融解温度或复性动力学的差异进行区 分。多核苷酸序列差异也可通过多核苷酸片段在凝胶中与一种参考序 列相比的电泳迁移的改变来检测。这可使用或不使用变性试剂。多核
苷酸差异也可通过直接的DNA或RNA测序来检测。见诸如Myers等， 《科学》230: 1242 ( 1985 )。特殊位置的序列改变也可通过核酸酶保 护试验如RNase、 VI和Sl保护试验或化学裂解方法来显示。见诸如 Cotton等《美国科学院院刊》85: 4397-4401 ( 1985 )。
在另一个实施方案中，可以构建一系列含有BASB111核苷酸序 列或其片段的寡核苷酸探针，来对诸如遗传突变、血清型、分类或鉴 定进行有效的筛选。平行技术方法是众所周知的，具有通用性，可用 来解决分子遗传学中的多种问题，包括基因表达、遗传连锁和遗传变 异(见诸如Chee等《科学》274: 610 ( 1996)。
因此，在另一个方面，本发明涉及一种诊断试剂盒，它包括
(a) 本发明的一种多核苷酸，优选SEQIDNO: 1的核苷酸序列 或其片段；
(b) 与(a)的核苷酸序列互补的核苷酸序列；
(c) 本发明的一种多肽，优选SEQIDNO: 2的多肽或其片段；
或
(d) 针对本发明的多肽的抗体，优选针对SEQIDNO: 2的多肽 的抗体。
在任何这样一种试剂盒中，(a)、 (b)、 (c)或(d)可优选含有一 种基本组分。这种试剂盒可用于疾病或对疾病的易感性的诊断或其 他。
本发明还涉及将本发明的多核苷酸用作诊断试剂。对本发明的多 核普酸优选SEQ ID NO: 1的与一种疾病或致病性相关的突变形式的 检测，可提供一种诊断手段，这种诊断手段可增加或限定由于该多核 苷酸的低表达、过量表达或表达改变而引起的一种疾病的诊断、疾病 过程的预测、疾病阶段、或疾病的易感性的确定。在这样的多核苷酸
何地方介绍的技术在多核苷酸水平进行检测。
来自在本发明的多核苷酸和/或多肽中带有突变或多态性(等位突 变)的生物体的细胞也可用来使用多种技术在多核苷酸或多肽水平进 行检测，从而进行诸如血清学分型。例如，RT-PCR可用来检测RNA 中的突变。优选将RT-PCR与自动检测系统如GeneScan结合起来进 行使用。RNA、 cDNA或基因组DNA也可用于相同的目的一PCR。 例如，与编码BASB111多肽的多核苷酸互补的PCR引物可用来鉴定 和分析突变。
本发明进一步提供从5，和/或3'末端除去1、 2、 3或4个核苷酸的
引物。这些引物可与其他材料一起用于扩增从个体获得的一种样品如 机体物质中分离的BASB111 DNA和/或RNA。这些引物可用于扩增 从感染个体中分离的一种多核苷酸，这样，该多核苷酸可随后通过各 种技术来阐明多核苷酸序列。通过这种方法，可检测多核苷酸序列中 的突变，并用于诊断和/或预测感染或其阶段或过程，或进行感染因子 的血清学分型和/或分类。
本发明进一步提供诊断疾病，优选是细菌感染，更优选是由粘膜 炎莫拉氏菌引起的感染的方法，这包括在从个体获得的样品如一种机 体物质中检测具有SEQIDNO: 1序列的多核苷酸的表达水平的提高。 BASB111多核苦酸表达的增加或减少可使用本领域任何已知的用于多 核苷酸定量的方法进行检测，例如扩增、PCR、 RT-PCR、 RNase保护、 Northern印迹、分光光度和其他杂交方法。
此外，根据本发明的用于检测BASB111多肽与正常对照组织样 品相比过量表达的诊断试验可用来检测例如一种感染的存在。可用来 测定BASB111多肽在来自一种宿主如一种机体物质中的水平的试验 技术对本领域的技术人员来说是熟知的。这种试验方法包括放射免疫 试验、竟争结合试验、Western印迹、抗体夹心试验、抗体检测和ELISA 试验。
本发明的多核苷酸可用作多核苷酸列阵优选是高密度列阵或载网 的组分。这些高密度列阵对于诊断和预测目的特别有用。例如，各含 一种不同基因并进一步含有本发明的多核苷酸的一套点可用于探针检 测，例如使用杂交或核酸扩增，使用来自或衍生自一种机体样品的探 针，来检测 一种特别的寡核苷酸序列或相关序列在一个个体中的存 在。这种存在可说明一种病原体尤其是粘膜炎莫拉氏菌的存在，并可 用来诊断和/或预测疾病或疾病过程。优选的是一种含有多种SEQ ID NO: 1的核苷酸序列的变体的载网。含有编码SEQIDNO: 2的多肽
序列的多核苷酸序列的多种变体的载网也是优选的。 抗体
本发明的多肽和多核苷酸或其变体或者表达它们的细胞可用作免 疫原来制备分别针对这种多肽或多核苦酸的抗体。
在本发明的特定优选实施方案中，提供针对BASB111多肽或多 核苷酸的抗体。
针对本发明的多肽或多核苷酸制备的抗体可通过使用传统的方法 获得，即将本发明的多肽和/或多核苷酸、或它们之一或两者的携带表 位的片段、它们之一或两者的类似物、或表达它们之一或两者的细胞 给药于一种动物，优选是一种非人类的动物。本领域任何能提供用连 续细胞系培养制备的抗体的技术都可以使用。例子包括各种技术，例 如Kohler,G.和Milstein, C.《自然》256: 495-497 ( 1975 ); Kozbor等 《今日免疫学》4: 72 ( 1983 ); Cole等《单克隆抗体和癌症治疗》，Alan R. Liss, Inc. (1985)的77-96页。
制备单链抗体的技术(美国专利No. 4,946,778)可修改来制备针 对本发明的多肽或多核苷酸的单链抗体。转基因鼠或其他生物体或动 物如其他哺乳动物也可用来表达对本发明的多肽或多核苷酸免疫特异 的人源化抗体。
另外，噬菌体显示技术可用来从含有抗BASB111的人淋巴细胞 的PCR扩增的V-基因文库或天然文库中选择对本发明的多肽具有结 合活性的抗体基因(McCafferty等(1990)《自然》348: 552-554; Marks 等(1992 )《生物技术》10: 779-783 )。这些抗体的亲和性也可通过诸 如链置换技术进行提高(Clackson等，(1991)《自然》352: 628 )。
上面介绍的抗体可用来分离或鉴定能够表达本发明的多肽或多核 苷酸的克隆，来通过诸如亲和层析纯化这些多肽或多核苷酸。
这些抗体以及其他针对BASB111多肽或BASB111多核苷酸的抗 体可用来治疗感染，特別是细菌感染。
多肽变体包括抗原性、表位性或免疫性等价的变体，它们组成了 本发明的一个特别的方面。
抗体或其片段优选通过修饰，使之在个体中具有较小的免疫原性。 例如，如果个体是人，抗体可更优选是一种"人源化"的抗体，其中 杂交瘤来源抗体的互补决定区被移植到人单克隆抗体中，例如Jones
等(1986 )《自然》321, 522-525或Tempest等(1991)《生物技术》 9， 266-273中的介绍。
拮抗剂和激动剂…试验和分子
本发明的多肽和多核苷酸还可用来评价小分子底物与配体在诸如 细胞、无细胞抽提物、化学文库和天然产物混合物中的结合。这些底 物和配体可以是天然底物和配体，或者可以是结构或功能模拟物，见 诸如Coligan等《当代免疫学方法》1 (2): 5章(1991)。
筛选方法可通过一种直接或间接与候选化合物连接的标记简单地 测量候选化合物与多肽或多核苷酸、或者携带多肽或多核普酸的细胞 或膜、或者多肽的融合蛋白的结合。此外，篩选方法可包括与一种标 记的竟争物进行竟争。而且，这些筛选方法可检测候选化合物是否导 致一种由多肽或多核苷酸的活化产生的信号，这可使用与含有多肽或 多核苦酸的细胞适宜的检测系统来进行。活化的抑制剂 一般在存在一 种已知激动剂的情况下进行试验，并观察候选化合物对激动剂活化作 用的影响。组成型活性多肽和/或组成型表达的多肽和多核苷酸可根据 需要，在没有一种激动剂或拮抗剂的情况下，用于逆转激动剂或抑制 剂的筛选方法，这可通过检测候选化合物是否导致多肽或多核苷酸的 活化的抑制来进行。而且，筛选方法可简单地包括以下步骤，将一种 候选化合物与含有本发明的 一种多肽或多核苷酸的溶液混合，形成一 种混合物；检测混合物中BASBlll多肽和/或多核苷酸的活性；将混 合物中BASBlll多肽和/或多核苷酸的活性与一种标准进行比较。融 合蛋白如这里介绍的Fc部分与BASBlll多肽制备的融合蛋白也可用 于高通量的筛选试验，用来鉴定本发明的多肽的拮抗剂以及系统发育 和/或功能上相关的多肽(见D. Bennett等《分子识别杂志》8: 52-58
(1995 )和K. Johanson等《生物化学杂志》270 ( 16 ): 9459-9471
(簡))。
能够与本发明的一种多肽结合和/或相互作用的多核苷酸、多肽和 抗体也可用于设计检测加入的化合物对细胞中mRNA和/或多肽产生 的影响的篩选方法。例如，可以设计一种ELISA试验，使用单克隆和 多克隆抗体，按照本领域的标准方法，测量多肽的分泌或细胞结合水 平。这可用来发现能抑制或增强多肽在合适的操作细胞或组织中产生 的试剂(分别也被称为拮抗剂或激动剂)。
本发明还提供一种篩选化合物的方法，用来鉴定能够增强(激动
剂)或阻断(拮抗剂)BASBlll多肽或多核苷酸的作用的化合物，尤 其是能够抑菌和/或杀菌的化合物。这种筛选方法可使用高通量技术。 例如，为筛选激动剂或拮抗剂，将一种合成反应混合物、 一种细胞组 分如膜、细胞包膜或细胞壁、或者它们的任何制备物、包括BASBlll 多肽和一种标记底物或这种多肽的配体，在一种可能是BASBlll激 动剂或拮抗剂的候选分子存在或不存在的条件下，进行温育。候选化 合物激动或拮抗BASBlll多肽的能力反映于标记配体的结合降低或 这种底物的产物的产生减少。无效结合即不诱导BASBlll多肽的效 果的分子很可能是优秀的拮抗剂。根据情况，结合良好并增加产物由 底物产生的速率、增加信号转导或增加化学通道活性的的分子即是激 动剂。根据情况，产物由底物产生、信号传导或化学通道活性的速率 或水平的检测可通过使用一种报告系统来增强。可用于此目的报告系 统包括但不限于比色、标记底物转变成产物、 一种对BASBlll多核 苷酸或多肽的变化应答的报告基因以及本领域熟知的结合试验。
BASBlll激动剂试验的另一个例子是一种竟争试验，该试验将 BASBlll和一种可能的激动剂与BASBlll结合分子、重组BASBlll 结合分子、天然底物或配体、或底物或配体的;f莫拟物组合在一起，在 合适的条件下进行竟争抑制试验。BASBlll可进行标记，例如用放射 活性或比色化合物标记，使结合到一种结合分子上或转化成产物的 BASBlll分子的数目可以精确测定，来评价可能的拮抗剂的作用。
可能的拮抗剂包括能与本发明的多核苷酸和/或多肽结合并因而抑 制或压制其活性或表达的小有机分子、肽、多肽以及抗体及其他。可
能的拮抗剂也可以是这样的小有机分子、肽、多肽如密切相关的蛋白 或抗体，它们结合在结合分子的相同位点，例如一种结合分子，但不 诱导BASBlll诱导的活性，从而通过阻止BASBlll多肽和/或多核苷 酸结合来抑制BASBlll多肽和/或多核苷酸的活化或表达。
可能的拮抗剂包括这样的小分子，它们结合和占据多肽的结 合位点，因而阻止其与细胞结合分子结合，从而抑制正常的生物活性。 小分子的例子包括但不限于小有机分子、肽或肽样分子。其他可能的 拮抗剂包括反义分子(见Okano,《神经化学杂志》56: 560 ( 1991 ); 《寡脱氧核苷酸作为基因表达的反义抑制剂》CRC Press, Boca Raton, FL( 1988 )，对这些分子的介绍)。优选的可能的拮抗剂包括与BASB111 及其变体有关的化合物。
在一个进一步的方面，本发明涉及遗传工程的可溶性融合蛋 白，这种蛋白包括本发明的一种多肽或其片段以及各种亚类免疫球蛋 白(IgG、 IgM、 IgA、 IgE)的重链或轻链恒定区的各种部分。优选的 免疫球蛋白是人IgG特别是IgGl重链的恒定区部分，其中融合发生 于铰链区。在一个特别的实施方案中，Fc部分可通过以下方法简单地 除去引入一个切割序列，该序列可用血液凝集因子Xa。而且，本发 明涉及通过遗传工程制备这些融合蛋白的方法，并涉及将其用于药物 筛选、诊断和治疗。本发明的一个进一步的方面还涉及编码这种融合 蛋白的多核苷酸。融合蛋白技术的例子可见于国际专利申请Nos. W094/29458和W094/22914。
这里提供的每个多核苷酸序列可用于发现和开发抗菌化合 物。编码蛋白通过表达可用作篩选抗菌药物的靶。此外，编码所编码 蛋白的氨基末端区域或相应mRNA的SD或其他翻译促进区域的多核 苷酸序列可用于构建反义序列来控制目标编码序列的表达。
本发明还提供将本发明的多肽、多核苷酸、激动剂或拮抗剂 用于千扰一种病原体或多种病原体与一种对感染继发症敏感的真核生 物优选是哺乳动物宿主之间的最初生理相互作用。具体地说，本发明 的分子可用于抑制细菌具体说是革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌粘 附于真核生物优选是哺乳动物的深埋装置的细胞外基质蛋白或粘附于 伤口的细胞外基质蛋白；阻断真核生物优选是哺乳动物的细胞外基质 蛋白与细菌BASB111蛋白之间的细菌性粘附，后者介导组织损伤； 和/或阻断不管是深埋装置植入还是其他外科技术引起的感染的正常致 病过程。
根据本发明的另一个方面，提供BASB111激动剂和拮抗剂， 优选是抑菌或杀菌性激动剂和拮抗剂。
本发明的拮抗剂和激动剂可用于例如阻止、抑制和/或治疗疾病。
在一个进一步的方面，本发明涉及本发明的多肽的模拟表 位。模拟表位是一种肽序列，与天然肽足够相似(序列上或结构上)， 它能被识别天然肽的抗体识别，或在与一种合适载体偶联时能够产生
识别天然肽的抗体。
肽模拟表位可通过添加、缺失或取代所选择的氨基酸用于特 别的目的。因此，肽可被修饰以易于与一种蛋白载体连接。例如，对 于某些化学结合方法，需要含有一个末端半胱氨酸。此外，对于肽与 一种蛋白载体结合，需要包含一个远离肽结合末端的疏水末端，使肽 的未结合的游离末端保持与载体蛋白表面的相互作用。从而使肽具有 一种构象，这种构象与肽在整个天然分子结构中具有的构象非常相
似。例如，肽可被修改来具有一个N末端半胱氨酸和一个C末端疏水 的酰胺化的尾巴。另外，可以进行一种或多种氨基酸的D立体异构体 的添加或取代，来制备一种有用的衍生物，用来例如增强肽的稳定性。 此外，肽模拟表位可通过诸如噬菌体显示技术(EP 0 552 267 Bl)使用能与本发明的多肽结合的抗体来鉴定。这种技术产生大量的 模拟天然肽的结构的肽序列，这些肽序列因此能够结合抗天然肽的抗 体，但可能不足以与天然多肽具有明显的序列同源性。 疫苗
本发明的另一个方面涉及在个体特别是哺乳动物优选是人中诱导 免疫应答的方法，这种方法包括用BASBlll多核苷酸和/或多肽或其 片段或变体接种个体，它们足以产生抗体和/或T细胞免疫应答，保护 个体不被感染，特别是细菌感染，尤其是粘膜炎莫拉氏菌感染。本发 明还提供产生这种免疫应答以延緩细菌复制的方法。本发明的另 一个 方面涉及在个体中诱导免疫应答的方法，包括给予这种个体一种指导 BASBlll多核苷酸和/或多肽表达或其片段或变体表达的核酸载体、 序列或核酶，来在体内表达BASBlll多核苷酸和/或多肽表达或其片 段或变体，从而诱导一种免疫应答，例如产生抗体和/或T细胞免疫应 答，包括诸如产细胞因子T细胞或细胞毒T细胞，来保护所述个体， 优选是人免于患病，而不管这种疾病是已经在个体中存在还是不存 在。基因给药的 一个例子是将其作为颗粒或其他物质的包被物来促进 其进入所需的细胞。这种核酸载体可包括DNA、 RNA、核酶、修饰 的核酸、DNA/RNA杂合体、DNA蛋白复合物或RNA-蛋白复合物。
本发明的一个进一步的方面涉及一种免疫组合物，该组合物在导 入个体优选是人时，能够诱导一种免疫应答，即在该个体中诱导针对 BASBlll多核苷酸和/或由其编码的多肽的免疫应答。其中组合物包
含重组的BASB111多核苷酸和/或由其编码的多肽；和/或包含能够编 码和表达所述BASB111多核苷酸、由其编码的多肽或本发明的其他 多肽的抗原的DNA和/或RNA。免疫应答可用于治疗或预防目的，并 且可采用抗体免疫和/或细胞免疫的形式，例如由CTL或CD4 + T细 胞引起的细胞免疫。
因此，BASB111多肽或其片段可与辅助蛋白或化学半分子融合， 辅助蛋白或化学半分子能够或不能自身产生抗体，但能够使第一种蛋 白稳定，并产生一种融合的或修饰的蛋白，后者具有抗原性和/或免疫 原性，优选是保护性。这样的融合重组蛋白优选进一步含有一种抗原 性辅助蛋白，例如来自流感嗜血杆菌的脂蛋白D、谷胱甘肽-S-转移酶
(GST)或P-半乳糖苷酶或其他任何能够稳定蛋白并促进其制备和纯 化的大辅助蛋白。而且，辅助蛋白在对接受该蛋白的生物体的免疫系 统提供一种标准刺激时，可用作一种佐剂。辅助蛋白可连接在第一种 蛋白的氨基端或羧基端。
在本发明的疫苗组合物中，BASB111多肽和/或多核苷酸或其片 段、模拟表位(mimot叩e)、或变体可以存在于一种载体中，如上述活 细菌载体等活重组载体。
BASB111多肽的无生命载体也是合适的，例如细菌外膜嚢泡 (vesicle)或"小泡(bleb)"。 OM小泡衍生自革兰氏阴性细菌双层膜的外 膜，已在多种革兰氏阴性细菌包括C. trachomatis和C. psittad中报导
(Zhou, L等，1998, FEMS微生物通讯，163: 223 -228)。据报导产 生小泡的细菌病原体的非限制性实例也包括百日咳博德特氏菌、布 氏疏螺旋体、马尔他布鲁氏菌、羊布鲁氏菌、大肠杆菌、流感嗜血杆 菌、嗜肺军团菌、淋病奈瑟氏菌、粘膜炎莫拉氏菌、铜绿假单胞菌和 小肠结肠炎耶尔森氏菌。
小泡的优势是以天然构象提供外膜蛋白，因此在疫苗中特别有用。 小泡也可以通过工程改造细菌以改变外膜上一个或多个分子的表达而 用于疫苗。因此，例如可以引入或上调(如通过改变启动子)BASBlll 多肽等所需的免疫原性蛋白在外膜的表达。另一种方式或者进一步， 不相关(如非保护性抗原或免疫优势但可变的蛋白)或有害(如LPS 等毒性分子，或自身免疫应答的潜在诱导物)的外膜分子的包括可以 被下调。这些方式以下详述。
BASB111基因的非编码旁侧区含有基因表达中重要的调控元件。 这种调控既存在于转录水平又存在于翻译水平。这些区域(无论是基 因开放阅读框的上游还是下游)的序列可以通过DNA测序获得。这 种序列信息可以确定潜在的调控基元，如不同的启动子元件、终止子 序列、可诱导序列元件、阻遏物、负责相转变的元件，核糖体结合序 列、具有参与调控的潜在二级结构，以及其它类型的调控基元或序列。
该序列是本发明的另 一 方面。
该序列信息允许调节BASB111基因的天然表达。基因表达的上 调也可通过改变启动子、核糖体结合序列、潜在阻遏物或操纵基因元 件或任何其它有关元件。同样，表达的下调可以通过类似的调控实现。 或者，通过改变相转变序列，基因的表达可以置于相转变控制之下， 或者可以与这种调控解偶联。另一种途径是，该基因的表达可以置于 一个或多个允许调节表达的可诱导元件的控制之下。这种调节的实例 包括但不限于通过温度转变的诱导，加入选定碳水化合物或其衍生物 等诱导底物、痕量元素、维生素、辅因子、金属离子等。
上述改变可以通过几种不同方式导入。改变参与基因表达的序列 可以通过体内随机诱变然后选择所需表型来实现。另一种途径是分离 目标区域，通过随机诱变或定点置换、插入或缺失诱变改变之。改变 的区域可以通过同源重组重新导入细菌基因组，基因表达的效果可以 被评价。另一种途径是，目标区域的序列知识可以用于置换或缺失天 然调控序列的全部或部分。这种情况下，分离和改变目标调控区，以 包括来自其它基因的调控元件，来自不同基因的调控元件的组合，合 成调控区，或任何其它调控区，或缺失野生型调控序列的选定部分。 这些改变的序列可以通过同源重组被重新导入细菌基因组中。可以用 于上调基因表达的优选启动子的非限制性实例包括来自粘膜炎莫拉氏 菌或淋病奈瑟氏菌的启动子proA, proB, lbpB, tbpB, p110, 1st, hpuAB; 来自M. Catarrhalis的TbpB;来自流感嗜血杆菌的pl, p2, p4, p5, p6, lpD, tbpB, D15, Hia， Hmwl, Hmw2。
在一个实例中，基因表达可以通过将其启动子换成较强的启动子 (通过分离该基因的上游序列，体外修饰该序列，通过同源重组再导 入基因组中)加以改变。上调的表达可以在细菌以及来自该细菌的外 膜嚢泡中实现。 在一个实例中，上述途径可以用来产生疫苗应用中性能改进的重 组细菌菌抹。这些可以是减毒菌抹，选定抗原的表达增加的菌抹，干 预免疫应答的基因敲除(或表达降低)的菌抹，免疫优势蛋白的表达 改变的菌抹，外膜嚢泡的脱落改变的菌林，但不限于此。
因此，本发明也提供BASBlll基因的改变的上游区，这些改变 的区域也含有异源调控元件，其改变位于外膜蛋白的BASBlll蛋白 的表达水平。本发明这方面的上游区包括BASBlll基因的上游序列。 上游区始于BASBlll基因的上游，通常延伸至ATG起始密码子上游 不到约lOOObp处。在基因位于多顺反子序列(操纵子)中时，上游 区可以刚好始于目的基因之前，或操纵子第一个基因之前。优选，本 发明这方面的改变上游区含有位于ATG上游500到700bp位置处的 异源启动子。
因此，本发明提供在改变的细菌小泡中的BASBlll多肽。本发 明也提供能够产生基于非生命膜的小泡载体的修饰宿主细胞。本发明 还提供含有BASBlll基因的核酸载体，所述基因具有含有异源调控 元件的改变上游区。
本发明还提供制备本发明的宿主细胞和细菌小泡的方法。
本发明也提供含有本发明的多肽和/或多核苷酸以及免疫调节 DNA序列如Sato, Y.《科学》273: 352 ( 1996)中介绍的DNA序列 的组合物，特别是疫苗组合物，以及方法。
本发明还提供在粘膜炎莫拉氏菌感染的动物模型的这种遗传免疫 实验中所用的多核苷酸结构物中使用所介绍的多核苷酸或其特殊片段 的方法，其中多核苷酸或其特殊片段已经显示编码细菌细胞表面蛋白 的非可变区。这种实验可特别用于鉴定能够激发预防性或治疗性免疫 应答的蛋白表位。可以相信，这种方法将能够用于随后由成功地抵抗 或清除了感染的动物的必需的器官，制备有特殊价值的单克隆抗体， 用于发展哺乳动物特别是人的治疗细菌性感染特别是奈瑟氏菌感染的 预防性试剂或治疗性试剂。
本发明还包括疫苗制剂，这种制剂包括本发明的 一种免疫原性重 组多肽和/或多核苷酸以及一种合适的载体，例如一种可药用载体。因 为多肽和多核苷酸可能在胃中会被打断，它们都优选经肠道外给药， 包括诸如皮下、肌肉、静脉或皮内，适用于肠道外给药的制剂包括水
和非水的无菌注射溶液，它们可含有抗氧化剂、緩冲液、抑菌剂和能 够使制剂与个体的体液优选是血液等渗的溶剂，以及可包含悬浮剂或 增稠剂的水和非水无菌悬液。制剂可置于单剂量或多剂量的容器内， 例如密封的安瓶和小瓶，并可贮存于冷冻干燥的环境，只需在使用前 加入无菌的液体载体。
本发明的疫苗制剂也可包括佐剂系统，用来增强制剂的免疫原性。
优选佐剂系统优先引发TH1型应答。
免疫应答大体上可分为两个典型的种类，即体液或细胞介导的免 疫应答(一般分别用其保护作用的抗体和细胞效应机制来区分)。这
些应答种类被称为TH1型应答(细胞介导的应答)和TH2型免疫应 答(体液应答)。
胞毒^淋巴细胞和自然杀伤型细胞应答。在小、鼠中，TH1型应答的特 征通常是产生IgG2a亚型的抗体，而在人中，它们的对应物是IgGl 型抗体。TH2型免疫应答的特征是产生广谱的免疫球蛋白同种型，在 小鼠中包括IgGl、 IgA和IgM。
可以想象得到，这两种类型的免疫应答之后的驱动力是细胞因子。
答，而高水平的TH2型细胞因子优先诱导针对抗原的体液免疫应答。； TH1和TH2型免疫应答的区分不是绝对的。事实上， 一个个体可 以支持一种被描述为TH1优势或TH2优势的免疫应答。但是，通常 方便地按照Mosmann和Coffman在鼠CD4+ve T细胞克隆中的介绍来 考虑细胞因子的家族(Mosmann,T.R,和Coffman, R丄，(1989 ), TH1 和TH2细胞淋巴因子的不同分泌模式导致不同的功能特性。《免疫 学年鉴》7巻，145-173页)。通常，TH1型应答与T淋巴细胞产生INF-丫 和IL-2细胞因子相关。其他通常直接与TH1型免疫应答诱导有关的 细胞因子如IL-12不由T细胞产生。相反，TH2型应答与IL-4、 IL-5、 IL-6和IL-13的分泌有关。
已知特定的疫苗佐剂特别适合于刺激TH1或TH2型细胞因子应 答。疫苗接种或感染后免疫应答的TH1: TH2平衡的最佳指标通常包 括在体外用抗原再刺激后直接测量T淋巴细胞产生的TH1或TH2细 胞因子，和/或测量抗原特异的抗体应答的IgGl: IgG2a比率。
因此，TH1型佐剂是在体外用抗原再刺激时优先刺激分离的T细 胞群体产生高水平的TH1型细胞因子和促进CD8+细胞毒T淋巴细胞 和与TH1型同种型相关的抗原特异的免疫球蛋白应答产生的佐剂。
能够优先刺激TH1细胞应答的佐剂在国际专利申请 No.W094細53和WO95/17209中介绍。
3 De-O-酰化单磷酰类脂A (3D-MPL)是一种这样的佐剂。这可 由GB2220211 (Ribi)知道。它在化学上是3 De-0酰化单磷酰类脂A 与4、 5或6酰基《连的混合物，并由Ribi Immunochem, Montana制造。 3 De-O-酰化单磷酰类脂A的一种优选形式在欧洲专利0 689 454 (SmithKline Beecham Biologicals SA )中公开。
3D-MPL颗粒优选小到足以通过一个0.22 pm微孔滤膜进行过滤 除菌(欧洲专利0 689 454 )。
3D-MPL以每剂10 pg-100pg，优选是20-25ng的范围存在，而抗 原通常以每剂2-50pg的范围存在。
另一个优选的佐剂包含QS21，它是一种来自Quillaja Saponaria Molina的茎的Hplc纯化的无毒组分。它可选用来与3 De-O-酰化单磷 酰类脂A (3D-MPL)混合，并可与一种载体一起使用。
制备QS21的方法在美国专利No.5,057,540中公开。
含有QS21的非反应性的佐剂制剂在以前已有介绍(WO 96/33739 )。含有QS21和胆甾醇的这种制剂在与抗原一起配制时已显 示是成功的TH1刺激佐剂。
优先刺激TH1型细胞应答的进一步的佐剂包括免疫调节性的寡核 苷酸，例如非甲基化的CpG序列，如WO 96/02555中的^^开。
不同TH1刺激性佐剂如上文所介绍的佐剂的组合也被认为是能提 供一种优先刺激TH1型细胞应答的佐剂。例如，QS21可与3D-MPL 组合配制。OS21: 3D-MPL的比率通常为1: 10至10: 1，优选为1: 5至5: 1,并且通常为大约l: 1。优选的最佳组合范围是2.5: 1至1: 1的3D-MPL: QS21。
根据本发明，疫苗组合物还优选含有一种载体。载体可以是一种 水包油乳剂，或一种铝盐如磷酸铝或氬氧化铝。
水包油乳剂优选包含一种可代i射的油，例如角篁烯、a-生育酚和 Tween 80。在一个特别优选的方面，4艮据本发明，疫苗组合物中的抗
原与QS21和3D-MPL在这样一种乳剂中组合。另外，该水包油乳剂 可以含有span 85和/或卵磷脂和/或三辛精。
在对人给药时，疫苗中QS21和3D-MPL的范围是每剂1 pg，例如10-100 ng,优选是IO pg-50 pg。水包油通常含有2至10% 的角鲨烯、2至10。/Q的a-生育酚和0.3至3Q/。的Tween 80。在以更稳定 的乳剂形式提供时，角鲨烯a-生育酚Tween 80的比例优选相同或 少于1。还可包含1%水平的Span85。在某些情况下，本发明的疫苗 优选进一步含有一种稳定剂。
非毒性的水包油乳剂优选在 一种水载体中含有 一种非毒性的油如 角鲨烷或角鲨烯、 一种乳化剂如Tween 80。水载体可以是例如磷酸緩 冲盐水。
WO 95/17210中介绍了一种特别强有力的佐剂制剂，它含有在一 种水包油乳剂中的QS21、 3D-MPL和生育酚。
本发明还提供一种多价的疫苗组合物，它含有本发明的疫苗制剂 以及其他抗原，特别是对治疗癌症、自身免疫疾病和相关病症有用的 抗原。这样一种多价疫苗组合物可包括一种如前所述的TH1诱导型佐 剂。
虽然本发明对特定的BASBlll多肽和多核苷酸进行了介绍，但 应当理解它们覆盖了天然产生的多肽和多核苷酸以及含有添加、缺失 或取代的相似多肽和多核苷酸，这些添加、缺失或取代基本上不影响 重组多肽或多核苷酸的免疫原特征。
组合物、试剂盒和给药
在本发明的一个进一步的方面，提供含有用于对一个细胞或一个 多细胞生物体给药的BASBlll多核苷酸和/或BASBlll多肽的组合 物。
本发明还涉及含有这里讨论的多核苷酸和/或多肽或它们的激动剂 或拮抗剂的组合物。本发明的多肽和多核苷酸可与 一种非无菌或无菌 载体或用于细胞、组织或生物体的载体，例如一种适用于对个体给药 的药用载体组合使用。这种组合物包括例如一种介质添加剂或一种治
疗有效剂量的本发明的多肽和/或多核苷酸以及一种可药用载体或赋形 剂。这种载体可包括但不限于盐水、緩冲盐水、葡萄糖、水、甘油、 乙醇以及它们的组合物。制剂应适合于给药模式。本发明进一步涉及
诊断和药用包装和试剂盒，它们含有一种或多种容器，容器中装有一 种或多种本发明的上面提到的成分。
本发明的多肽、多核苷酸和其他化合物可单独或与其他化合物例 如治疗性化合物一起使用。
药用组合物可通过任何有效、传统的方式进行给药，包括诸如通 过局部、口、肛门、阴道、静脉内、腹膜内、肌肉、皮下、鼻内或皮
内途径及其他途径进行给药。
在用于治疗或预防时，活性试剂可以一种可注射的组合物的形式 给药于个体，例如以无菌水分散物优选是等渗的形式给药。
在一个进一步的方面，本发明提供药用组合物，它包含一种治疗 有效剂量的多肽和/或多核苷酸例如本发明的多肽和/或多核苷酸的可 溶形式、激动剂或拮抗剂或小分子化合物、以及一种可药用载体或赋 形剂。这种载体包括但不限于盐水、緩冲盐水、葡萄糖、水、甘油、 乙醇以及它们的组合物。本发明进一步涉及药用包装和试剂盒，它们 含有一种或多种容器，容器中装有一种或多种本发明的上面提到的成 分。本发明的多肽、多核苷酸和其他化合物可单独或与其他化合物例 如治疗性化合物一起^f吏用。
组合物应采用 一种给药途径，例如通过一种全身性或经口途径。 全身性给药的优选形式包括注射，通常通过静脉注射。其他的注射途 径例如皮下、肌肉或腹膜都可以采用。全身性给药的其他方法包括使 用渗透剂如胆盐或梭链孢酸或其他去污剂经粘膜和皮肤给药。此外， 如果本发明的一种多肽或其他化合物可配制成一种肠溶或一种胶嚢制 剂，经口途径也可以使用。这些化合物的至合药也可经表皮和/或局部， 以药膏、帖膏、凝胶、溶液、粉末等形式使用。
为对哺乳动物特别是人进行给药，活性试剂的每日剂量水平应从
0.01 mg/kg至10 mg/kg，通常为1 mg/kg左右。在任何情况下，医生 应确定最适合于个体的实际剂量，并根据年龄、体重和特殊个体的应 答而不同。当然，在个体情况时，可以使用更高或更低的剂量范围， 这些也都在本发明的范围内。
所需的剂量范围依赖于所选择的肽、给药途径、制剂的性质、用 药者病症的性质以及医师的判断。但合适的剂量为每kg 0.1-100 pg的范围。
疫苗组合物一般采用注射形式。传统的佐剂可用来增强免疫应答。
疫苗接种的合适单位剂量为0.5-5pg/kg的抗原，这样的剂量优选给药 1-3次、间隔1-3周。对于指定的剂量范围，本发明的化合物在给药 于合适的个体时，不会观察到毒副作用。
但考虑到可以使用不同的化合物以及不同给药途径可产生不同的 效果，所需的剂量有广泛的变化。例如，口服途径比静脉注射需要更 高的剂量。这些剂量水平的变化可按照本领域熟知的方法使用标准的 优化实践途径进行调整。
序列数据库、有形介质中的序列以及算法
多核苷酸和多肽序列组成了有价值的信息来源，用来确定它们的 二维和三维结构以及进一步鉴定相似同源的序列。这些方法可很方便 地通过下述步骤来进行，即将它们存入计算机可读介质，然后将数据 存入一个已知的大分子结构程序或使用熟知的搜索工具如GCG程序 包搜索一个序列数据库。本发明还提供分析特征序列或链特别是基因序列或编码蛋白序列 的方法。优选的序列分析的方法包括诸如序列同源性分析方法如同 一性和相似性分析、DNA、 RNA和蛋白结构分析、序列排列、进化 分析、序列基元分析、开放阅读框确定、核酸碱基召唤、密码子使用 分析、核酸碱基整理、和序列层析峰分析。
本发明提供了一种以计算机为基础的方法，用于进行同源性鉴定。 此方法包括以下步骤提供在一种计算机可读介质中的含有本发明的 一种多核苷酸序列的第一个多核苷酸序列，将所述第一个多核苷酸与 至少一种第二个多核苷酸或多肽序列比较，来确定同源性。
本发明提供了 一种以计算机为基础的方法，用于进行同源性鉴定。 所述方法包括以下步骤提供在一种计算机可读介质中的含有本发明 的 一 种多肽序列的第 一 个多肽序列，将所述第 一 个多肽序列与至少一 种第二个多核苷酸或多肽序列比较，来确定同源性。
本申请书中引用的所有出版物和参考文献，包括但不限于专利和 专利申请，在这里都全文引入作为参考，如同它们各自都特别地和个 别地在此全文列出。本申请要求优先权的任何专利申请也以与上面对
定义乡 、5, 、乡"同一性"如同本领域所熟知的，是两种或多种多肽序列或两种 或多种多核苷酸序列之间的相关性，根据具体情况，可通过序列比较 来确定。在本领域，"同一性"还指多肽或多核苷酸序列之间序列相关 的程度，根据具体情况，可通过这些序列的链的匹配来确定。"同一性"
可使用已知的方法方便地计算，包括但不限于(《计算分子生物学》，Lesk, A.M.编辑，Oxford University Press, New York, 1988;《生物计算机信 息和基因组计划》Smith, D.W.编辑，Academic Press, New York, 1993;《序 列数据的计算机分析》I部分，Gri伍n, A.M.和Griffin, H.G.编辑，Humana Press, New Jersey, 1994;《分子生物学中的序列分析》von Heine, G.， Academic Press, 1987;和《序歹'J分冲斤引物》Gribskov, M,和Devereux, J. 编辑，M Stockton Press, New York, 1991;和Carillo, H.和Lipman, D.,
《SIAMJ. Applied Math》48: 1073(1988)。测定同一性的方法被设计来 给出检测序列之间的最大匹配。而且，测定同一性的方法在公众可获 得的计算机程序中编码。用来测定两种序列之间的同 一性的计算机程 序方法包括但不限于GCG程序包中的GAP程序(Devereux, J.等《核 酸研究》12 ( 1 ): 387 ( 1984)、 BLASTP、 BLASTN ( Altschul,S.F.等《分 子生物学杂志》215: 403-410 ( 1990)以及FASTA ( Pearson和Lipman
《美国科学院院刊》85: 2444誦2448( 1988)。 BLAST程序家族可从NCBI 和其他来源获得(《BLAST手册》Altschul， S.等，NCBI NLM NIH Bethesda: MD 20894; Altschul, S.等《分子生物学杂志》215: 403-410 ( 1990)。 著名的Smith Waterman算法也可用来测定同 一性。 多肽序列比较的参数包括以下
算法Needleman和Wunsch,《分子生物学杂志》48: 443-453 (1970)
比较矩阵Henikoff和Henikoff的BLOSSUM62 《美国科学院院刊》89: 10915-10919 ( 1992) 缺口补偿8 缺口长度补偿2
4吏用这些参数的程序可以从Genetics Computer Group, Madison WI
以"缺口"程序的形式获得。上述参数是多肽比较的缺省参数(对末 端缺口无补偿)。
多核苷酸序列比较的参数包括以下
算法Needleman和Wunsch,《分子生物学杂志》48: 443-453 (1970)
比较矩阵匹配=+10，不匹配=0 缺口补偿50 缺口长度补偿3
来源Genetics Computer Group, Madison WI的"缺口，，禾呈序。 上述参数是核酸比较的缺省参数。
多核苷酸和多肽的"同一性"的优选含义根据情况在下面(1)和 (2)中提供。
(1 )多核苷酸实施方案进一步包括含有如下核苷酸序列的分离多 核苷酸，该核苷酸序列与SEQIDNO: 1的参考序列至少具有50、 60、 70、 80、 85、卯、95、 97或100%的同一性，其中所述多核苦酸序列 可以与SEQ ID NO: l的参考序列相同，或者与参考序列相比，可包 括一定数量的核苷酸改变，其中这种改变可以选自至少一个核苷酸缺 失、置换(包括转换和颠换)或插入，其中所述改变可以发生在参照 多核苷酸序列的5'或3'末端或两个末端之间的任何位置，分别散布在 参照序列的核苷酸之间，或者以一个或多个毗连群散布在参照序列 中，其中核苷酸改变的数量如下确定SEQIDNO: 1中的总核苷酸 数乘以相应同一性百分数(除以100)，然后将其结果从SEQIDNO: l的总核苷酸数中减除，或者
nA-(xn*y)
其中rin是核苷酸改变的数目，Xn是SEQ ID NO: 1中的核苷酸总 数，y对50%来说是0.50，对60%来说是0.60,对70%来说是0.70, 对80%来说是0.80,对85%来说是0.85,对90%来说是0.90，对95% 来说是0.95,对97%来说是0.97,对100%来说是1.00，而，是乘法运 算的符号，对Xn和y的结果不是整数，则将其四舍五入取最近的整数， 再从Xn中减除。编码SEQIDNO: 2的多肽的多核苷酸的改变可能在 该编码序列中产生无义、错义或移码突变，因此改变后的多核苷酸编 码的多肽会发生变化。
例如，本发明的多核苷酸序列可以与SEQ ID NO: 1的参照序列
相同，即同一性为100%,或者与参照序列相比包括一定数量的核苷 酸改变，因此同一性小于100%。这种改变可以选自至少一个核苦酸
缺失、置换(包括转换和颠换)或插入，其中所述改变可以发生在参
照多核苦酸序列的5'或3'末端或两个末端之间的任何位置，分别散布 在参照序列的核苷酸之间，或者以 一 个或多个毗连群散布在参照序列 中。核苷酸改变的数量如下确定SEQ ID NO: 1中的总核苷酸数乘 以相应同一性百分数(除以100)，然后将其结果从SEQ ID NO: l的 总核苷酸数中减除，或者
n^xn-(xn*y)
其中r^为核苷酸改变数量，Xn为SEQ ID NO: 1的总核苷酸数， y值在70%时为0.70，在80%时为0.80，在85%时为0.85,依此类 推，，为乘法运算的符号，其中若Xn和y的结果不是整数，则将其四 舍五入取最近的整数，再从x。中减除。
(2)多肽实施方案进一步包括含有如下多肽序列的分离多肽，该 多肽序列与SEQIDNO: 2的参考序列至少具有50、 60、 70、 80、 85、 90、 95、 97或100%的同一性，其中所述多肽序列可以与SEQIDNO: 2的参考序列相同，或者与参考序列相比，可包括一定数量的氨基酸 改变，其中所述改变选自至少一个氨基酸缺失、取代(包括保守性或 非保守性取代)或插入，而且所述改变可发生在参考多肽序列的氨基 或羧基末端位置或这些末端位置之间的任何地方、分别散布在参考序 列的氨基酸中或者以一个或多个毗连群散布在参考序列中，并且所述 氨基酸改变的数目如下确定SEQ ID NO: 2中的总氨基酸数乘以相 应同一性百分数(除以100),然后将其结果从SEQ ID NO: 2的总氨 基酸数中减除，或者
n^xa-(xa*y)
其中na为氨基酸改变数量，Xa为SEQIDNO: 2中的氨基酸总数， y对50%来说是0.50，对60%来说是0.60，对70%来说是0,70，对80% 来说是0.80，对85%来说是0.85，对90%来说是0.90,对95%来说是
0.95，对97%来说是0.97,对100%来说是1.00，而》是乘法运算的符 号，若Xa和y的结果不是整数，则将其四舍五入取最近的整数，再从
Xa中减除。
例如，本发明的多肽序列可以与SEQ ID NO: 2的参照序列相同， 即同一性为100%，或者与参照序列相比包括一定数量的氨基酸改变， 因此同一性小于100%。这种改变可以选自至少一个氨基酸缺失、置 换(包括保守和非保守置换)或插入，其中所述改变可以发生在参照 多肽序列的氨基或羧基末端或两个末端之间的任何位置，分别散布在 参照序列的氨基酸之间，或者以一个或多个毗连群散布在参照序列 中。同一性百分数一定时氨基酸改变的数量如下确定SEQIDNO: 2 中的总氨基酸数乘以相应同一性百分数(除以100),然后将其结果从 SEQIDNO: 2的总氨基酸数中减除，或者
nA-(xa*y)
其中na为氨基酸改变数量，Xa为SEQIDNO: 2的总氨基酸数，y 值在70%时为0.70,在80%时为0.80，在85%时为0.85，依此类推， 而争是乘法运算的符号，其中若\和y的结果不是整数，则将其四舍 五入取最近的整数，再从Xa中减除。
"个体"在用于此处指示一种生物体时，是指一种多细胞真核生 物，包括但不限于后生动物、哺乳动物、卵生动物、牛科、猿、灵长 动物和人。
"分离的"表示"通过人工"改变其天然状态，即如果"分离的" 组合物或物质在自然界中存在，则它已经从其原始环境改变或取出或 者已经取出并改变。例如，在本文中使用该术语时，在活动物体内存 在的多核苷酸或多肽不是"分离的"，但已经与天然状态下共存的物 质分开的同样多核苷酸或多肽就是"分离的"。而且， 一种多核苷酸 或多肽在通过转化、遗传操作或任何其他重组方法导入一种生物体 时，即使它仍然存在于所述生物体中，它也是"分离"的，该生物体 可以是活的或死的。
"多核苷酸" 一般指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，它 可以是修饰或非修饰的RNA或DNA，包括单链和双链区域。
"变体"指不同于参照多核苷酸或多肽但保留了基本特性的多核 苷酸或多肽。 一般多核苷酸变体的核苷酸序列与参照多核苷酸不同。 变体核苷酸序列的变化可能改变或不改变由参照多核苷酸编码的多肽
的氨基酸序列。如下所述，核普酸改变可能导致参照序列编码的多肽 中氨基酸的置换、添加、缺失、融合和截短。 一般多肽变体的氨基酸 序列与参照多肽不同。通常，差异有限，因此参照多肽和变体的序列 在总体上是极其近似的，在许多区域是相同的。变体和参照多肽在氨 基酸序列上可以有任何组合形式的一个或多个置换、添加、缺失的区 别。置换或插入的氨基酸残基可以是或不是遗传密码编码的氨基酸。 多核苷酸或多肽的变体可以是天然存在的，如等位变体，或者是非天 然存在的。非天然存在的多核苷酸和多肽变体可以通过诱变技术或直 接合成制备。
"疾病"是指任何由细菌感染导致或与之有关的疾病，包括诸如 婴幼儿中耳炎、老年人肺炎、鼻窦炎、医院内感染和侵袭性疾病、伴 有听力丧失的慢性中耳炎、中耳积液、听神经损害、说话延迟、上呼 吸道感染和中耳炎症。
实施例
下面的实施例使用标准的技术进行，这些技术对本领域的技术人 员来说是熟知的和常规的，除非它们在其他地方详细介绍。实施例是 说明性的，不能限制本发明。
实施例1:粘膜炎莫拉氏菌菌林ATCC 43617中BASB111基因的 发现和验证性DNA测序
粘膜炎莫拉氏菌菌林ATCC 43617 (也称为MC2931 )的BASB111 基因序列示于SEQ ID NO: 1。 SEQ ID NO: 2中所示为BASB111多
核苦酸序列的翻译结果。
实施例2:表达重组BASB111的质粒的构建
A: BASB111的克隆
将EcoRI和Sail限制位点分别插入正向MC-Lip2-Fn/t-RI (5'-AGG CAG AGG GAA TTC ATG AAT TTT GGT AAA ATT AAT GG-3', SEQ
ID NO:3)和反向MC-Lip2RCh/t國Sal (5'-AGG CAG AGG GTC GAC TTA ATG GTG ATG GTG ATG GTG CCA GCC TTT GAT AAC ACC ATC TT-3', SEQ ID NO:4)扩增引物，它们允许PCR产物定向克隆至大肠杆 菌表达质粒pTLZ2中，使得BASBlll蛋白可以表达成C末端含有(His)6 亲和层析标志的融合蛋白。BASB111 PCR产物使用硅胶基自旋柱 (QiaGen)按照厂商说明由扩增产物中纯化。为了产生克隆所需的 EcoRI和Sail末端，纯化的PCR产物用EcoRI和Sail限制酶4要照厂 商(Life Technologies )说明依次消化完全。
第一次限制消化后，PCR产物同上通过自旋柱纯化以除去盐，在 第二次酶消化之前，用无菌水洗脱。消化的DNA片段在与pTLZ2质 粒连接前使用硅胶基自旋柱再次纯化。 B:表达载体制备
为了制备连接用的表达质粒pTLZ2，将其用EcoRI和Sail同样消 化完全，然后按照厂商说明用牛肠磷酸酶(CIP,约0.02单位/皮摩尔 5'末端，Life Technologies)处理以防止自身连接。将相对制备的载体 约5倍摩尔过量的消化片段用来进行连接反应。标准的20pl连接反应 (约16°C,约16小时)利用本领域已知的技术使用T4 DNA连接酶 (约2.0单位/反应，Life Technologies)进行。连接反应(约5jll1 )的 等分试样按照本领域已知技术用来转化电感受态JM109细胞。在约1.0 毫升LB培养液中37°C下生长约2-3小时后，转化细胞涂布于含有 氨苄青霉素(100pg/ml)的LB琼脂平板上。在选择培养基中包括抗 生素。平板在37°C温育约16小时。单独的ApR菌落用无菌牙签挑 出，"片状，，接种新鲜LB ApR平板以及约1.0 ml LB ApRR培养液。 片状平板和培养液在标准温育箱(平板)或水浴摇床上3"C温育。
进行全细胞PCR分析以确证转化子含有BASB111 DNA插入物。 将约l.O毫升LB Ap过夜培养物转移到1.S毫升聚丙烯管中，在Beckman 离心机中离心收集细胞(约3分钟，室温，约12000xg)。细胞沉淀重 悬于约200 nl无菌水中，约10|Lil等分试样用于进行终体积约50^1的 PCR反应，其中含有BASB111正向和反向扩增引物。PCR反应成分 的终浓度基本上与实施例2中相同，但使用约5单位Taq聚合酶。开 始的95。C变性步骤增加到3分钟以确保细菌细胞的热裂解和质粒DNA 的释放。使用ABI 9700型热循环仪，进行32循环的3步热循环，循
环条件为95。C45秒；55 - 58°C 45秒；72。C 1分钟，以扩增裂解的 转化子样品的BASB111 PCR片段。热循环后，取约20)il反应等分试 样通过琼脂糖凝胶电泳(Tris-乙酸-EDTA(TAE)緩冲液中的0.8°/0琼脂 糖)进行分析。凝胶电泳后使用UV照射和溴化乙锭染色显示DNA 片段。DNA分子量标准(1 Kb梯度，Life Technologies)与试样平行 电泳，用于估计PCR产物的大小。产生预期PCR产物的转化子鉴定 为含有BASB111表达构建体的菌林。然后分析含有表达质粒的菌抹 中重组BASBlll的诱导表达。
C: PCR阳性转化子的表达分析
对于以上鉴定的每一个PCR阳性转化子，约5毫升含有氨节青霉 素(100 pg/ml)的LB培养液用来自片状平板的细胞接种，37。C振荡
(约250 rpm)生长过夜。过夜种子培养物的等分试样(约1.0 ml) 接种含有约25毫升LB Ap培养液的125毫升烧瓶中，37°C振荡(约 250 rpm)生长过夜，直至培养物浊度达到O.D.600约为0.5,即中对 数期(通常需约1.5到2.0小时)。此时，约一般培养物(约12.5 ml) 被转移到第二个125毫升烧瓶中，通过加入IPTG(无菌水中制备的1.0 M原液，Sigma )至终浓度1.0 mM诱导重组BASB111蛋白的表达。IPTG 诱导和未诱导培养物在37°C下再振荡温育约4小时。诱导和未诱导 培养物样品(约1.0毫升)在诱导期后取出，室温下在离心机中离心 约3分钟收集细胞。单独的细胞沉淀悬浮于约50ili1无菌水中，然后与 等体积含有2-巯基乙醇的2xLaemmli SDS-PAGE样品緩冲液混合， 置于沸水浴中约3分钟以变性蛋白。等体积(约15 pl) IPTG诱导和 未诱导细胞粗裂解物上样于两块12% Tris/甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶(1 mm厚Mini-gels, Novex)。诱导和未诱导裂解物样品与预先染色的分 子量标记(SeeBlue, Novex )在常规条件下一起电泳，使用标准SDS/Tris/ 甘氨酸电泳緩冲液(BioRad )。电泳后， 一块凝胶用考马斯亮蓝R250
(BioRad)染色，然后脱色以显示新的BASB111 IPTG诱导蛋白。第 二块凝胶使用BioRad Mini-Protean II印迹装置和Towbin曱醇(20% ) 转移緩冲液在4。C下电印迹约2小时转移到PVDF膜(0.45微米孔径， Novex)。膜的封闭和抗体温育按照本领域已知技术进行。使用单克隆 抗RGS(His)3抗体，然后是辍合有HRP (QiaGen)的兔抗小鼠抗体， 以确证BASBlll重组蛋白的表达和身份。使用ABT不溶底物或使用
Amersham ECL化学发光系统的Hyperfilm显示抗His抗体反应性特 征。
实施例4:产生重组BASBlll
细菌菌才朱
含有编码粘膜炎莫拉氏菌BASB111的质粒(pTLZ2)的大肠杆菌 JM109重组表达菌抹被用来产生纯化重组蛋白的细胞群体。表达菌抹 在LB琼脂平板上培养，平板中含有100 pg/ml氨千青霉素(Ap)以确保 pTLZ2质粒存在。为了在-80。C下冷藏，菌林在含有相同浓度的抗生 素的LB培养液中增殖，然后与等体积含有30。/。(w/v)甘油的LB培养 液混合。
培养基
用于产生重组蛋白的发酵培养基为含有100 pg/ml Ap的2X YT培 养液(Difco)。向发酵罐中的培养基加入消泡剂至0.25 ml/L (Antifoam 204, Sigma)。为了诱导BASB111重组蛋白的表达，向发酵罐中加入 IPTG (异丙基(3-D -硫代半乳糖吡喃苷)(1 mM,终浓度)。
发酵
含有50毫升工作体积的500毫升种子培养烧瓶中接种0.3毫升迅 速解冻的水冻培养物或来自选择性琼脂平板上的几个菌落，在摇床 (Innova 2100, New Brunswick Scientific )上以150rpm在37±10C温育 约12小时。该种子培养物用来接种含有2X YT培养液和Ap、工作体 积为5升的发酵罐。发酵罐(Bioflo 3000, New Brunswick Scientific) 的运行条件为37±1。C、 0.2-0.4 VVM通气、Rushton叶轮250rpm。烧 瓶种子培养物和发酵罐中的pH无需控制。发酵期间，发酵罐中的pH 为6.5到7.3。当培养物达到生长的中对数期时(O.D. 600为约0.7单 位)，向发酵罐中加入IPTG ( 1.0 M原液，在无菌水中制备)。诱导细 胞2 - 4小时，然后，使用28RS Heraeus (Sepatech)或RC5C超速离心 机(Srovall Instruments)离心收集细胞。细胞沉淀保存在-20。C待用。 纯化
化学药品和材料
生物技术级或更高级别咪唑、盐酸胍、Tris(羟曱基)和EDTA(乙 二胺四乙酸)均获自Ameresco Chemical, Solon, Ohio。 Triton X-100 ( ^又
辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)、Triton X-114、 一价磷酸钠、尿素均为 试齐'J级或更优级另U ， 均获自 Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri。；水乙酸和盐酸获自Mallincrodt Baker Inc., Phillipsburg, New Jersey。
曱醇获自Fisher Scientific, Fairlawn, New Jersey。 Pefabloc SC
(4 - (2-氨乙基)苯磺酰氟)、全蛋白酶抑制剂混合物片剂和PMSF (苯 甲基-磺酰氟)获自 Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, Indiana。苯丁抑制素、抑胃酶肽A和E64蛋白酶抑制剂获自Calbiochem, La Jolla, California。 Dulbecco's磷酸緩冲盐水(IxPBS)获自Quality Biological, Inc., Gaithersburg, Maryland。 Dulbecco's石粦酸緩冲盐7JC
(10xPBS )获自BioWhittaker, Walkersville, Maryland。无BSA的五His 抗体获自QiaGen, Valencia, California,过氧化物酶辍合的亲和纯级羊 抗小鼠IgG获自Jackson Immuno Research, West Grove, Penn。 AEC溶 '液获自Zymed, South San Francisco, California。戶斤有其它^式剂均为i式 剂级或更高级别。
Ni螯合Sepharose速流树月旨获自Pharmacia, Sweden, California。 预制Tris-甘氨酸4-20%和10-20%聚丙烯酰胺凝胶、所有电泳緩沖 液和溶液、SeeBlue预先染色标准、多标记多色标准和PVDF转移膜 获自Novex, San Diego, California。 SDS - PAGE银染试剂盒获自Daiichi Pure Chemicals Company Limtid, Toyko, Japan。 考马斯染色溶液获自 Bio-Rad Laboratories, Hercules, California。 Acrodisc PF 0.2m注射器 式滤器荻自Pall Gelman Science, Ann Arbor, Michigan。 GD/X 25mm — 次性注射器式滤器获自Whatman Inc., Clifton, New Jersey。透析管8,000 MWCO获自BioDesign Inc. Od New York, Carmak New York。 BCA蛋 白分析试剂和Snake Skin透析管3,500 MWCO获自Pierce Chemical Co. Rockford, Illinois 。
由大肠杆菌中纯化重组BASB111 提取纯化
细胞沉淀在室温解冻30到60分钟。细胞沉淀破碎后，用含有Triton X-114的水冷PBS分配上清。除去细胞，上清加热到37°C,离心分离 各相。该级分然后过镍螯合Sepharose速流树脂，树脂预先用含有10 %甘油和0.05% Triton X100的PBS ( pH7.5 )平衡过。蛋白用含有200 mM咪唑的相同緩冲液洗脱。收集含有洗脱蛋白的级分并在10 kDa截 止搅拌室中浓缩，然后对含有0.1% Triton X100的PBS透析。
如图1A所示，纯化BASBlll蛋白在SDS-PAGE分析时为约36
kDa(估计相对分子量)迁移的双带。纯度估计大于90%。两个带对
小鼠抗6组氨酸基元单克隆抗体均有反应(图IB)。 生化鉴定
SDS - PAGE和蛋白印迹分析
重组纯化蛋白在4 - 20 %聚丙烯酰胺凝胶上分离，如前所述在100V 下1小时电转移到PVDF膜上(Thebaine等，1979，美国国家科学院 院刊，76: 4350 -4354 )。 PVDF膜然后用25 ml含有5%无脂奶粉的 Dulbecco's磷酸緩冲盐水预处理。所有进一步的温育均使用该预处理 緩冲液进行。
PVDF膜用25毫升1: 500稀释的预先免疫血清获自兔抗His免 疫血清在室温温育1小时。然后用洗涤緩冲液(20 mM Tris緩冲液， pH7.5，含有150mM氯化钠和0.05% Tween-20 )洗膜两次。PVDF膜 然后用25毫升1:5000稀释的过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG( Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA )室温温育30分钟。PVDF 膜然后用洗涤緩冲液洗涤4次，用Zymed (San Francisco, CA)提供 的3-氨基-9-乙基咔唑和脲过氧化物各显色10分钟。
实施例5:产生重组BASBlll抗血清
多价抗BASBlll蛋白血清通过用纯化重组BASBlll蛋白免疫两只 或者四只兔子产生。每只动物通过皮下注射给予3次免疫，每次10pg BASBlll蛋白，间隔约21天。在首次免疫之前(前血样)和49天、56 天，由动物取血。针对BASB111蛋白的多价血清通过用纯化重组BASB111 蛋白免疫小鼠6次产生。每只动物皮下免疫二或三次，每次注射约10吗 BASBlll蛋白，间隔约14天。在首次免疫之前(前血样)和最后一次 免疫后一周，由动物取血。抗BASBlll蛋白滴度使用纯化重组BASBlll 蛋白(4 jig/孔)通过ELISA测定。该滴度定义为使用XL Fit软件通过4 参数逻辑模型计算的中点滴度。兔子和小鼠血清中，免疫后滴度分别为 1: 270000和1: 46500。抗血清用作第一抗体，以如下实施例7所述在 蛋白质印迹中鉴定蛋白。蛋白质印迹表明在免疫动物血清中存在抗 BASBlll抗体(图2)。
实施例6:免疫鉴定BASB111表面暴露
抗BASB111蛋白滴度使用福尔马林灭活的粘膜炎莫拉氏菌菌抹14， 358， 216, 2926 (20 pg/孔)全细胞通过ELISA确定。该滴度定义为使 用XL Fit软件通过4参数逻辑模型计算的中点滴度。使用兔子免疫血清 (分别为1: 2600， 1: 2300， 1: 430， 1: 3300)观察到的滴度表明在 粘膜炎莫拉氏菌细胞表面检测到BASB111蛋白。
实施例7:免疫鉴定蛋白质印迹分析
粘膜炎莫拉氏菌ATCC 43617于36。C在Muller Hinton琼脂平板 上培养24小时。几个菌落用来接种250毫升烧瓶中的50毫升BHI培 养液。培养物在200 rpm培养约5小时，直至A620为约0.6，然后收 集离心。细胞浓缩10倍，4xl08 CFU在150微升PAGE样品緩冲液中 溶解(360 mM Tris緩冲液，pH8.8,含有4 %十二烷基硫酸钠和20 % 甘油)。100。C温育悬液5分钟。溶解的细胞在4-20%聚丙烯酰胺凝 胶上分离，分离的蛋白如前所述(Thebaine etal. 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350-4354) 100伏1小时电转移到硝酸纤维素膜上。硝 酸纤维素膜然后用50毫升含有3%牛血清白蛋白(BSA)的Dulbecco 磷酸緩冲盐水预处理。随后所有温育使用该预处理緩冲液进行。
硝酸纤维素膜用1: 20稀释的免疫前血清或小鼠免疫血清250微 升室温温育2小时。硝酸纤维素膜然后用洗涤緩冲液(含有"0 M氯 化钠和0.05 % Tween-20的20 mM Tris緩冲液，pH7.5 )洗涤3次。硝 酸纤维素膜用50毫升1: 500稀释的生物素标记绵羊抗小鼠Ig (Amersham Life Science Products)室温温育60分钟。硝酸纤维素膜然 后用洗涤緩冲液洗涤3次，用4-氯-1-萘酚(Sigma)各显色10分 钟。在莫拉氏菌ATCC43617菌林中检测到与抗血清反应的约29 kDa (相当于BASB111预期的分子量)蛋白(图3 )。
实施例8:免疫鉴定杀菌活性
分析抗BASB111抗体的补体介导的细胞毒活性以确定如上所述 制备的BASB111蛋白抗血清的疫苗潜力。测定免疫前血清和抗 BASB111抗血清介导补体灭活粘膜炎莫拉氏菌的活性。
粘膜炎莫拉氏菌菌株于36°C在Muller Hinton琼脂平板上培养24 小时。几个菌落加入1"亳升烧瓶中的15毫升BHI培养液。培养物 在200 rpm培养约4小时，直至A620为约0.4。洗涤一次后，细胞沉 淀用HBSS悬浮，稀释到每毫升28500 CFU。
50微升免疫前血清和抗BASB111血清(56°C灭活30分钟)加 入96孔板的第 一孔，HBSS的两倍系列稀释液加入同 一排的其它孔中。 随后加入25微升活的稀释粘膜炎莫拉氏菌，混合物在室温温育15分 钟。以先前的毒性实验中限定的工作稀释度向各孔中加入幼兔补体(Pel freez, clinical systems, Brown Deer， WI, USA )。
覆盖微量板，37°C下200rpm温育1小时。
每个实验包括一个补体对照(未加含有活性或灭活补体源的血清 的孔)、阳性对照(含有已知滴度的杀菌抗体的孔)、培养物对照(没 有血清和补体的孔)和血清对照(没有补体的孔)。
兔子和小鼠抗血清的杀菌滴度(同源菌林50%杀灭)为<1: 60 (免 疫前)和〉1: 316 (免疫)。
保藏材料
含有粘膜炎莫拉氏菌Catlin菌林的保藏物已于1997年6月21日 在美国典型培养物保藏中心(这里表示为"ATCC")进行保藏，保藏 号为43617。该保藏物为粘膜炎布兰汉氏球菌(Frosch和Kolle)，是 一种从患有慢性支气管炎的矿工气管吸出物获得的粘膜炎莫拉氏菌分 离物构建的1.5-2.9 kb插入文库的冻干物。该保藏物在Antimicrob. Agents Chemother. 21:506-508 ( 1982 )中介绍。
该粘膜炎莫拉氏菌菌抹保藏物在此被称为"保藏菌抹"或"保藏 菌才朱的DNA"。
保藏菌抹含有全长的BASB111基因。
由粘膜炎莫拉氏菌DNA插入pQE30组成的载体pMC-ORG1/2于 1999年2月12日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC),保藏号 为207118。
保藏菌抹/克隆中所含的多核苷酸以及编码的任何多肽的氨基酸序 列与本文的序列描述不一致时，以前者为准。
保藏菌林的保藏是根据《国际承认用于专利程序的微生物保藏的 布达佩斯条约》的条款进行的。在专利被授予时，该菌林即可不受限 制地无条件向公众发放。提供该保藏菌林仅为方便本领域技术人员， 并不表明本发明的实施需要该保藏材料，如同35U.S.C.《112的要求。
序列信息
BASBlll多核苷酸和多肽序列 SEQIDNO: 1
粘膜炎莫拉氏菌ATCC43617菌抹BASBlll多核苷酸序列
ATGAATTTTGGTAAAATTAATGGTATTTGTGCACTGGCATCTGGCATCGCATTGGCAGGC TGCAGCAATCAATCAAACGAACCAGCTGCCATATCTAAAACAGCTGCACAGACTATCAAG GTTGGCGTCATGGCAGGTCCTGAACAAGCTGTGGCAGAGGTAGCAGGTCAAGTCGCCAAA GAAAAATACAACCTGACCGTTGAATTGGTTGAGTTTAATGACTATGCCATGCCAAACTCA GCCGTCTCAAAAGGTGAACTTGACGCCAATGCCATGCAGCACAAACCCTATCTTGAAAAA GACAGCCAAGAAAAAGGCCTAAATAACTTGGTCATCGTCGGCAACACCTTTGTATACCCA TTGGCAGGTTATTCAACCAAAATCAAGACATTAAATGAGCTAAAAGATGGTGCAACCATC
TTAATTAAATTAAAAGACAACACCAACCTATTCTCAACCACACTTGMATCGTAGAAAAT CCAAAAAAATTGGTCATCAAAGAAGTGGATACCTCAGTTGCTGCTCGTGCAATTGACGAT GTGGACTTGGCAGTGGTAAATAACAACTA丁GCAGGTCAAGTAGGTTTAACAGCCAGTGAA AATGGCGTTTTTGTTGAAGATAAAGACTCGCCTTATGTCAATATCATCGTCGCTCGTGCT GACAATAAAGACTCTAAGGCCATCCAAGACT丁TGTGAAAGCCTATCAAACCGATGAAGTG GAAGCTGAAGCCAAAAAGCAATTTAAAGATGGTGTTATCAAAGGCTGGTAA
SEQIDNO: 2
由SEQIDNO: 1多核苷酸序列推导的粘膜炎莫拉氏菌BASBlll多肽 序列
MNFGKINGICALASGIALAGCSNQSNSPAAISKTAAQTIKVGVMAGPEQAVAEVAGQVAK EKYNLTVEXVEFNDYAMPNSAVSKGEXDANAMQHKPYLEKDSGEKGLNNLVIVGNTFVYP lAGYSTKIKTLNELKDGATIAVPNDPSNIARALILLEKQGLIKLKDNTNLFSTTLDIVEN
DNKDSKAIQDFVKAYQTDEVEAEAKKQFKDGVIKGW
SEQIDNO: 3
AGG CAG AGG GAA TTC ATG AAT TTT GGT AAA ATT AAT GG
SEQIDNO: 4
AGG CAG AGG GTC GAC TTA ATG GTG ATG GTG ATG GTG CCA GCC TTT GAT AAC ACC ATC TT :
序列表
<110>史密丝克莱恩比彻姆生物有限公司(SmthiKline Beecham S. A.) <120〉新化合物
<130> BM45395 <160> 4
<170> FastSEQ for Windows Version 3. 0
<210> 1 <211〉 831 <212> DNA
<213〉粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhal is) <400> 1
atgaattttggtaaaattaatggtatttgtgcactggcatctggcatcgcattggcaggc60
tgcagcaatcaccagctgccatatctaaaacagctgcacagactatcaag120
gttggcgtcatggcaggtcctg汪acaagctgtggcagaggtagcaggtcaagtcgccaaa180
gaaaaatacaacctgaccgttgaattggttgagtttaatgactatgccatgccaaactca240
gccgtctcaaaaggtgaacttgacgccaatgccatgcagcacaaaccctatcttga肌aa300
gacagccaagaaaaaggcctgtcatcgtcggcaacacctttgtetaccca360
ttggcaggttattcaaccaaaatcaagacattaaatgagctaaaagatggtgcaaccatc420
gccgttccaaatgatccctcaaacttagctcgtgcattaattttacttgaaaaacaaggc480
C3GC犯CCtattctcaaccacacttgatatcgtogaaaat540
ccaaaaaaattggtcatcaaagaagtggatacctcagttgctgctcgtgcaattgacgat600
gtggacttggcagtggtaaataacaactatgcaggtcaagtaggtttaacagccagtgaa660
aatggcgtttttgttgaagataaagactcgccttatgtcaatatcatcgtcgctcgtgct720
actctaaggccatcceiagactttgtgaaagcctatcaaaccgatgaagtg780
ccaaaaagcaatttaaagatggtgttatcaaaggctggtaa>831
<210> 2 <211> 276 <212> PRT
<213>粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis) <400> 2
Met Asn Phe Gly Lys lie Asn Gly lie Cys Ala Leu Ala Ser Gly lie
15 10 15
Ala Leu Ala Gly Cys Ser Asn Gin Ser Asn Glu Pro Ala Ala lie Ser 20 25 30
Lys
Gin
Leu
65
Ala
Tyr
Val
Lys
Asp 145 Leu
lie
Val
Asn
Val 225 Asp
Thr
lie
Thr
Ala
50
Thr
Val
Leu
Gly
Thr 130 Pro
lie
Val
Ala
Tyr 210 Glu
Asn
Asp
Lys
Ala
35
Val
Val
Ser
Glu
Asn 115 Leu
Ser
Lys
Glu
Ala 195 Ala
Asp
Lys
Glu
Gly 275
<210> <211〉 <212> <213〉
Ala
Ala
Glu
Lys
Lys 100 Thr
Asn
Asn
Leu
Asn 180 Arg
Gly
Lys
Asp
Val 260 Trp
3
38 DNA
人工序列
Gin
Glu
Leu
Gly
85
Asp
Phe
Glu
Leu
Lys 165 Pro
Ala
Gin
Asp
Ser 245 Glu
Thr
Val
Val
70
Glu
Ser
Val
Leu
Ala 150 Asp
Lys
lie
Val
Ser 230 Lys
Ala
lie Lys Val 40
Ala Gly Gin 55
Glu Phe Asn
Leu Asp Ala
Gin Glu Lys 105
Tyr Pro Leu
120 Lys Asp Gly 135
Arg Ala Leu
Asn Thr Asn
Lys Leu Val 185
Asp Asp Val
200 Gly Leu Thr 215
Pro Tyr Val
Ala lie Gin
Glu Ala Lys 265
Gly
Val
Asp
Asn
90
Gly
Ala
Ala
lie
Leu 170 lie
Asp
Ala
Asn
Asp 250 Lys
Val Met
Ala Lys
60 Tyr Ala 75
Ala Met
Leu Asn
Gly Tyr
Thr lie 140 Leu Leu 155
Phe Ser
Lys Glu
Leu Ala
Ser Glu 220 lie lie 235
Phe Val Gin Phe
Ala Gly 45
Glu Lys
Met Pro
Gin His
Asn Leu 110 Ser Thr 125
Ala Val
Glu Lys
Thr Thr
Val Asp 190 Val Val 205
Asn Gly
Val Ala
Lys Ala
Lys Asp 270
Pro Glu
Tyr Asn
Asn Ser
80 Lys Pro 95
Val lie
Lys lie
Pro Asn
Gin Gly 160 Leu Asp 175
Thr Ser
Asn Asn
Val Phe
Arg Ala 240 Tyr Gin 255
Gly Val
<220〉
<223>引物 <400> 3
aggcagaggg aattcatgaa ttttggtaaa attaatgg 38
<210> 4 <211〉 59 <212〉 DNA <213〉人工序列
<220>
<223>引物 <400〉 4
aggcagaggg tcgacttaat ggtgatggtg atggtgccag cctttgataa caccatctt 59
权利要求
1.含有如下氨基酸序列的分离多肽，该氨基酸序列与SEQ IDNO2的氨基酸序列全长序列具有至少85％的同一性。
2. 权利要求1的分离多肽，其中氨基酸序列与SEQ ID NO: 2 的氨基酸序列具有至少95%的同一性。
3. 权利要求l的分离多肽，含有SEQIDNO: 2的氨基酸序列。
4. SEQ ID NO: 2的分离多肽。
5. 权利要求1-4任一项的多肽的免疫原性片段，其中所述免疫 原性片段的免疫原活性基本上与SEQ ID NO: 2的多肽相同。
6. 权利要求1 -5任一项的多肽，其中所述多肽是较大融合蛋白 的一部分。
7. 编码权利要求1 -6任一项的多肽的分离多核苷酸。
8. 含有编码与SEQIDNO: 2的氨基酸序列全长序列具有至少85 %的同一性的核苷酸序列的分离多核苷酸；或与该分离多核苷酸互补 的核普酸序列。
9. 含有与编码SEQ IDNO: 2的多肽全部编码区的核苷酸序列具 有至少85%的同一性的核苷酸序列的分离多核苷酸；或与该分离多核 苦酸互补的核苷酸序列。
10. 含有与SEQ ID NO: 1的全长序列具有至少85 %的同 一性的 核苷酸序列的分离多核苷酸；或与该分离多核苷酸互补的核苷酸序 列。
11. 权利要求7-IO任一项的分离多核苷酸，其中与SEQIDNO: 1的同一性为至少95%。
12. 含有编码SEQ ID NO: 2的多肽的核苷酸序列的分离多核苷酸。
13. 含有SEQ ID NO: 1的多核苷酸的分离多核苷酸。
14. 含有编码SEQ ID NO: 2的多肽的核苷酸序列的分离多核苷 酸，它可通过在严紧杂交条件下，用具有SEQ ID NO: 1或其片段的 序列的标记探针筛选合适的文库获得。
15. 含有权利要求7-14任一项的分离多核苷酸的表达载体或重 组的活微生物。
16. 含有权利要求15的表达载体的宿主细胞或表达一种分离多 肽的该宿主细胞的膜，所述分离多肽含有与SEQ ID NO: 2的氨基酸 序列具有至少85%的同一性的氨基酸序列。
17. 生产含有与SEQ ID NO: 2的氨基酸序列具有至少85 %的同 一性的氨基酸序列的多肽的方法，包括在足以产生所述多肽的条件下 培养权利要求16的宿主细胞并从培养基中回收该多肽。
18. 表达权利要求7-14任一项的多核苷酸的方法，包括用含有 至少一种所述多核苷酸的表达载体转化宿主细胞，并在足以表达任何 一种所说多核苷酸的条件下培养所述宿主细胞。
19. 含有有效量的权利要求1至6任一项的多肽和可药用载体的 疫苗组合物。
20. 含有有效量的权利要求7至14任一项的多核苷酸和可药用 载体的疫苗组合物。
21. 权利要求19或20任一项的疫苗组合物，其中所述组合物至 少含有 一种另外的粘膜炎莫拉氏菌抗原。
22. 对权利要求1至6任一项的多肽或免疫性片段具有免疫特异 性的抗体。
23. 诊断莫拉氏菌感染的方法，包括鉴定在来自怀疑具有这种感 染的动物的生物样品中存在的权利要求1-6任一项的多肽、或对所述 多肽具有免疫特异性的抗体。
24. 含有免疫有效量的权利要求1-6任一项的多肽的组合物在制备用于在动物中产生免疫应答的药物中的用途。
25. 含有免疫有效量的权利要求7-14任一项的多核苷酸的组合物在制备用于在动物中产生免疫应答的药物中的用途。
26. 用于治疗患有粘膜炎莫拉氏菌疾病的人的治疗组合物，它包 括至少一种抗权利要求1-6的多肽的抗体以及合适的药用载体。
全文摘要
本发明涉及粘膜炎莫拉氏菌BASB111多肽和多核苷酸。本发明提供BASB111多肽和编码BASB111多肽的多核苷酸以及通过重组技术生产这种多肽的方法。本发明还提供诊断性、预防性和治疗性的应用。
文档编号C12N1/19GK101172998SQ20071018019
公开日2008年5月7日 申请日期2000年6月23日 优先权日1999年6月25日
发明者J·通纳德 申请人:史密丝克莱恩比彻姆生物有限公司