专利名称：产甘草皂苷的重组酵母菌的制作方法
产甘草皂苷的重组酵母菌发明领域本发明涉及产甘草皂苦重组酵母菌的技术领域，具体地，本发明涉及通过离子注入介导甘草总DNA在酵母菌中转化获得产甘草皂苷的重组酵母菌。
技术背景酵母菌与人类的关系源远流长，目前已建立了酵母菌的基因组数据库和蛋 白质组数据库。酵母菌作为单细胞低等生物，具有易培养、繁殖快、便于基因 操作、能对外源蛋白进行翻译后加工和修饰、不产生或很少有毒物质等特性， 已成为外源基因表达的合适宿主。甘草((7(>^>7^/2/2<3)是豆升牛(丄6《"柳/|705|0^)虫莱形花亚^牛(/>0/7///<3"/"〇7^wZ).), 属 多年生深根性草本植物，具有抗寒、耐热、抗盐碱等优良特性，适应性强，生 命力旺盛，根系发达，是荒漠、半荒漠地区保持水土、改良土壤、防风固沙的 重要药用植物，被国家列为重点药材。国内外学者对甘草的化学成分和药理作 用进行了许多研究，认为其主要有效成分是甘草酸和皂苷类化合物。甘草作为 国家重点保护的二级野生药材物种。保护甘草资源，合理开发利用，不仅对现 有脆弱的生态环境具有重要意义，而且对国民经济的可持续发展具有一定的促 进作用。甘草皂苷作为一类生物活性较强的成分，在医药、保健品、化妆品、 食品添加剂等方面具有广泛的应用价值，其市场需求日益强劲。开发出从甘草 渣中提取中提取皂苷类物质的研究，有利于资源的科学利用，对提高产品副加 值，农民增收等具有重要的意义。甘草皂苷是甘草地下部分最重要的五环三萜皂苷类生理活性物质之一，是 非常珍贵的天然解毒剂，有显著的促进肾上腺皮激素样作用，可用于人体抗衰 老、抗炎症、降压、增强机体免疫力，提高生理机能，改善高血脂症，维持水盐代谢平衡。国内外的最新研究证明高剂量的甘草皂苷可以完全阻止SARS 病毒的复制；甘草皂苷能促进艾滋病患者免疫力的恢复，诱导干扰素，抑制癌 细胞的生长；甘草皂苷的钾盐的甜度是蔗糖的500倍，目前主要作为无热量、 高强度的食品甜味剂，并赋予食品防病抗病功能。不仅如此，甘草皂苦还广泛 应用于烟草、化工、酿造、国防等行业。传统的皂苷提取方法有水浸法、酸碱浸提法、醇提法等，其利用简单的物 理方法提取甘草中的皂苷，效率低且易造成环境污染。而近来利用微波、超声 波辅助提取法、超临界C02萃提法等新型物理仪器提取皂苷的方法，因提取效 率较高而受到广泛关注，但由于在生产应用中存在一次性投资过大、操作烦瑣， 使其在工业应用中受到一定程度的制约。离子束介导转基因是20世纪90年代中国科学院离子束生物技术重点实验 室在研究注入离子与生物体相互作用的基础上，首先提出的一种新的转基因方 法。作为一种全新的转基因手段，离子注入介导转基因有其自身的特点首先， 不需要事先知道或克隆出目的DNA片段，其次可转移DNA大片段，适于多基 因或基因簇的转导；其次，转入的外源DNA是直接整合入宿主总DNA中，因 此具有较好的遗传稳定性。注入离子对细胞具有极强的刻蚀作用，致使细胞表 面形成可使外源DNA进入的通道，这一点与基因枪方法并无差异。注入离子对 细胞的刻蚀和溅射作用属于冷加工性质，不伤及邻近组织和细胞，比产生热效 应的激光束法具有明显的优势。同时由于注入正离子的积累，大大降低了细胞 表面的负电性，从而减少了细胞对溶液中带负电的外源DNA的静电斥力，有利 于外源基因的导入。加之通道局部区域也由于带正电，便于吸引带负电性的DNA 主动进入受体细胞。另一方面，目前离子注入在真空环境中进行，真空造成的 负压使细胞内部的部分水分蒸发，当干燥的细胞进入含有DNA的缓沖液中时， 由于吸胀作用加强，也增加了外源DNA进入通道的机会。此外，离子注入会对 受体细胞内染色体造成直接损伤(如断裂)和间接损伤(如自由基作用)，也增 加了外源DNA与受体细胞DNA重组和整合的机会。正是这些因素使得离子束介导DNA大分子的遗传转化具有较高的转化率。实现微生物发酵生产甘草皂苷的技术突破，将对中国干旱半干旱荒漠地区 生态环境的保护和民族制药业的发展产生深远的影响。 发明内容本发明通过对照现有技术，针对甘草皂苷的提取釆用微生物发酵获得未见报道，而通过离子注入介导甘草总DNA在酵母菌中转化获得有效的微生物菌种 发酵获得甘草皂苷也未见报道。本发明的目的是提供一种为获得甘草皂苷的重 组酵母菌株。本发明的技术方案本发明提供了重组酵母工程菌菌抹，通过离子注入介 导甘草总DNA在酵母菌中转化的方法获得的二林产甘草皂苷的重组酵母菌，其 分别为酿酒酵母(Sacc/zaramF^ cewv/v&e ) CGMCC 2182和热带假丝酵母 (Qw^Vforap/cafo) CGMCC 2180,这两种菌种通过传统的发酵工艺都可以 有效获得甘草皂苷。本发明技术方案中所述的两种菌种都为酵母菌属，具有常规酵母菌的一些 共同的技术特征，都通过传统的发酵技术有效获得甘草皂苷，是基于提取甘草 皂苷共同技术要求前提下实现。具体地，本发明采用已公开的技术，具体技术已经通过申报国家发明专利， 其申请号为，即通过改良的CTAB法大量提取野生乌拉尔甘草(G(yqyrW^za wra/e"w》并获得总DNA，通过在酵母中转化从而获得本发明产甘草皂苷的两抹 重组酵母菌。本发明技术方案所用酵母菌并不限于酵母属(&cc/7aram;;cM)、假丝酵母属 (Cam/Wa)和其他酵母属通过发酵可获得甘草急苦，本发明技术效果的再现，同 时在于，通过离子注入介导甘草总DNA在酵母菌中转化的技术方案的结合。具 体地，本发明优选为酿酒酵母(Sacc/^ramycw cerev/v/ae ) CGMCC. No.2182的 和热带假丝酵母(^ / /cafo ) CGMCC.No.2180。一方面，本发明提供了一种重组酵母菌抹的菌林，命名为1014，其主要次生代谢产物为甘草皂香。该菌抹已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址北京 市朝阳区大屯路，中国科学院^鼓生物研究所，邮编100101。保藏日期是2007 年9月19日，保藏号是CGMCC.No. 2182。根据受体菌的来源，经纟鼓生物学鉴 定，1014菌为酿酒酵母(S"cc/^rawyces cereWvz'"e ), 该菌抹的菌落呈乳白色, 中央隆起，边缘圆整；细胞卵形，大小2.5 10x4.5 21pm;斜面菌种培养温度 28 - 30°C ,培养时间24 h;液体摇瓶培养温度28 - 30°C ,转速200 - 220 r/m, 培养时间96 h。可采用如下方法对其进行保存釆用常规的斜面传代保存法， 此方法是将本发明菌种接种于只要适合于酵母菌生长的斜面培养基表面，常规 培养和保存即可。或是利用真空冷冻干燥法将本发明菌种制成干粉菌种，低温 或常温保藏即可。本发明进一步建立菌种保藏、复壮及选育的系统工艺流程技 术。另一方面，本发明提供了一种重组酵母菌林，命名为2053,其主要次生代 谢产物为甘草皂苷。该菌林已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏 单位中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址北京市北 京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101。保藏日期是2007 年9月19日，保藏号是CGMCC.No.2180。根据受体菌的来源，经微生物学鉴 定，2053菌为热带假丝酵母(Omcfe^ frop/cato),该菌抹的菌落呈乳白色， 中央隆起，边缘圓整；细胞卵形，大小4~8x5~llpm;斜面菌种培养温度30-32°C，培养时间24 h;液体摇瓶培养温度30 - 32°C ，转速200 - 220 r/m,培养 时间96 h。可采用上述保存1014菌的方法对其进行保存。通过实施本发明具体的技术指标，实现本发明内容，可以通过技术方案获 得的二林重组酵母菌，即酿酒酵母(& cc/zaram_ycw cgrev/v/ag ) CGMCC 2182和 热带假丝酵母(Cam&i" frop/cafc ) CGMCC 2180,通过传统的微生物发酵技术 手段有效获得甘草皂苷的有益效果。本领域所知，急苦类成分由于结构中一般没有共轭体系，而且皂苷为大极性化合物，通常需水或醇提取，水溶性杂质多，给其定量分析带来一定的困难。 本发明中，甘草渣中皂苷类物质的定性、定量测定可以运用本领域熟知的比色法(Co/or/zz7e"/)、分光光度法(6^ec"o/ 力W湖e"/)、薄层扫描法(7ZC5) 和高效液相色语(历m法。样品用曱醇提取，用以米反复脱脂，残渣干燥称 重，规定含总皂苷不少于6.0% ;单体皂苦可采用薄层扫描法和高效液相色谱 法。多数采用高效液相色镨法，检测方法有紫外检测器和ELSD检测器。样品 可用曱醇提取后直接进样分析，或先用三氯甲烷脱脂再用水饱和的正丁醇提取， 提取液蒸干，残渣曱醇溶解后进样分析，或曱醇提取，回收曱醇，残渣用水饱 和的正丁醇萃取，萃取液回收正丁醇，样品上D101大孔吸附树脂柱，水洗后 再用不同浓度的乙醇溶液洗脱，收集含急菩部分，回收乙醇，残渣用甲醇溶解 进样分析。
无具体实施方式
实施例一产甘草皂香的重组酿酒酵母菌采用改良的CTAB法大量提取野生乌拉尔甘草(G(vqFr/z/zfl Mra/e似/力的总 DNA。取细胞浓度为1.0 x 1(^CFU/mL的酿酒酵母菌体稀释液0.1mL均匀涂布于直 径90mm的无菌平皿中央，无菌风吹干制成菌膜，置于LCD1000型离子注入才几 小真空靶室的无菌靶台上进行Ar+注入。Ar+注入能量10KeV、剂量15 x 1015ions/cm2,真空度10"3pa。用2mL乌拉尔甘草总DNA的TE緩冲液浸泡离子注入后的酵母菌膜，28 。C温育2h后，洗脱至YEPD平板。其中，YEPD培养基的成分为(w/v):酵母膏1.0%、蛋白胨2.0%、葡萄糖 2.0%、琼月旨2.0%,其余为无菌水。将YEPD平板上生长的菌落接入斜面培养，再进行液体培养。收集培养液， 进行薄层色i普(TLC)检测。获得一抹编号为1014的重组酿酒酵母菌，其培养液中含有与甘草急苷标准样品相同Rf值的物质。重组酿酒酵母菌1014于2007年9月19日保藏在中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏号为2182。 实施例二产甘草皂苷的重组热带假丝酵母菌采用改良的CTAB法大量提取野生乌拉尔甘草(G^qy厅/n'zfl wra/em/力的总 DNA〇取细胞浓度为1.0 x 1(^CFU/mL的热带假丝酵母菌体稀释液0.1mL均匀涂布 于直径90mm的无菌平亚中央，无菌风吹干制成菌膜，置于LCD1000型离子注 入机小真空靶室的无菌靶台上进行Ar+注入。Ar+注入能量10KeV、剂量15 x 1015ions/cm2,真空度10.3pa。用2mL乌拉尔甘草总DNA的TE緩冲液浸泡离子注入后的酵母菌膜，28 。C温育2 h后，洗脱至YEPD平板。其中，YEPD培养基的成分为(w/v):酵母膏1.0%、蛋白胨2.0%、葡萄糖 2.0%、琼月旨2.0%，其余为无菌水。将YEPD平板上生长的菌落接入斜面培养，再进行液体培养。收集培养液， 进行薄层色语(TLC)检测。获得一抹编号为2053的重组热带假丝酵母菌，其 培养液中含有与甘草皂苷标准样品相同Rf值的物质。重组热带假丝酵母菌2053于2007年9月19日保藏在中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为2180。通过上述的实施例，更容易理解本发明。上述实施例只是举例性的描述， 而不应当被理解为用来限制本发明的范围。本发明所用酵母菌并不限于酵母属 (&cc/2aramyce"、假丝酵母属(Ca"At/a)和其他酵母属通过发酵可获得甘草皂苷， 同时在于，通过离子注入介导甘草总DNA在酵母菌中转化的技术方案的结合。 另外，在下述的说明中，如无特别说明，％皆指重量百分比。
权利要求
1、一种产甘草皂苷的重组酵母，其特征在于，所选用的重组酵母优选为酿酒酵母(Saccharomyces cereviviae)CGMCC.No.2182或热带假丝酵母(Candidatropicalis)CGMCC.No.2180。
全文摘要
本发明公开一种产甘草皂苷的重组酵母，通过离子注入介导甘草总DNA在酵母菌中转化的方法获得的二株产甘草皂苷的重组酵母菌，其分别为酿酒酵母(Saccharomyces cereviviae)CGMCC.No.2182和热带假丝酵母(Candidatropicalis)CGMCC.No.2180。实现重组酵母菌发酵生产甘草皂苷的技术突破，将对于干旱半干旱荒漠地区生态环境的保护和发展具有重要意义。
文档编号C12R1/865GK101230321SQ20071018002
公开日2008年7月30日 申请日期2007年11月9日 优先权日2007年11月9日
发明者凌海秋, 樊永红, 武宝山, 毛培宏, 湘 金 申请人:新疆大学