专利名称：产醌类化合物的重组酵母菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及产醌类化合物的微生物菌种技术领域，具体地，本发明涉及产醌类化 合物的重组酵母菌技术领域。
背景技术：
醌类化合物(quinonoids)是具有共轭体系的环己二烯二酮类化合物，主要有苯 醌、萘醌、菲醌和蒽醌四种类型，是一类重要的氧化还原物质，在生物体内起着抗其他生物 侵害的保护作用，有些醌类化合物还是重要的药物。游离醌类化合物一般具有升华性，极性较小，一般溶于乙醇、丙酮、乙醚等有机溶 剂。常用菲格尔(Feigl)反应、博恩特瑞格(Borntrager)反应进行显色反应。常用硅胶 薄层色谱进行色谱鉴定，展开剂多用混合溶剂，如苯-乙酸乙酯-乙酸(75 24 1)、甲 苯-甲酸甲酯-甲酸(5 4 1)，醌类化合物在日光下多显红色、黄色，在紫外光(UV)下 多显红色、黄棕色、橙色荧光，随其分子中酚羟基等助色团数量的增多而颜色加深。醌类化合物早期作为一种天然色素，曾用于染料工业，后来研究发现它们具有泻 下、抑菌、利尿、止血等多方面的生物活性。醌类物质chrysarobin具有较强的抗霉菌作用， 是治疗疥癣等皮肤病的有效药物。最近的研究证明，多数醌类化合物具有明显的抗肿瘤作 用，对小鼠黑色素瘤、艾氏腹水癌细胞、大鼠乳癌细胞、宫颈癌细胞等多种癌细胞具有明显 的抑制作用，其中醌类物质emodin可通过增强Bu25TK细胞核凝聚、膜联蛋白黏合及DNA断 裂而抑制癌细胞的DNA合成并诱导癌细胞凋亡，其途径为Caspase介导的线粒体途径，表现 在Caspase3、Caspase9的激活和多糖酶的断裂。离子束介导转基因是20世纪90年代中国科学院离子束生物技术重点实验室在研 究注入离子与生物体相互作用的基础上，首先提出的一种新的转基因方法。作为一种全新 的转基因手段，离子注入介导转基因有其自身的特点首先，不需要事先知道或克隆出目的 DNA片段，其次可转移DNA大片段，适于多基因或基因簇的转导；其次，转入的外源DNA是直 接整合入宿主总DNA中，因此具有较好的遗传稳定性。注入离子对细胞具有极强的刻蚀作 用，致使细胞表面形成可使外源DNA进入的通道，这一点与基因枪方法并无差异。注入离子 对细胞的刻蚀和溅射作用属于冷加工性质，不伤及邻近组织和细胞，比产生热效应的激光 束法具有明显的优势。同时由于注入正离子的积累，大大降低了细胞表面的负电性，从而减 少了细胞对溶液中带负电的外源DNA的静电斥力，有利于外源基因的导入。加之通道局部 区域也由于带正电，便于吸引带负电性的DNA主动进入受体细胞。另一方面，目前离子注入 在真空环境中进行，真空造成的负压使细胞内部的部分水分蒸发，当干燥的细胞进入含有 DNA的缓冲液中时，由于吸胀作用加强，也增加了外源DNA进入通道的机会。此外，离子注入 会对受体细胞内染色体造成直接损伤(如断裂)和间接损伤(如自由基作用)，也增加了外 源DNA与受体细胞DNA重组和整合的机会。正是这些因素使得离子束介导DNA大分子的遗 传转化具有较高的转化率。酵母菌与人类的关系源远流长，目前已建立了酵母菌的基因组数据库和蛋白质组数据库。酵母菌作为单细胞低等生物，具有易培养、繁殖快、便于基因操作、能对外源蛋白进 行翻译后加工和修饰、不产生或很少有毒物质等特性，已成为外源基因表达的合适宿主。甘草(Glycyrrhiza)是豆科(Leguminosae)蝶形花亚科(PapiliantaeTaub.)，属 多年生深根性草本植物，具有抗寒、耐热、抗盐碱等优良特性，适应性强，生命力旺盛，根系 发达，是荒漠、半荒漠地区保持水土、改良土壤、防风固沙的重要药用植物，被国家列为二级 野生药材物种。通过离子注入介导甘草基因组DNA在酵母菌中的转化，实现重组酵母菌发酵生产 醌类化合物的技术突破，将对我国民族制药业的发展产生深远的影响。
发明内容
本发明通过对照现有技术，针对重组酵母菌发酵生产醌类化合物未见报道，而通 过离子注入介导甘草基因组DNA在酵母菌中转化获得有效的微生物菌种发酵获得醌类化 合物也未见报道。本发明的目的是提供一种为获得醌类化合物的重组酵母菌株。本发明的技术方案本发明提供了重组酵母工程菌菌株，通过离子注入介导甘草 基因组DNA在酵母菌中转化的方法获得的二株产醌类化合物的重组酵母菌，其分别为酿 酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) CGMCC 3434 和异常汉逊酵母(Hansenula anomala) CGMCC 3435，这两种菌种通过传统的发酵工艺都可以有效获得醌类化合物。本发明技术方案中所述的两种菌种都为酵母菌，具有常规酵母菌的一些共同的技 术特征，都通过传统的发酵技术有效获得醌类化合物，是基于提取天然药物醌类化合物共 同技术要求前提下实现。具体地，本发明采用已公开的技术，具体技术已经通过申报国家发明专利，并获得 发明专利授权，其申请号为2006100114027，即通过改良的CTAB法大量提取野生乌拉尔甘 草(Glycyrrhiza uralensis)并获得总DNA，通过在酵母中转化从而获得本发明产醌类化 合物的两株重组酵母菌。本发明技术方案所用酵母菌并不限于酵母属(Saccharomyces)、汉逊酵母属 (Hansenula)和其他酵母属通过发酵可获得醌类化合物，本发明技术效果的再现，同时在 于，通过离子注入介导甘草基因组DNA在酵母菌中转化的技术方案的结合。具体地，本发明 优选为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) CGMCC. No. 3434和异常汉逊酵母(Hansenula anomala)CGMCC. No. 3435。一方面，本发明提供了一种重组酵母菌株的菌株，编号命名为5005，其主要次生 代谢产物为醌类化合物。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单 位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址北京市朝阳区北辰 西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。保藏日期是2009年11月9 日，保藏号是CGMCC. No. 3434。根据受体菌的来源，经微生物学鉴定，5005菌为酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)，该菌株的菌落呈颜色乳白色，中央隆起，边缘圆整；斜面菌 种培养温度28-30°C，培养时间24h ；液体摇瓶培养温度28-30°C，转速200_220r/m，培养时 间96h。可采用如下方法对其进行保存采用常规的斜面传代保存法，此方法是将本发明菌 种接种于只要适合于酵母菌生长的斜面培养基表面，常规培养和保存即可。或是利用真空 冷冻干燥法将本发明菌种制成干粉菌种，低温或常温保藏即可。本发明进一步建立菌种保
4藏、复壮及选育的系统工艺流程技术。另一方面，本发明提供了一种重组酵母菌株，编号命名为6076，其主要次生代谢产 物为醌类化合物。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址北京市朝阳区北辰西路1号院 3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。保藏日期是2009年11月9日，保藏号是 CGMCC.No. 3435。根据受体菌的来源，经微生物学鉴定，6076菌为异常汉逊酵母(Hansenula anomala)，该菌株的菌落呈乳白色，中央隆起，边缘圆整；斜面菌种培养温度30_32°C，培养 时间24h ；液体摇瓶培养温度30-32°C，转速200-220r/m，培养时间96h。可采用上述保存 5005菌的方法对其进行保存。通过实施本发明具体的技术指标，实现本发明内容，可以通过技术方案获得的二 株重组酵母菌，即酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC 3434和异常汉逊酵母 (Hansenula anomala) CGMCC 3435，通过传统的微生物发酵技术手段有效获得醌类化合物 的有益效果。
无
具体实施例方式实施例一产醌类化合物的重组酿酒酵母菌采用改良的CTAB法大量提取野生乌拉尔甘草(Glycyrrhiza uralensis)的基因 组 DNA。取细胞浓度为1.0X107CFU/mL的酿酒酵母菌体稀释液0. lmL均勻涂布于直径 90mm的无菌平皿中央，无菌风吹干制成菌膜，置于IXD1000型离子注入机小真空靶室的无 菌靶台上进行Ar+注入。Ar+注入能量lOKeV、剂量15X 1015ions/cm2，真空度10_3Pa。用2mL乌拉尔甘草基因组DNA的TE缓冲液浸泡离子注入后的酵母菌膜，28°C温育 2h后，洗脱至YEPD平板。其中，YEPD培养基的成分为(w/v)酵母膏1. 0%、蛋白胨2. 0%、葡萄糖2. 0%、琼 脂2.0%，其余为无菌水。将YEPD平板上生长的菌落接入斜面培养，再进行液体培养。收集培养液，进行薄 层色谱(TLC)检测。获得一株编号为5005的重组酿酒酵母菌，其培养液中含有红色的醌类 化合物，用甲苯-甲酸甲酯-甲酸(5 4 1)展开时，其Rf值为0.24。重组酿酒酵母菌5005于2009年11月9日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为3434。实施例二 产醌类化合物的重组异常汉逊酵母菌采用改良的CTAB法大量提取野生乌拉尔甘草(Glycyrrhiza uralensis)的基因 组 DNA。取细胞浓度为1. 0 X 107CFU/mL的异常汉逊酵母菌体稀释液0. lmL均勻涂布于直 径90mm的无菌平皿中央，无菌风吹干制成菌膜，置于IXD1000型离子注入机小真空靶室的 无菌靶台上进行Ar+注入。Ar+注入能量lOKeV、剂量15X 1015ions/cm2，真空度10_3Pa。用2mL乌拉尔甘草基因组DNA的TE缓冲液浸泡离子注入后的酵母菌膜，28°C温育 2h后，洗脱至YEPD平板。
其中，YEPD培养基的成分为(w/v)酵母膏1. 0%、蛋白胨2. 0%、葡萄糖2. 0%、琼 脂2.0%，其余为无菌水。将YEPD平板上生长的菌落接入斜面培养，再进行液体培养。收集培养液，进行薄 层色谱(TLC)检测。获得一株编号为6076的重组异常汉逊酵母菌，其培养液中含有红色的 醌类化合物，用甲苯-甲酸甲酯-甲酸(5 4 1)展开时，其Rf值为0.51。重组异常汉逊酵母菌6076于2009年11月9日保藏在中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为3435。实施例三重组酵母菌培养液中醌类化合物的薄层色谱(TLC)鉴定以甲苯-甲酸甲酯-甲酸(5 4 1)为展层剂，硅胶薄板层析，利用 醌类化合物在日光和紫外光下特异的绿色，确定醌类化合物的存在。酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae) CGMCC 3434 和异常汉逊酵母(Hansenula anomala) CGMCC 3435所产醌类化合物在日光下显红色，在紫外光(UV)下显红色荧光，前者的Rf值为0. 24， 后者的Rf值为0.51。实施例四重组酵母菌培养液中醌类化合物的气相色谱_质谱(GC-MC)鉴定利用PE Turbemass-Autosystem XL气相色谱-质谱(GC-MC)仪对收集和纯化的 重组酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) CGMCC 3434和重组异常汉逊酵母(Hansenula anomala) CGMCC 3435培养液中的醌类化合物进行检测，检测条件为GC-MC 仪柱型PE-5MS 30mX0. 25mmX0. 25 u ；程序升温70°C保持 lOmin ；4°C /min 升至 120°C，保持 5min ；5. 8°C /min 升至 250°C，保持 37min ；进样口温度280°C;分流比60 1 ；载气流速15psi;载气氦气(99.999% )；离子源200°C；传输线260°C；扫描范围30amu 550amu ；功率70ev ；电离方式EI ；光电倍增270V;进样量1.0iiL。重组酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) CGMCC 3434培养液中的醌类化 合物的保留时间(RT)为12.092min，与WILEY化合物库中的醌类化合物CAS1211-29-6 和CAS42536-97-0的相似性分别为70. 9 %和72. 1 %。重组异常汉逊酵母(Hansenula anomala) CGMCC 3435培养液中的醌类化合物的RT为21. 311min,与Nist化合物库中的醌 类化合物CAS1000192-59-3^P Nbs化合物库中的醌类化合物CAS111-70-6的相似性分别 为 69. 7%和 54. 6%。确定重组酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) CGMCC 3434 和重组 异常汉逊酵母(Hansenulaanomala)CGMCC 3435培养液中的醌类化合物均为新的醌类化合 物。
通过上述的实施例，更容易理解本发明。上述实施例只是举例性的描述，而不应当 被理解为用来限制本发明的范围。本发明所用酵母菌并不限于酵母菌属(Saccharomyces)、 汉逊酵母菌属(Hansenula)和其他酵母菌属通过发酵可获得醌类化合物，同时在于，通过 离子注入介导甘草基因组DNA在酵母菌中转化的技术方案的结合。另外，在上述的说明中， 如无特别说明，％皆指重量百分比。
权利要求
产醌类化合物的重组酵母，通过离子注入介导甘草基因组DNA在酵母菌中转化获得重组酵母发酵能够获得醌类化合物，其特征在于，所述的重组酵母菌分别为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC 3434和异常汉逊酵母(Hansenula anomala)CGMCC 3435，这两种菌种通过传统的发酵工艺都有效获得醌类化合物。
全文摘要
本发明公开一种产醌类化合物的重组酵母菌，通过离子注入介导甘草总DNA在酵母菌中转化的方法获得的二株产醌类化合物的重组酵母菌，其分别为酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC.No.3434和异常汉逊酵母菌(Hansenula anomala)CGMCC.No.3435。实现重组酵母菌发酵生产醌类化合物的技术突破，将对于天然产物的研发具有重要意义。
文档编号C12R1/865GK101851590SQ20101004551
公开日2010年10月6日 申请日期2010年1月15日 优先权日2010年1月15日
发明者吕杰, 樊永红, 毛培宏, 金湘 申请人:新疆大学