专利名称：一株用于生产γ-亚麻酸的酵母工程菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株用于生产Y-亚麻酸的酵母工程菌，属于基因工程领域，本发明 可用于通过酵母工程菌表达假狼紫草Δ6-脂肪酸脱氢酶基因，将底物亚油酸催化转变为高 价值Y-亚麻酸。
背景技术：
1917年，德国化学家在月见草(Oenothera biennis)中发现了一种其它植物体中 极为少见的脂肪酸一Y-亚麻酸，后称为维生素F。目前，Y-亚麻酸作为具有生理作用的 药物，已经广泛受到国内外医学界的重视，用于防治心血管疾病、糖尿病、降低胆固醇及抑 制溃疡、胃出血、妇女经前综合症等，另外，Y -亚麻酸在营养学及美容、化妆品方面也有应 用。Y-亚麻酸等多不饱和脂肪酸因在人类健康中具有重要作用而成为极具价值的产品，据 估计全球市场需求过万吨。研究表明，Y-亚麻酸仅存在于紫草科等的少数植物中，目前主 要商业来源为月见草、玻璃苣(Borago officinalis)和黑醋栗(Ribes Nigrum)，也有通过 真菌的发酵提取获得。然而，现在通过植物和真菌发酵生产Y-亚麻酸成本高且在质量和 产量上都不能满足日益增长的市场需求。1993年，Reddy等人首次从一株产Y -亚麻酸的蓝细菌(Synechocystis sp. PCC6803)中克隆到Δ6-脂肪酸脱氢酶基因，并在Δ6-脂肪酸脱氢酶缺陷的蓝细菌 (Anabaena sp. PCC7120)中获得了功能性表达，推动了 Δ6-脂肪酸脱氢酶遗传学水平的研 究。1997年，Olga V. Sayanova等首次从高等植物琉璃苣中克隆Δ6-脂肪酸脱氢酶基因， 通过转基因烟草验证该基因活性。2003年，Heather Μ. Whitney根据保守结构域细胞色素 沾结合结构域设计简并引物从毛茛科银莲花(Anemone leveillei)中克隆获得两个脱氢 酶基因ALl、AL2，其中ALl基因经酵母与拟南芥表达验证具有Δ6-脂肪酸脱氢酶活性，毛茛 科银莲花△6-脂肪酸脱氢酶基因是非紫草科高等植物中克隆获得的第一个△6-脂肪酸脱 氢酶基因。目前△ 6-脂肪酸脱氢酶基因在真菌细胞中的表达最常用的宿主是酿酒酵母，酿酒 酵母本身只能合成油酸，只有外源性添加亚油酸，转基因酵母细胞才能合成Y -亚麻酸，我 国南开大学微生物学系将高山被孢霉△ 6-脂肪酸脱氢酶转到毕赤酵母中获得表达，然而同 样的低油含量以及复杂组分使得进一步应用难以推广。通过微生物的基因工程生产Y-亚 麻酸仍有待于深入研究。通过利用基因工程方法生产Y-亚麻酸在理论和方法上已经初步 建立，为以后大规模生产奠定基础。
发明内容
本发明涉及一株用于生产Y-亚麻酸的酵母工程菌，属于基因工程领域，本发明 将紫草中克隆获得的Δ6-脂肪酸脱氢酶基因通过酶切连接构建到PYES2酵母表达载体，将 该表达载体用LiAc法转化酵母感受态细胞，通过酵母表达系统启动Δ6脂肪酸脱氢酶基因 的转录表达。本发明可用于将亚油酸转变合成高价值Y-亚麻酸。
本发明可以通过以下技术方案实现提取假狼紫草基因组DNA，用特异性引物PCR的方法扩增获得Δ6-脂肪酸脱氢酶 基因，将该基因用EcoRI和^CbaI作为酶切位点构建到PYES2酵母表达载体，制备酵母感受 态细胞，用LiAc法转化酵母感受态细胞，利用该载体系统可在酵母工程菌中表达Δ6-脂肪 酸脱氢酶，从而将亚油酸转变为高价值Y-亚麻酸。
图1为用于生产Y-亚麻酸的酵母表达载体的载体图，图中指出的为Δ6脂肪酸 脱氢酶基因的位置，通过T7启动子启动Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的表达。图加为γ -亚麻酸标准品气相色谱图；图2b为酵母转化空载体脂肪酸分析气相 色谱图；图2c为酵母转化△ 6-脂肪酸脱氢酶基因脂肪酸气相色谱分析图。
具体实施例方式紫草基因组DNA的提取(改进的CTAB法)(1)紫草叶片lOOmg，加入0. IgPVP及少许石英砂。加液氮研磨成粉末状，置于 1. 5ml离心管内；(2)向每个离心管内加入600 μ L预热的CTAB提取缓冲液，并轻轻混勻，65°C水浴 30min，其间不时摇动；(3)加入等体积的氯仿/异戊醇，轻缓颠倒离心管混勻，IOOOOrpm离心10-20min ；(4)将上清液转入新的离心管中，加入1/10体积的10% CTAB，混勻，加入等体积的 氯仿/异戊醇，颠倒离心管混勻，IOOOOrpm离心IOmin ；(5)取上清液，重复步骤4操作一次；(6)将上清液转入新的离心管中，加入1倍体积的1 X CTAB沉淀缓冲液，混勻，轻轻 摇晃至沉淀生成。如无明显沉淀生成，可适当延长放置时间；(7) IOOOOrpm离心lOmin，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗涤，室温晾干；(8)用TE缓冲液50μ L使沉淀充分溶解，加入2μ L RNaseA酶液，37 °C水浴30min ；(9)加入等体积的酚/氯仿抽提，室温放置lOmin，IOOOOrpm离心5min ；(10)取上清液，加入等体积的氯仿/异戊醇，颠倒混勻，室温放置lOmin，IOOOOrpm 离心5min ； (11)取上清液，加入1/10体积的3mol/L NaAc及2倍体积的无水乙醇，混 勻，-20°C放置Ih;(12) 40C，IOOOOrpm 离心 5min，去上清；(13)沉淀用70%乙醇洗涤，室温晾干；(14)用25 μ L TE溶解DNA，_20°C下保存备用。0. 7%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA 的纯度和完整性。NcD6D基因的PCR扩增引物正向引物5，ATGGCTACTGAAATCAAGAAG3，反向引物5，TTAACCATGAGTTTGAAGAGCTT3，。PCR 反应
权利要求
1.假狼紫草中克隆获得的Δ6脂肪酸脱氢酶基因，其核苷酸序列如SEQID Ν0:1所示。
2.一株用于生产Y-亚麻酸的酵母工程菌，将假狼紫草中克隆获得的Δ6脂肪酸脱氢 酶基因构建到PYES2酵母表达载体，转化酵母工程菌得到，可用于将亚油酸转变为高价值 Y-亚麻酸。
3.如权利要求2所述的酵母工程菌，其特征在于将假狼紫草中克隆获得的Δ6-脂肪 酸脱氢酶基因构建到PYES2酵母表达载体，转化酵母工程菌获得。
4.如权利要求2所述的酵母工程菌的使用，其特征在于权利要求2的酵母工程菌发 酵，催化反应产生Y-亚麻酸。
全文摘要
本发明涉及一株用于生产γ-亚麻酸的酵母工程菌，属于基因工程领域，本发明将紫草科植物假狼紫草中克隆获得的Δ6脂肪酸脱氢酶基因经测序鉴定后，通过酶切连接构建到PYES2酵母表达载体，将该表达载体用LiAc法转化酵母感受态细胞，通过酵母表达系统启动Δ6脂肪酸脱氢酶基因的转录表达。本发明可用于将亚油酸转变合成高价值γ-亚麻酸。
文档编号C12N1/19GK102134573SQ20101004552
公开日2011年7月27日 申请日期2010年1月22日 优先权日2010年1月22日
发明者李冠, 杜钰, 王贤磊, 田歆珍 申请人:新疆大学