一种羟氯喹亚麻酸酯治疗肿瘤的有效性体外评价方法
【专利摘要】本发明公开了羟氯喹亚麻酸酯治疗肿瘤的有效性体外评价方法，包括将羟氯喹亚麻酸酯作为实验组，设置9个浓度梯度，加入肿瘤细胞后在微量培养板上分别培养，培养结束后每孔加入20μl噻唑蓝，然后继续培养2h，弃其上层液体后加入150μl的二甲基亚砜，于摇床上振荡5min～10min；对照组安装相同的过程培养，培养完成后测量微量培养板每个孔的吸光度，并计算半抑制浓度。本发明公开的评价方法，可以获得药物对不同肿瘤细胞的半抑制浓度，判断不同剂量的羟氯喹亚麻酸酯对肿瘤细胞的抑制效果，对其有效性进行准确的评价。
【专利说明】一种羟氯喹亚麻酸酯治疗肿瘤的有效性体外评价方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及药物有效性的评价方法，具体涉及到一种羟氯喹亚麻酸酯治疗肿瘤的有效性体外评价方法。
【背景技术】
[0002]药物的安全性和有效性是药品的基本特征。药品有效性是药物的重要特性，药物对治疗某种疾病的有效，是药品存在的重要依据，药品的有效性是药物存在和应用的重要保证。
[0003]肿瘤是机体在各种致癌因素作用下，局部组织的某一个细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致其克隆性异常增生而形成的异常病变。羟氯喹亚麻酸酯是综合应用肿瘤靶向前体药物设计原理和结构拼接原理的基础，设计合成前体药物连接α亚麻酸和羟氯喹的新化合物，具有非常广阔的抗肿瘤前景，对于新药的应用，需要对其有效性进行评价。
[0004]为了解决现有技术中的上述不足，本发明提出了一种新的解决方案。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种羟氯喹亚麻酸酯治疗肿瘤的有效性体外评价方法。
[0006]为达上述目的，本发明所采用的技术方案是:提供一种羟氯喹亚麻酸酯治疗肿瘤的有效性体外评价方法，包括:取羟氯喹亚麻酸酯溶液作为实验组，设置9个稀释度，稀释倍数为2倍，最大剂量为20mmol/L ;不同稀释度的溶液均设置三组，加入肿瘤细胞后在微量培养板上分别培养24h、48h和72h，培养温度为36°C?38°C，二氧化碳浓度为5% ;培养结束后每孔加入20ul噻唑蓝，然后继续培养2h，弃其上层液体后加入150ul的二甲基亚砜，于摇床上振荡5mirTl0min ;其中，微量培养板每孔中加入10ul的肿瘤细胞液，肿瘤细胞液的细胞浓度为2000个/ml?3000个/ml ；
取与羟氯喹亚麻酸酯组相同的肿瘤细胞作为对照组，置于微量培养板上分别培养24h、48h和72h ;培养温度为36°C?38°C，二氧化碳浓度为5% ;培养结束后每孔加入20ul噻唑蓝，然后继续培养2h,弃其上层液体后加入150ul的二甲基亚砜,于摇床上振荡5mirTl0min ;每孔加入10ul的肿瘤细胞液，肿瘤细胞液的细胞浓度为2000个/ml?3000个/ml ；
测量微量培养板每个孔中的液体吸光度，得到细胞活性抑制率和半抑制浓度；其中细胞活性抑制率为对照组吸光度与实验组吸光度之差与实验组吸光度的比值。
[0007]综上所述，本发明具有以下优点:
本发明公开的评价方法，可以获得药物对不同肿瘤细胞的半抑制浓度，判断不同剂量的羟氯喹亚麻酸酯对肿瘤细胞的抑制效果，对其有效性进行准确的评价。
【具体实施方式】
[0008]实验材料: 噻唑蓝，购买于美国Amresco公司；
DMEM培养基，购买于Gibco公司；
二甲基亚砜，购买于成都市科龙化工试剂厂；
脑胶质瘤细胞U87、人肺癌细胞系A549、人结直肠癌细胞系HCT116、人乳腺癌细胞系MCF-7、人肝癌细胞系HEPG2均购买于中科院上海细胞生物所。
[0009]实施例1:药物对脑胶质瘤细胞U87的有效性评价实验实验过程:
取羟氯喹亚麻酸酯溶液，设置9个稀释度，稀释倍数为2倍，最大剂量为20mmol/L。不同稀释度的溶液均设置有相同的三组，加入肿瘤细胞后在微量培养板上分别培养。微量培养板每孔中加入10ul的肿瘤细胞液，肿瘤细胞液的细胞浓度为2000个/ml?3000个/ml。
[0010]每组溶液浓度相对应，均含有9个不同浓度梯度的溶液，其中一组培养24h，一组培养48h, —组培养72h。加入药物的肿瘤细胞在培养板上的培养温度为37°C, 二氧化碳浓度为5%。培养结束后每孔加入20ul噻唑蓝，然后继续培养2h，弃其上层液体后加入150ul的二甲基亚砜，于摇床上振荡5min?lOmin。
[0011]取脑胶质瘤细胞U87作为对照组，置于微量培养板上分别培养24h、48h和72h，肿瘤细胞液的细胞浓度为2000个/ml?3000个/ml，微量培养板上进行培养的培养基为DMEM培养基，该培养基中含有10%的灭活胎牛血清。微量培养板上的细胞培养温度为37°C，二氧化碳浓度为5% ;培养结束后每孔加入20ul噻唑蓝，然后继续培养2h，弃其上层液体后加入150ul的二甲基亚砜,于摇床上振荡5mirTl0min ;每孔加入10ul的肿瘤细胞液。
[0012]测量加入药物和肿瘤细胞的微量培养板和只加入肿瘤细胞的微量培养板中每个孔的液体吸光度，通过吸光度计算细胞活性抑制率。细胞活性抑制率为对照组吸光度与实验组吸光度之差与实验组吸光度的比值，并按照寇式改良法得到半抑制浓度。
[0013]实施例2:药物对人肝癌细胞系HEPG2的有效性评价实验实验过程:
取羟氯喹亚麻酸酯溶液，设置9个稀释度，稀释倍数为2倍，最大剂量为20mmol/L。不同稀释度的溶液均设置有相同的三组，加入人肝癌细胞系HEPG2后在微量培养板上分别培养。微量培养板每孔中加入10ul的肿瘤细胞液，肿瘤细胞液的细胞浓度为2000个/ml?3000 个/ml。
[0014]每组溶液浓度相对应，均含有9个不同浓度梯度的溶液，其中一组培养24h，一组培养48h, —组培养72h。加入药物的肿瘤细胞在培养板上的培养温度为38°C, 二氧化碳浓度为5%。培养结束后每孔加入20ul噻唑蓝，然后继续培养2h，弃其上层液体后加入150ul的二甲基亚砜，于摇床上振荡5min?lOmin。
[0015]取人肝癌细胞系HEPG2作为对照组，置于微量培养板上分别培养24h、48h和72h，肿瘤细胞液的细胞浓度为2000个/ml?3000个/ml，微量培养板上进行培养的培养基为DMEM培养基，该培养基中含有10%的灭活胎牛血清。微量培养板上的细胞培养温度为37°C，二氧化碳浓度为5% ;培养结束后每孔加入20ul噻唑蓝，然后继续培养2h，弃其上层液体后加入150ul的二甲基亚砜,于摇床上振荡5mirTl0min ;每孔加入10ul的肿瘤细胞液。
[0016]测量加入药物和肿瘤细胞的微量培养板和只加入肿瘤细胞的微量培养板中每个孔的液体吸光度，通过吸光度计算细胞活性抑制率。细胞活性抑制率为对照组吸光度与实验组吸光度之差与实验组吸光度的比值，并得到半抑制浓度。
[0017]实施例3:药物对人肺癌细胞系A549的有效性评价实验实验过程:
取羟氯喹亚麻酸酯溶液，设置9个稀释度，稀释倍数为2倍，最大剂量为20mmol/L。不同稀释度的溶液均设置有相同的三组，加入肿瘤细胞后在微量培养板上分别培养。微量培养板每孔中加入10ul的肿瘤细胞液，肿瘤细胞液的细胞浓度为2000个/ml?3000个/ml。
[0018]每组溶液浓度相对应，均含有9个不同浓度梯度的溶液，其中一组培养24h，一组培养48h，一组培养72h。加入药物的人肺癌细胞系A549在培养板上的培养温度为37°C，二氧化碳浓度为5%。培养结束后每孔加入20ul噻唑蓝，然后继续培养2h，弃其上层液体后加入150ul的二甲基亚砜，于摇床上振荡5min?lOmin。
[0019]取人肺癌细胞系A549作为对照组，置于微量培养板上分别培养24h、48h和72h，肿瘤细胞液的细胞浓度为2000个/ml?3000个/ml，微量培养板上进行培养的培养基为DMEM培养基，该培养基中含有10%的灭活胎牛血清。微量培养板上的细胞培养温度为37°C，二氧化碳浓度为5% ;培养结束后每孔加入20ul噻唑蓝，然后继续培养2h，弃其上层液体后加入150ul的二甲基亚砜,于摇床上振荡5mirTl0min ;每孔加入10ul的肿瘤细胞液。
[0020]测量加入药物和肿瘤细胞的微量培养板和只加入肿瘤细胞的微量培养板中每个孔的液体吸光度，通过吸光度计算细胞活性抑制率。细胞活性抑制率为对照组吸光度与实验组吸光度之差与实验组吸光度的比值，并得到半抑制浓度。
[0021 ] 实施例4:药物对人乳腺癌细胞系MCF-7的有效性评价实验实验过程:
取羟氯喹亚麻酸酯溶液，设置9个稀释度，稀释倍数为2倍，最大剂量为20mmol/L。不同稀释度的溶液均设置有相同的三组，加入肿瘤细胞后在微量培养板上分别培养。微量培养板每孔中加入10ul的人乳腺癌细胞系MCF-7肿瘤细胞液，肿瘤细胞液的细胞浓度为2000个 /ml ?3000 个 /ml。
[0022]每组溶液浓度相对应，均含有9个不同浓度梯度的溶液，其中一组培养24h，一组培养48h，一组培养72h。加入药物的人乳腺癌细胞系MCF-7肿瘤细胞在培养板上的培养温度为37°C，二氧化碳浓度为5%。培养结束后每孔加入20ul噻唑蓝，然后继续培养2h，弃其上层液体后加入150ul的二甲基亚砜,于摇床上振荡5min?lOmin。
[0023]取人乳腺癌细胞系MCF-7作为对照组，置于微量培养板上分别培养24h、48h和72h，肿瘤细胞液的细胞浓度为2000个/ml?3000个/ml，微量培养板上进行培养的培养基为DMEM培养基，该培养基中含有10%的灭活胎牛血清。微量培养板上的细胞培养温度为370C，二氧化碳浓度为5% ;培养结束后每孔加入20ul噻唑蓝，然后继续培养2h，弃其上层液体后加入150ul的二甲基亚砜,于摇床上振荡5mirTl0min ;每孔加入10ul的肿瘤细胞液。
[0024]测量加入药物和肿瘤细胞的微量培养板和只加入肿瘤细胞的微量培养板中每个孔的液体吸光度，通过吸光度计算细胞活性抑制率。细胞活性抑制率为对照组吸光度与实验组吸光度之差与实验组吸光度的比值，并得到半抑制浓度。
[0025]实施例5:药物对人结直肠癌细胞系HCTl 16的有效性评价实验实验过程:
取羟氯喹亚麻酸酯溶液，设置9个稀释度，稀释倍数为2倍，最大剂量为20mmol/L。不同稀释度的溶液均设置有相同的三组，加入肿瘤细胞后在微量培养板上分别培养。微量培养板每孔中加入10ul的人结直肠癌细胞系HCTl 16肿瘤细胞液，肿瘤细胞液的细胞浓度为2000 个/ml ~3000 个/ml。
[0026]每组溶液浓度相对应，均含有9个不同浓度梯度的溶液，其中一组培养24h，一组培养48h，一组培养72h。加入药物的人结直肠癌细胞系HCTl 16肿瘤细胞在培养板上的培养温度为37°C，二氧化碳浓度为5%。培养结束后每孔加入20ul噻唑蓝，然后继续培养2h，弃其上层液体后加入150ul的二甲基亚砜,于摇床上振荡5mirTl0min。
[0027]取人结直肠癌细胞系HCTl 16作为对照组,置于微量培养板上分别培养24h、48h和72h，肿瘤细胞液的细胞浓度为2000个/ml~3000个/ml，微量培养板上进行培养的培养基为DMEM培养基，该培养基中含有10%的灭活胎牛血清。微量培养板上的细胞培养温度为370C，二氧化碳浓度为5% ;培养结束后每孔加入20ul噻唑蓝，然后继续培养2h，弃其上层液体后加入150ul的二甲基亚砜,于摇床上振荡5mirTl0min ;每孔加入10ul的肿瘤细胞液。
[0028]测量加入药物和肿瘤细胞的微量培养板和只加入肿瘤细胞的微量培养板中每个孔的液体吸光度，通过吸光度计算细胞活性抑制率。细胞活性抑制率为对照组吸光度与实验组吸光度之差与实验组吸光度的比值，并得到半抑制浓度。
[0029]实验结果:
表1:不同培养时间羟氯喹亚麻酸酯对不同肿瘤细胞的半抑制浓度
【权利要求】
1.一种羟氯喹亚麻酸酯治疗肿瘤的有效性体外评价方法，包括: 取羟氯喹亚麻酸酯溶液作为实验组，设置9个稀释度，稀释倍数为2倍，最大剂量为20mmol/L ;不同稀释度的溶液均设置三组，加入肿瘤细胞后在微量培养板上分别培养24h、48h和72h，培养温度为36°C?38°C，二氧化碳浓度为5% ;培养结束后每孔加入20ul噻唑蓝，然后继续培养2h，弃其上层液体后加入150ul的二甲基亚砜，于摇床上振荡5mirTl0min ；其中，微量培养板每孔中加入10ul的肿瘤细胞液，肿瘤细胞液的细胞浓度为2000个/ml?3000 个 /ml ； 取与羟氯喹亚麻酸酯组相同的肿瘤细胞作为对照组，置于微量培养板上分别培养24h、48h和72h ;培养温度为36°C?38°C，二氧化碳浓度为5% ;培养结束后每孔加入20ul噻唑蓝，然后继续培养2h,弃其上层液体后加入150ul的二甲基亚砜,于摇床上振荡5mirTl0min ;每孔加入10ul的肿瘤细胞液，肿瘤细胞液的细胞浓度为2000个/ml?3000个/ml ； 测量微量培养板每个孔中的液体吸光度，得到细胞活性抑制率和半抑制浓度；其中细胞活性抑制率为对照组吸光度与实验组吸光度之差与实验组吸光度的比值。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于:微量培养板上进行培养的培养基为DMEM培养基，该培养基中含有10%的灭活胎牛血清。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于:所述肿瘤细胞为人脑胶质瘤细胞、人肺癌细胞、人结直肠癌细胞、人乳腺癌细胞或者人肝癌细胞。
【文档编号】G01N21/31GK104165850SQ201410395181
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年8月13日 优先权日:2014年8月13日
【发明者】肖洪涛, 廖治, 田鲲, 童荣生, 串俊兰, 张丽娟, 喻冬柯, 张远, 边原 申请人:四川省人民医院