专利名称：新疆哈密瓜aflp指纹图谱的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新疆哈密瓜AFLP指纹图谱，可用于哈密瓜种质的鉴定、品种鉴别 与保护。
背景技术：
广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。狭义的分子标记仅 是指DNA标记，是DNA水平上遗传多态性的直接反映，一般所称的分子标记概念即被界定在 这个范畴之内。生物在长期进化过程中产生的可遗传变异，都是由于DNA碱基序列变异所 致。同一物种内存在极为丰富的DNA碱基序列变异，为开发和利用分子标记奠定了坚实基 石出。DNA分子标记是指生物基因组DNA经限制性内切酶酶切、聚合酶链式反应(PCR)扩 增或两者结合等措施处理后电泳，检测到的反映基因组某种变异特征的特异性DNA片段。AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism)即扩增片段长度多态性,是一 种基于RFLP和PCR基础上发明的DNA指纹技术。它具有快速、灵敏、稳定、多态性丰富等特 点，所以被认为是一种十分理想、有效、先进的分子标记。由于AFLP可以为任何来源和复杂程度的DNA提供有力的DNA指纹，所以是用来评 估遗传多样性的理想标记，可以确定亲本之间的遗传差异和亲缘关系，从而确定亲本间的 遗传距离，并进而划分杂交优势，提高杂种优势潜力。Cervera等仅用了 2个AFLP引物组合就揭示了在西班牙收集的67个不同的葡萄 样品之间的遗传相似性。Greef等用6个AFLP引物组合得到的200个多态位点，分析了欧 洲芒属植物的遗传多态性，并据此分析推测了杂种的形成。遗传多样性及亲缘关系分析的 结果将有利于更好地利用这些丰富的育种资源。DNA指纹能同时在许多位点上提供可靠的遗传标记，与其它方法相比，具有高度个 体特异性和稳定可靠性，大大提高了遗传分析的效率。AFLP技术既可以用于检测品种的质 量和纯度，也可运用于稀有珍贵植物资源和名、特、优品种的鉴定、引种以及濒危植物的考 察和保护工作。高质量指纹图谱可作为新品种登记、注册和产权保护的重要依据。AFLP检 测的位点数多，保证了其鉴定的高度准确性，因而被公认为园艺作物建立指纹图谱效率最 高的标记。Che等用4个AFLP引物组合得到15条谱带的指纹图谱可区分30份西瓜种质，并 将西瓜种质PU96341的特异片段转化为SCAR标记。Aranzana等对210个桃品种作AFLP 分析，47个AFLP标记可区分196个品种，利用3对AFLP引物组合可区分187个桃品种。房 经贵等采用AFLP技术，利用16对引物构建了 2个芒果育种亲本的指纹图谱，获得了 2个品 种间分子水平上的多态性信息。鲁凤娟建立了梨树44个品种的AFLP指纹图谱。此外，AFLP 技术还被应用到葡萄、香蕉、大豆、小麦等多种作物的指纹图谱。
发明内容
本发明的目的在于发明一种基于AFLP分子标记技术的哈密瓜指纹图谱，将其用 于哈密瓜种质的鉴定、品种鉴别与保护。将不同哈密瓜采集叶片，提取基因组DNA，经过酶 切、连接、预扩增、选择扩增，PAGE电泳，得到高低不同的大量DNA条带，具有相同DNA条带 的哈密瓜被认为是拥有同样的遗传位点，具有不同大小的DNA条带的哈密瓜被认为拥有不 同的遗传位点，据此建立不同哈密瓜种质的指纹图谱，用于不同哈密瓜种质的鉴定、品种鉴 别与保护种质保护。本发明的优点在直接对哈密瓜基因组DNA进行检测，不受田间环境等因 素对甜瓜表型的影响，另外使用该方法可在幼苗期对幼苗进行检测鉴定，大大缩短检测周期。
该图为不同新疆甜瓜材料AFLP指纹图，每一泳道为一个甜瓜材料，分别为
1、黄花皮白肉
2、米籽黄旦子
3、小青皮
4、卡拉其千里
5、八一香
6、巴登
7、伯克扎德
8、一包糖
9、米籽瓜
10、俄罗斯可洪
11、纳西甘
12、新密7号
13、巴吾喜克
14、且介可洪
15、皮极甘
16、塔石可洪
17、桔可口奇
具有相同DNA条带的哈密瓜被认为是拥有同样的遗传位点，具有不同大小的DNA
条带的哈密瓜被认为拥有不同的遗传位点，据此将不同的哈密瓜品种区分开，可用于新疆 哈密品种保护与品种鉴别。
具体实施例方式新疆甜瓜基因组DNA的提取(1)取250mg左右新鲜甜瓜叶片于液氮中(加4% PVP)研磨成粉，转至IOml无菌 离心管中，加入3ml预热的2XCTAB缓冲液(临用时加2% β-巯基乙醇)上下颠倒混勻， 65°C水浴lh，期间轻轻摇勻数次；(2)取出离心管冷至室温，加入等体积的氯仿/异戊醇04 1)，轻缓颠倒混勻， 静置IOmin ；
(3)室温下 12000r/min 离心 IOmin ；(4)将上清转入另一离心管中，加入1/10体积的CTAB/NaCl和等体积氯仿/异戊 醇(24 1)，颠倒混勻，12000r/min 离心 IOmin ；(5)将上清转入另一离心管中，加入1/2体积5mol/L NaCl混勻，再加入等体积预 冷的异丙醇，颠倒混勻，室温下静置15min ；(6) 12000r/min 离心 lOmin，弃上清；(7) 70%乙醇洗涤沉淀2次，将沉淀转移至1. 5ml EP管，4000r/min离心2min，弃
尽上清，室温下微干；(8)将沉淀溶于含Rnase A(10mg/ml)的100 μ 1 TE缓冲液中37°C水浴Ih ；(9)取出离心管，加入400 μ 1 TE缓冲液，然后加1/10体积CTAB/NaCl和等体积的 酚/氯仿/异戊醇05 24 1)，颠倒混勻，放置IOmin ；(10) 40C，13000r/min 离心 IOmin ；(11)取上清于另一 Ep管，加入等体积的氯仿/异戊醇04 1)，颠倒混勻，放置 IOmin ；(12)4°C，12000r/min 离 IOmin ；(13)取上清于另一 EP管，加入1/10体积3mol/L NaAc (PH5. 2)和2倍体积无水乙 醇，颠倒混勻，-20°C静置Ih(时间尽量延长，可过夜)；(14) 13000r/min 离心 lOmin，弃上清；(15)用70%乙醇洗涤沉淀2次，4000r/min离心2min，弃尽上清，室温干燥；(16)将沉淀溶于50 μ 1双蒸水中，-20°C保存。测定DNA浓度利用紫外分光光度计测定双链DNA OD260 = 1. O时溶液浓度为50ug/ μ 1，那么DNA 样品浓度(ng/μ ) =OD26tlXN(样品稀释倍数)X50。取少量提取的DNA稀释后，0. 8%琼 脂糖凝胶电泳，DL2000为对照，可根据条带的亮度与Marker相比，以Marker的浓度来估计 所提DNA的浓度。AFLP反应体系的建立和优化样品DNA的完全酶切用EcoR I-Mse I 2种限制性内切酶各3U对300ng DNA进行酶切，设ai、3h、4h、 证、^!共5个处理，以确定适宜的酶切时间。取0. aiil Ep管，加入下述溶液，总反应体积为 40 μ 1，混勻后37°C水浴。样品DNA300ngNEB Buffer 2 (10 Χ) 2μ 1BSA(10mg/ml)0. 4 μ 1EcoR I (20U/ μ 1)0· 15 μ 1Mse I(10U/y 1)0. 3 μ 1补ddH20 至 40 μ 1反应结束后70°C处理15min，使酶失活，然后立即冰浴。0. 8%琼脂糖凝胶电泳检 测酶切是否完全。完全酶切样品与接头的连接
用于AFLP分析的接头序列 EcoR I adapter :5’ -CTCGTAGACTGCGTACC CATCTGACGCATGGTTAA-5 Mse I adapter :5’ -GACGATGAGTCCTGAG TACTCAGGACTCAT-5 接头的制备EcoR I adapter (5uM, 60 μ 1)EcoR I adapter 1 (1 μ g/μ 1)EcoR I adapter 2(1 μ g/μ 1)NEB Buffer2 (IOX)
1. 7μ 1 1. 5μ 1 3 μ 1 ddH20
53. 8μ 1Mse I adapter (50uM, 60 μ 1)Mse I adapter 1 (1 μ g/μ 1)Mse I adapter 2(1 μ g/μ 1)NEBBuffer 2 (IOX)
16 μ 1 14 μ 1 3 μ 1 27 μ 1 ddH20将上述成分分别混合，95°C 5min，缓慢降至室温即得EcoR I adapter和Mse I adapter,在完全酶切产物(40 μ 1)中加入10 μ 1下述反应液，总体积50 μ 1，混勻后，16°C过 夜。连接产物经ddH20稀释后作为下面预扩增的模板。EcoR I adapter (5pmol/μ 1) 1 μ 1Mse I adapter (50pmol/μ 1) 1 μ 1T4 Ligase Buffer(IOX)1 μ 1Τ4 DNA Ligase (350U/μ 1)0. 5 μ 1ddH206. 5 μ 1连接产物的预扩增预扩增引物序列E00 即 E+1 primer :5，-GACTGCGTACCAATTC+AM。。即 M+1 primer :5，-GATGAGTCCTGAGTAA+C对连接后的产物设3个稀释倍数进行预扩增，即连接产物稀释5倍、10倍和20 倍。预扩增后经琼脂糖凝胶电泳检测结果，确定适宜的连接产物稀释倍数。将连接产物用 ddH20稀释一定倍数后取5 μ 1作为预扩增的模板，向其中加入15 μ 1如下混合液，反应总体 积 20 μ 1。PCR Buffer(IOX)2μ 1dNTP Mixture (各 2. 5mM) 0. 5 μ 1E00 (50ng/y 1)0. 6 μ 1M00 (50ng/y 1)0. 6 μ 1Taq 酶(5υ/μ1)0. 3 μ 1ddH2011 μ 1
预扩增PCR反应程序如下
Step 194 0C 2min
Step 294 °C 30s
Step 356 °C30s
Step 472 °CImin
Step 5Goto Step 230Cycles
Step 672 °C7min
Step 74 °COO
PCR反应结束后，取6 μ 1预扩增产物，1 %琼脂PCR Buffer(IOX)2μ 1
dNTP Mixture (各 2. 5mM) 0. 5 μ 1
E+3 primer(50ng/μ 1)0. 8 μ1
M+3 primer(50ng/μ 1)0. 8 μ1
Taq 酶(5U//μ 1)0. 3μ 1
(MH2O10. 6μ 1
选择性扩增PCR反应程序如下
Step 194 °C2min
Step 294 °C30s
Step 365 °C (--rc/Cycles)30s
Step 472 °CImin
Step 5Goto Step2IOCycles
Step 694 °C30s
Step 756 °C30s
Step 872 °CImin
Step 9Goto Step624Cycles
Step 1072 °C7min
Step 114 °COO
PCR反应结束后，取6 μ1预扩增产物，1.5% 酰胺凝胶电泳检测选择性扩增效果。变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(1)胶板的准备用去污剂和清水将玻璃板洗涤干净，并用蒸馏水冲洗，最后用95%乙醇擦拭、干燥。将Iml R印el-Silane (剥离硅烷)均勻涂抹于长方形玻璃板整个表 面，室温干燥5min，用95%乙醇擦去多余的R印el-Silane。加8μ1 Bind-Silane (亲和硅 烷)于1. 5ml含8μ 1醋酸的95%乙醇中，充分混合后均勻涂抹于凹形玻璃板整个表面，室 温干燥5min，用95%乙醇擦去多余的Bind-Silane。取0. 4mm的边条，置于左右两侧，将凹 形板压于长方形板上，用夹子固定住两侧，试一下鲨鱼齿是否可顺利插入；以IX TBE配制 琼脂糖凝胶，吸入玻璃板底部，冷却20min后用胶带密封；将玻璃板近水平倾斜放置，准 备灌胶。(2)制胶配制50ml 6 %的变性聚丙烯酰胺凝胶，40 %丙烯酰胺7. 5ml，尿素 21g/32. 5ml (加热溶解)，5XTBE 10ml，摇晃均勻后加入10%过硫酸铵225 μ 1，混勻后加 50 μ 1 TEMED，混勻后立即灌胶。(3)灌胶将配好的胶液沿玻璃板缓慢倒入胶板间的空隙，注意不要在胶中留有 气泡。倒满胶后，水平放置胶板将鲨鱼齿的平端插入胶液下5mm左右处，于室温下静置Ih 使胶完全聚合。(4)预电泳胶聚合以后，撕去胶布，轻轻拔出梳子，用蒸馏水冲洗胶面，洗去碎 胶。反转梳子，将鲨鱼齿插入凝胶胶面下约0.5mm，梳齿间即样品槽。将胶板固定在电泳槽 上，上槽中加入0. 5 X TBE至没过胶面，下槽中加入IX TBE。U = 2000V，预电泳30min，以去 除气泡。(5)点样把DNA样品与上样缓冲液(8 3)混合，95°C变性8min，立即置于冰上 冷却待用，每个加样孔加5 7 μ 1样品DNA。(6)电泳U = 2000V,溴酚蓝至胶的四分之三处时(一般约1. 5 2h)，终止电泳。 放掉电泳液，取下胶板，将两块板轻轻分开，胶留在亲水化的方形玻璃板上。银染(1)固定(脱色)在托盘1中加入IL固定/终止液，将有胶的玻璃板胶面向上放 入托盘中，轻摇30min直到胶全部脱色；也可将胶在溶液中浸泡过夜(不摇动)。将溶液回 收待用。(2)洗胶在托盘2中用IL双蒸水洗凝胶3次，每次aiiin。将胶板取出时，竖直滴 干水10 20s (此期间配制染色液)。(3)染色在托盘3内加入IL染色液，将胶板放入托盘中轻摇30min。(此期间配 制显色液)(4)洗胶。从染色液中取出胶板，双蒸水冲洗数秒，浙干水，立即将胶置于预冷的显 色液中。注意，从用水冲洗胶板到将其放入显色液中，时间不超过5 10s。(5)显影轻摇显色液，直至胶上所有的条带都出现。(6)定影(终止显色)将回收的固定/终止液倒入显色液中，摇晃2 ;3min。(7)洗胶将胶板用双蒸水洗2次，每次aiiin。(8)干胶室温下自然干燥，在浅色背景下即可进行观察拍照。结果记录高低不同的大量DNA条带，具有相同DNA条带的哈密瓜被认为是拥有同样的遗传 位点，具有不同大小的DNA条带的哈密瓜被认为拥有不同的遗传位点，据此建立不同哈密 瓜种质的指纹图谱，用于鉴定不同的哈密瓜品种及其遗传关系，用于辅助甜瓜育种与种质保护。
权利要求
1.一种新疆哈密瓜AFLP指纹图谱，可用于哈密瓜种质的鉴定、品种鉴别与保护。
2.如权利要求1所述的哈密瓜AFLP指纹图谱，其特征在于用选择性引物ME与E9对 提取的哈密瓜DNA进行AFLP扩增、电泳，得到多条清晰的多态条带，可将不同哈密瓜材料加 以区别。
3.如权利要求1所述的指纹图谱的使用，其特征在于用AFLP反应引物ME与E9，对未 知甜瓜材料的基因组DNA进行AFLP扩增、电泳，将得到的电泳图谱与权利要求1中所述的 指纹图谱比较，获知未知材料与已知哈密瓜品种的亲缘关系。
全文摘要
本发明的目的在于发明一种基于AFLP分子标记技术的哈密瓜指纹图谱，将其用于哈密瓜种质的鉴定、品种鉴别与保护。将不同哈密瓜采集叶片，提取基因组DNA，经过酶切、连接、预扩增、选择扩增，PAGE电泳，得到高低不同的大量DNA条带，具有相同DNA条带的哈密瓜被认为是拥有同样的遗传位点，具有不同大小的DNA条带的哈密瓜被认为拥有不同的遗传位点，据此建立不同哈密瓜种质的指纹图谱，用于不同哈密瓜种质的鉴定、品种鉴别与保护种质保护。本发明的优点在直接对哈密瓜基因组DNA进行检测，不受田间环境等因素对甜瓜表型的影响，另外使用该方法可在幼苗期对幼苗进行检测鉴定，大大缩短检测周期。
文档编号C12Q1/68GK102134584SQ20101004552
公开日2011年7月27日 申请日期2010年1月22日 优先权日2010年1月22日
发明者李冠, 王贤磊, 赵琼珍, 高兴旺 申请人:新疆大学