专利名称：一种用棉籽油生产γ-亚麻酸的棉籽特异表达载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种植物转基因的表达载体，属于植物生物技术领域，本发明可用于 棉花等油料作物的转基因，在棉花种子中特异表达Y -亚麻酸合成关键酶——Δ 6-脂肪酸 脱氢酶基因，在棉籽中合成高价值Y-亚麻酸。
背景技术：
Y-亚麻酸作为具有生理作用的药物，广泛受到国内外医学界的重视，用于防治心 血管疾病、糖尿病、降低胆固醇及抑制溃疡、胃出血、妇女经前综合症等，另外，Y -亚麻酸在 营养学及美容、化妆品方面也有应用。Y-亚麻酸等多不饱和脂肪酸因在人类健康中具有重 要作用而成为极具价值的产品，据估计全球市场需求过万吨。研究表明，Y-亚麻酸仅存在 于紫草科等的少数植物中，目前主要商业来源为月见草、玻璃苣(Borago officinalis)和 黑醋栗(Ribes Nigrum)，也有通过真菌的发酵提取获得。然而，现在通过植物和真菌发酵生 产Y-亚麻酸成本高且在质量和产量上都不能满足日益增长的市场需求。目前国内外也有 基因工程菌株生产Y -亚麻酸的研究，但成本较高，工程菌含油量低，油分复杂，使得进一 步应用难以推广。油料作物种子产油量高，商业化农艺生产方法和油的回收处理技术已经 相当成熟，但油料作物通常不含Y-亚麻酸，利用外源Y-亚麻酸合成关键酶基因，通过遗 传转化的方法使油料作物合成Y-亚麻酸，将油料作物种子作为生产含Y-亚麻酸等功能 性物质的“生化反应器”具有非常好的应用前景。棉花是新疆广泛种植的重要经济作物，根据新疆维吾尔自治区农业厅提供的数据 显示，2006年新疆棉花种植面积1908万亩，总产量218万吨，皮棉平均亩产达114公斤，比 世界平均亩产高1.3倍。棉花种植面积和总产量分别占全国的30%和40%左右。除生产 了大量的原棉外，棉籽作为其副产品每年也达数百万吨，含油率远高于内地，然而目前对棉 籽的利用率较低，天然棉籽油中虽不含Y-亚麻酸，但Y-亚麻酸的合成前体物亚油酸的含 量高达66. 05%。因此利用棉花生物反应器将亚油酸转化为Y-亚麻酸，对提高棉花的附加 值和综合利用价值有重要意义。1993年，Reddy等人首次从一株产Y -亚麻酸的蓝细菌(Synechocystis sp. PCC6803)中克隆到Δ6-脂肪酸脱氢酶基因，并在Δ6-脂肪酸脱氢酶缺陷的蓝细菌 (Anabaena sp. PCC7120)中获得了功能性表达，推动了 Δ6-脂肪酸脱氢酶遗传学水平的研 究。1997年，Olga V. Sayanova等首次从高等植物琉璃苣中克隆Δ6-脂肪酸脱氢酶基因， 通过转基因烟草验证该基因活性。2003年，Heather Μ. Whitney根据保守结构域细胞色素 沾结合结构域设计简并引物从毛茛科银莲花(Anemone leveillei)中克隆获得两个脱氢 酶基因AL1、AL2，其中ALl基因经酵母与拟南芥表达验证具有Δ6-脂肪酸脱氢酶活性，毛茛 科银莲花△6-脂肪酸脱氢酶基因是非紫草科高等植物中克隆获得的第一个△6-脂肪酸脱 氢酶基因。2003年，Olga V. Sayanova等在报春花科植物中克隆Δ6-脂肪酸脱氢酶基因，经表 达验证该基因产物对η-3底物α -亚麻酸具有较强的底物偏好性。近几年，F. Garca-Maroto等从蓝蓟(Echium)中克隆到Δ6-脂肪酸脱氢酶基因，并通过酵母表达发现来源于 Macaronesian岛比来自欧洲大陆的蓝蓟中克隆的Δ6-脂肪酸脱氢酶基因对亚油酸具有具 有更强的底物偏好性，该结果与报春花科植物克隆的△ 6-脂肪酸脱氢酶基因具有对底物 α-亚麻酸的偏好性相反，此现象表明不同来源的△ 6-脂肪酸脱氢酶基因在催化功能方面 具有差异，因而，该基因克隆与功能研究有重要的理论与应用价值。目前△ 6-脂肪酸脱氢酶基因在真菌细胞中的表达最常用的宿主是酿酒酵母，但是 酿酒酵母本身只能合成油酸，只有外源性添加亚油酸，转基因酵母细胞才能合成Y -亚麻 酸，这无疑增加了生产成本。Huang YS等人尝试将Δ 12-脱氢酶和Δ6-脱氢酶在酿酒酵母 中共表达，不需添加亚油酸，直接将油酸转化成Y -亚麻酸，但是转化率很低，而且酿酒酵 母本身油酸含量也低。我国南开大学微生物学系将高山被孢霉△ 6-脂肪酸脱氢酶转到毕 赤酵母中获得表达，然而同样的低油含量以及复杂组分使得进一步应用难以推广。通过微 生物的基因工程生产Y-亚麻酸仍有待于深入研究。而利用基因工程手段使油料作物合成
Y-亚麻酸是另一种潜在的重要途径，含油种子作物产油量高，富含Y -亚麻酸的合成前体 亚油酸，而且商业化农艺生产方法和油的回收处理技术已经相当成熟。目前，国内外不同实 验室分别将克隆到的脂肪酸脱氢酶基因转入油菜、大豆和烟草等作物中，并获得功能性表 达。因此，通过利用基因工程方法利用油料作物的生产Y-亚麻酸在理论和方法上已经初 步建立，为以后大规模生产奠定基础。
发明内容
本发明涉及一种植物转基因的表达载体，属于植物生物技术领域，本发明将棉花 基因组中克隆的棉籽储藏蛋白启动子和紫草中克隆获得的Δ 6-脂肪酸脱氢酶基因通过酶 切连接先后构建到ΡΒΙ121植物表达载体，利用棉籽储藏蛋白启动子高效启动Δ6-脂肪酸 脱氢酶基因的转录表达。本发明可用于油料作物的转基因，在油料作物种子中特异表达
Y-亚麻酸合成关键酶-Δ 6_脂肪酸脱氢酶基因，使其合成高价值Y -亚麻酸。本发明可以通过以下技术方案实现提取棉花基因组DNA，用特异性引物PCR的方法扩增获得棉籽特异表达启动子，将 该启动子用HindIII与BamH I双酶切构建到ρΒΙ121植物表达载体，可通过转化拟南芥， 进行GUS染色的方法验证基因功能该棉籽特异表达系统的功能；提取假狼紫草未成熟种子 mRNA,反转录成cDNA，用特异性引物PCR的方法克隆获得假狼紫草△ 6脂肪酸脱氢酶基因， 用XmaI与ApaL I将△ 6_脂肪酸脱氢酶基因构建到棉籽特异表达载体中，利用该载体系统 可在棉籽中特异表达Δ6脂肪酸脱氢酶基因，利用棉籽油生产高价值Y-亚麻酸。
图1为用于生产Y-亚麻酸的棉籽特异表达载体的载体图，图中指出的位置分别 为棉花种子特异启动子和Δ6脂肪酸脱氢酶基因的位置，通过棉花特异启动子启动Δ6脂肪 酸脱氢酶基因的表达，达到在棉花种子中特异表达Δ6脂肪酸脱氢酶基因的目的。
具体实施例方式供试材料
假狼紫草[Nonea capsica(willd. )G. Don]未成熟种子，新疆陆地棉种子。主要试剂限制性内切酶、DNA marker、Taq多聚酶、PCR试剂等为TaKaRa(大连)有限公司 产品；DNA回收试剂盒购于北京百泰克生物工程公司；PCR用引物、亚油酸等购于上海生物 工程公司；其他试剂均为国产分析纯。配置的溶液主要有溶液I 50mM/L 葡萄糖；25mM/LTri s-HCL (ρΗ8· 0) ;10mM/L EDTA (ρΗ8· 0)溶液11 0. 2M/LNa0H ； 1 % SDS溶液III 5M/L 乙酸钾 60ml ；冰乙酸 11. 5ml ；水 28. 5ml棉花基因组DNA的提取(改进的CTAB法)(1)棉花叶片lOOmg，加入0. IgPVP及少许石英砂。加液氮研磨成粉末状，置于 1. 5ml离心管内；(2)向每个离心管内加入600 μ L预热的CTAB提取缓冲液，并轻轻混勻，65°C水浴 30min，其间不时摇动；(3)加入等体积的氯仿/异戊醇，轻缓颠倒离心管混勻，IOOOOrpm离心10-20min ；(4)将上清液转入新的离心管中，加入1/10体积的10% CTAB，混勻，加入等体积的 氯仿/异戊醇，颠倒离心管混勻，IOOOOrpm离心IOmin ；(5)取上清液，重复步骤4操作一次；(6)将上清液转入新的离心管中，加入1倍体积的IXCTAB沉淀缓冲液，混勻，轻轻 摇晃至沉淀生成。如无明显沉淀生成，可适当延长放置时间；(7) IOOOOrpm离心lOmin，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗涤，室温晾干；(8)用TE缓冲液50 μ L使沉淀充分溶解，加入2 μ L RNaseA酶液，37°C水浴30min ；(9)加入等体积的酚/氯仿抽提，室温放置lOmin，IOOOOrpm离心5min ；(10)取上清液，加入等体积的氯仿/异戊醇，颠倒混勻，室温放置lOmin，IOOOOrpm 离心5min ；(11)取上清液，加入1/10体积的3mol/L NaAc及2倍体积的无水乙醇，混 勻，-20°C放置Ih;(12) 4°C，IOOOOrpm 离心 5min，去上清；(13)沉淀用70%乙醇洗涤，室温晾干；(14)用25 μ L TE溶解DNA，_20°C下保存备用。0. 7%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA 的纯度和完整性。棉花种子特异启动子PCR扩增引物正向引物5‘ GAAATCCAAGTTGACACCTA 3 ‘反向引物5‘ GTGTGATGGTAATAGCAAAGA 3 ‘PCR 反应10 X Buffer (Mg2+) 2 μ 1dNTP (2. 5mmol/L)1· 5 μ 1正向引物(10ymol/L)0. 5μ 1
反向引物(10ymol/L)LATaq 酶模板H2O_
14. 2μ 1
0. 5μ 1 0. 3μ 1 1 μ 1Total反应条件94 "C94"C
5min 45s51 °C Imin 35cycles72 °C Imin72 °C 8minPCR扩增产物的回收(1)将扩增的10_50yLPCR产物在琼脂糖TAE凝胶上进行电泳，然后进行回收操 作；(2)在紫外灯下，将电泳凝胶上的PCR产物或酶切产物条带迅速切下(越小越 好)，放在1. 5mL的离心管中，称重；(3)加入3倍凝胶体积的溶胶/结合柱DB，放入56°C的水浴中5-lOmin，使凝胶溶 解。按每IOOmg胶加入150 μ L异丙醇，震荡混勻；(4)将上述溶液加入到硅胶树脂结合柱AC中，12000rpm离心lmin。倒掉收集管中 的废液，若溶胶液体积大于750 μ L，可分两次加入同一收集管中；(5)加入 700 μ L 漂洗液 WB, 12000rpm 离心 lmin,弃废液；(6)加入500 μ L漂洗液WB，12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中 残留的乙醇抑制下游反应；(7)取出结合柱AC，放入干净的1.5mL的Ep管中，在吸附膜中间部位加30yL洗 脱缓冲液EB，室温放置2min，12000rpm，离心2min，所得溶液即为回收片断的溶液。目的片段的连接10μ 1连接体系，pMD18-TVeCtor和目的片段的摩尔数之比为1 2-10，加连接液 5μ 1，用水补至10μ 1。16°C连接过夜。热击法转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞的制备(1)划线活化大肠杆菌DH5 α，挑单菌落于3mlLB液体培养基中，150rpm，37°C振荡 培养过夜；( 将培养菌液按1 %转接到250mlLB液体培养基中，振荡培养至OD6tltl = 0. 4-0. 6，取出置冰上30min ；(3)将菌液分装在50ml离心管中，4°C，4500g离心5min，回收菌体；(4)用 IOml 预冷的 75mmol/LCaCl2 重悬菌体，冰浴 30min ；(5) 4"C，4500g 离心 5min，回收菌体；(6)用細1预冷的75mm0l/LCaCl2重悬菌体，按400 μ 1/管分装，并以20%的比例添加灭菌甘油，-80°C保存备用。如即做即用，则在-80°C处理30min后即可用于转化。转化(1)取一支感受态细胞，置于冰上融化；(2)将10 μ 1连接产物加入感受态细胞，轻轻混合均勻，冰浴30min后，42°C水浴 90s立即取出置于冰上2-;3min，加入Iml液体LB，37°C，150rpm振荡培养40_60min ；(3)将上述培养物转移到加有Amp的LB固体平板(表层涂有适量比的X_gal和 IPTG)上，涂布均勻，37 °C倒置培养14-1^1。大肠杆菌质粒的制备碱裂解法小量制备质粒DNA(1)从转化组平板培养皿上取一转化体单菌落，接种到5ml含AMP的LB液体培养 基中，37°C恒温振荡培养过夜；(2)取1. 5ml过夜培养物于EP管中，12000rpm离心lmin，取沉淀；(3)加入溶液I 100μ 1，用移液器吹打沉淀，至到打散为止；(4)加入溶液II 200 μ 1，轻轻混勻，置冰浴5min ；(5)加入溶液II1150 μ 1，振荡混勻，置冰浴5min ；(6)4°C，12000rpm，离心5min，将上清液移至另一个离心管内；(7)加等体积的酚氯仿(体积比1:1)，混勻，4°C，12000rpm,离心5min,将上清 液移至另一个离心管内；(8)加2倍体积的无水乙醇，混勻，室温放置2 IOmin ；4°C，12000rpm,离心5min，
弃上清；(9)加入lml70%乙醇洗涤沉淀。4°C，12000rpm，离心2min，弃上清，室温干燥；(10)用30 μ 1 TE缓冲液(ρΗ8. 0，内含10mg/ml浓度的RNase)溶解沉淀。4°C保 存。重组质粒的筛选与鉴定蓝白斑筛选PMD18-T载体上多克隆位点处含有LacZ基因，可用χ-gal与IPTG选择培养基初步 筛选，没有插入外源DNA片段的自身环化的质粒，菌落为蓝色；插入外源片段的重组质粒的 转化子为白色菌落。PCR鉴定及酶切鉴定以从重组子提取的质粒DNA为模板，用4. 1. 2. 1中的引物，按照4. 1. 2. 2的PCR扩 增体系和反应条件，进行PCR鉴定。选用PMD18-T载体上的酶切位点进行酶切鉴定，酶切体 系D.D.W 6μ 1 ；Buffer M 1μ 1 ；EcoR I 0. 5 μ 1 ； Xba I 0. 5 μ 1 ；Plasmid 2μ 1 (约 2μ g)， 37°C水浴，酶切池。进行琼脂糖凝胶电泳检测，选取阳性质粒测序。测序保存质粒并送上海Sangon测序。载体及重组质粒的提取从保存着携带有pBI121的大肠杆菌的平板上挑取单个菌落，放入IOmL含有Kan 的LB液体培养基中，37°C培养过夜。载体及重组质粒的提取方法同前。酶切获取载体及目的片断
选择KpnI和I3StI作为酶切位点。按如下步骤进行酶切鉴定D. D. W IlyL; Buffer 2μ L ；Plasmid 6μ L ；Hindi 110. 5 μ L ；BamH I 0.5yL。37°C 水浴，酶切 2h。回收酶切后的片段回收方法同前。构建棉花种子特异表达载体(1)按顺序依次加入以下各种成分酶切回收pBI121my L ；目的片段η μ L ligation Buffer l.lyL ；DNA T4 Ligase 1. 0 μ L(根据回收片断的大小，进行摩尔数的配比计算，才可确定m、η的具体数值)。(2)轻轻混勻上述连接成分，低速离心后，放置在16°C反应过夜。C3)热击法转化大肠杆菌DH5ci :同前。(4)质粒的制备同前。(5)酶切鉴定阳性质粒选择Xma I和ApaL I进行鉴定。按如下体系进行酶切 D. D. W6 μ L ；Buffer 1 μ L ；Plasmid 2 μ L ；Xma I 0. 5 μ L ；ApaL I 0. 5 μ L. 37°C水浴，酶切 2h。Trizol法提取假狼紫草未成熟种子总RNA预处理(1)双蒸水和溶液用DEPC进行处理每IOOml溶液或水中加入0. ImlDEPC原液， 充分混勻并在37°C放置过夜，然后将溶液或水121°C高压灭菌60min，备用。(2)玻璃制品置于烘箱300°C 4h。提取步骤(1)称取0. Ig样品放入用液氮预冷的研钵，液氮研磨。(2)将样品粉末转入1.5ml EP管中，按0. Ig样品/lml Trizol加Trizol，充分混
口 O(3)4°C, 12000rpm 离心 5min。(4)取上清，按 200ul/lml Trizol 加氯仿，剧烈晃动 15s，30°C静置 2-3min0(5)4°C，12000rpm 离心 15min。(6)吸上层水相于另一 1. 5mlEP管，弃沉淀。按0. 5ml异丙醇/ImlTrizol加异丙 醇，混勻后室温静置5-lOmin。(7)4°C，12000rpm 离心 5min。(8)弃上清，按lml75%乙醇/ImlTrizol加乙醇，悬浮沉淀。(9)4°C，12000rpm 离心 5min，尽量弃上清，室温晾干 5-10min。(10)用 50ul ddH20 或 TE 溶解沉淀。(11)检验纯度和完整性后-20°C保存备用。RT-PCR(1)引物根据载体pBI121-p及NcD6D基因上的酶切位点，本试验对目的基因进行了修饰， 分别在正向引物和反向引物中添加了 Xma I和ApaL I两个酶切位点。正向引物5，CCCGGGCCATGGCTACTGAAATCAAGAAG3，Xma I35 cycles
0129]反向引物5，GTGCACTTAACCATGAGTTTGAAGAGCTT3，
0130]ApaL I
0131](2)反转录体系
0132]oligo(dT)Iul
0133]RNAlug
0134]10mmol/L dNTPIul
0135]DEPC-ddH20加至 14. 5ul
0136]以上溶液混勻后，65°C保温5min，在冰上静置Imin后，加入以下试剂
0137]5X First-Strand Buffer 4ul
0138]DTT (0. lmol/L)Iul
0139]Reverse transcriptase 0. 5ul
0140]混合均勻后，50°C保温30-60min，然后70°C保温15min。-20°C贮存备用。
0141]NcD6D基因的PCR扩增
0142]PCR 反应
0143]IOXBuffer (Mg2+) 2μ 1
0144]dNTP(2. 5mmol/L)1. 5μ 1
0145]正向引物(ΙΟμπιοΙ/L) 0. 5μ 1
0146]反向引物(ΙΟμπιοΙ/L) 0. 5 μ 1
0147]LATaq 酶0. 3 μ 1
0148]模板1μ 1
0149]H2O14. 2μ 1
0150]_
0151]Total20 μ 1
0152]反应条件
0153]94 °C 5min72 C 8min制备中间载体方法同前。载体及重组质粒的提取从保存着携带有pBI121-p的大肠杆菌的平板上挑取单个菌落，放入IOmL含有Kan 的LB液体培养基中，37°C培养过夜。载体及重组质粒的提取方法同前。酶切获取载体及目的片断按如下步骤进行酶切鉴定D.D.W IlyL5Buffer 2μ L ；Plasmid 6 μ L ；Xma I 0. 5 μ L ；ApaL I 0. 5yL。37°C水浴，酶切浊。回收目的条带。连接棉花种子特异表达载体(1)按顺序依次加入以下各种成分
Sin 5sm]m 4 12
PPP 4 12 9 5 7
0154]
酶切回收pBI121-p m μ L ；目的片段 η μ L ;Ligation Buffer l.lyL ；DNA T4 Ligase 1.0 μ L(根据回收片断的大小，进行摩尔数的配比计算，才可确定m、η的具体数值)。(2)轻轻混勻上述连接成分，低速离心后，放置在16°C反应过夜。(3)热击法转化大肠杆菌DH5 α。(4)质粒的制备同钱。(5)酶切鉴定阳性质粒选择Xma I和ApaL I进行鉴定。按如下体系进行酶切 D. D. W6 μ L ；Buffer 1 μ L ；Plasmid 2 μ L ；Xma I 0. 5 μ L ；ApaL I 0. 5 μ L. 37°C水浴，酶切 2h。高价值Y -亚麻酸的生产该重组质粒即为用棉籽油生产Y-亚麻酸的棉籽特异表达载体，通过农杆菌介导 或花粉管转化的方法将目的片段导入棉花或油菜等油料作物中可在种子油中将亚油酸转 变为高价值Y-亚麻酸。
权利要求
1.一种一种植物转基因的表达载体，通过将棉花基因组中克隆的棉籽储藏蛋白启动子 和紫草中克隆获得的Δ6-脂肪酸脱氢酶基因通过酶切连接先后构建到PBI 121植物表达 载体得到。
2.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于将棉籽储藏蛋白启动子和紫草中克隆 获得的Δ6-脂肪酸脱氢酶基因通过基因工程方法连接，用棉籽储藏蛋白启动子高效启动 Δ 6-脂肪酸脱氢酶基因的转录表达。
3.如权利要求1所述的表达载体的使用，其特征在于用权利要求1所述的表达载体 转化棉花等油料作物，将亚油酸催化生成Y-亚麻酸。
全文摘要
本发明涉及一种植物转基因的表达载体，属于植物生物技术领域，本发明将棉花基因组中克隆的棉籽储藏蛋白启动子和紫草中克隆获得的Δ6-脂肪酸脱氢酶基因通过酶切连接先后构建到pBI121植物表达载体，利用棉籽储藏蛋白启动子高效启动Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的转录表达。本发明中种子特异启动子的功能在模式植物拟南芥中得到验证，Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的功能也通过酵母表达得以验证，本发明可用于油料作物的转基因，在油料作物种子中特异表达γ-亚麻酸合成关键酶-Δ6-脂肪酸脱氢酶基因，使其合成高价值γ-亚麻酸。本发明的优点在于通过基因工程方法将棉籽油中含量最高的脂肪酸-亚油酸转变为γ-亚麻酸，大大提高棉籽油的附加值。
文档编号C12N15/82GK102134576SQ20101004552
公开日2011年7月27日 申请日期2010年1月22日 优先权日2010年1月22日
发明者李冠, 王贤磊, 谢亚均 申请人:新疆大学