专利名称：：瘤果黑种草籽油的药物用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种维吾尔医常用药材一瘤果黑种草籽油作为蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂的药物及抗脂质过氧化药物及保健品的用途。通过体外实验证实的它所具有的蛋白酪氨酸磷酸酶IB(PTP1B)抑制剂的效果以及抗脂质过氧化的功效。它形成的抗糖尿病药物及抗氧化药物及保健品的用途。
背景技术：
：黑种草属植物属毛茛科植物金莲花亚科，其中有三种药用植物，分别是瘤果黑种草GW《e7h^a/7oWi/era)，又名腺毛黑种草，还有果黑种草GV^WhM^'ra)，又名家黑种草以及黑种草(7W'^JhA/^s"朋L)，它们的种子是常用的药用部分。目前国外的研究主要集中在果黑种草上。瘤果黑种草(Mge//"g/"m^/^rai^》M)，原产地为地中海沿岸及中亚地区，在我国仅新疆有栽培。它干燥成熟种子，呈三棱状卵形，长2.5-3mm，宽约l.5mm。表面黑色，粗糙，顶端较狭而尖，下端稍钝，有不规则的突起。质坚硬，断面灰魄，有油性。气微香，味辛。可以刺激消化驱风止痛、补肾健脑、利尿、发汗、健胃、抗蠕虫、治疗哮喘等，是维吾尔医学中一种习惯用药。近年来，经研究发现它的同属植物果黑种草籽(M^^在降脂、降糖方面具有一定功效，经过对大鼠口服黑种果草籽固态油(Mge^^riw/)12周，未发现对肝脏中主要的酶产生影响，同时，血液中的胆固醇、甘油三酯、葡萄糖、淋巴细胞和血小板数目分别比对照降低了15.5，22，16.5，35和32%血细胞比容和血红蛋白水平上升了6.4和17.4%。用胃内管饲法给正常大鼠词喂黑种草籽石油醚提取物4周，石油醚提取物由于减少了25%的食物，因而体重短期减轻。在体内和体外试验中均未观察到植物的毒性且空腹血糖保持稳定。治疗4周后与对照组相比治疗组的大鼠空腹胰岛素和甘油三酯水平较低而HDL-胆固醇水平较高。通过Western杂交分析表明发现从各组动物中分离出来的肝细胞对胰岛素水平反应上升了。在体内石油醚部分通过增加激素受体的两种细胞内信号传导途径起到了胰岛素增敏剂的作用。按400mg/kg给链尿菌素(STZ)诱导的糖尿病仓鼠胃内管词法词喂黑种草籽油(M'ge//aM/v")6周，在诱导糖尿病之后，用胶原酶消化并收集分离的肝细胞已确定肝糖的产生。通过在一段时间内注射荧光素乳液，24小时后收集腹膜巨噬细胞以评价吞噬能力。治疗组血糖从治疗前的391+/-3.Omg/dl在第一、二、三、四周后减少到325+/-4.7，246+/-5.9,208+/-2.5和179+/-3.1mg/dl。在治疗组仓鼠中从糖异生作用前体来的肝糖产物明显减少提示着它的降糖效果部分源于减少了肝糖元的合成。另外，经黑种草籽油治疗后腹膜巨噬细胞的吞噬活性和吞噬指数明显上升，外周血中淋巴细胞数量增加。这表明其免疫保护作用是通过直接刺激巨噬细胞的吞噬活力或通过刺激淋巴细胞的活力来完成的。给雄性易于中风的自发性高血脂大鼠和Wistar大鼠按800mg/kg剂量口服果黑种草籽油(Mge//aw/va)4周，可明显降低血清中总胆固醇、低密度脂蛋白、甘油三酯的含量，同时，升高高密度脂蛋白含用STZ和烟酰胺诱导形成了糖尿病的大鼠为模型。给大鼠口服黑种草籽油(Mge//fl^"vfl)4周，血糖明显减少，经酶连免疫和抗胰岛素单抗证明，胰岛素水平明显上升。经免疫组化染色可在胰岛中观察到大量的胰岛素阳性反应区，结果显示在2型糖尿病模型中，黑中草籽油有类似胰岛素的功能。由于2型糖尿病的发生发展可由遗传和环境因素的相互作用等引起，其中，胰岛素信号转导障碍在发病机制中所起的重要作用。蛋白酪氨酸磷酸酶1B(ProteintyrosinephosphatasePTP1B)是胰岛素信号转导关键的负调控子。PTP1B是细胞内PTP的代表，是第一个被鉴定并纯化出的哺乳动物蛋白酪氨酸磷酸酶，由435个氨基酸残基组成，分子量约50KD，蛋白酪氨酸磷酸酶1B在人体各组织细胞中普遍存在并表达，并通过使激活的胰岛素受体及胰岛素受体底物(IRs-l)等去磷酸化失活而发挥生理功能。它可协调酪氨酸残基磷酸化和去磷酸化之间的平衡，阻止胰岛素信号转导。2型糖尿病和胰岛素抵抗患者体内特异的蛋白酪氨酸磷酸酶含量及活性均有所增加，当蛋白酪氨酸磷酸酶被剔除后，不仅胰岛素敏感性增高，而且糖尿病症状也有所改善。蛋白酪氨酸磷酸酶1B缺乏的小鼠与其野生型对照小鼠相比对胰岛素更敏感，血糖控制更好，而且对饮食诱导的肥胖有更好的抵抗作用。因此，抑制蛋白酪氨酸磷酸酶1B的作用已成为一种新的治疗胰岛素抵抗(IR)、II型糖尿病和肥胖的方法。同时，蛋白酪氨酸磷酸酶1B的高表达可引起胰岛素抵抗和痩素抵抗，它的过度表达可促使载脂蛋白B100(ApoB100)分泌增加，使血浆极低密度脂蛋白(VLDL)生成增多，从而导致脂代谢紊乱、2型糖尿病及肥胖。研究表明，蛋白酪氨酸磷酸酶1B基因敲除鼠不仅胰岛素敏感性增强，而且由于去除了蛋白酪氨酸磷酸酶1B对胰岛素和瘦素信号转导的抑制，使小鼠在高脂饮食条件下也不发生肥胖。为明确蛋白酪氨酸磷酸酶1B与脂代谢紊乱之间的关系，Klaman等对蛋白酪氨酸磷酸酶Nl基因敲除小鼠进行了研究，结果显示长期果糖喂养普通小鼠会导致了血浆极低密度脂蛋白升高，而果糖喂养PTPN1基因敲除小鼠中未见极低密度脂蛋白升高，提示蛋白酪氨酸磷酸酶1B有促进极低密度脂蛋白分泌的作用。Taghi-biglou等在对携带人载脂蛋白B(ApoBux))但缺乏褐色脂肪组织的载脂蛋白B(ApoB)/褐色脂肪组织(BAT)缺陷小鼠和经果糖饲养的仓鼠模型的研究中发现，肝极低密度脂蛋白一载脂蛋白B增多将导致胰岛素抵抗。有报道表明，蛋白酪氨酸磷酸酶1B可调控果糖诱导的糖尿病模型动物的脂蛋白谱，下调蛋白酪氨酸磷酸酶1B表达可抑制高碳水化合物诱导的胰岛素抵抗及与之相关的脂代谢紊乱。因此蛋白酪氨酸磷酸酶1B不仅胰岛素增敏剂的靶点之一，同时也可能是脂代谢紊乱的治疗靶点之一。鉴于果黑种草籽与瘤果黑种草籽是同属植物，且在传统医学中具有类似的功效以及果黑种草籽具有的降脂、降糖作用，本发明研究了瘤果黑种草籽油的降糖功能，利用常规方法获得了瘤果黑种草籽油，并在体外证实了其蛋白酪氨酸磷酸酶蛋白酪氨酸磷酸酶1B抑制剂的作用和抗脂质过氧化作用。
发明内容本发明目的在于，提供一种维吾尔医学中的常用药材-瘤果黑种草籽油作为制备治疗抗糖尿病蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂的药物或保健品的用途以及作为制备抗氧化药物或保健品的用途。该瘤果黑种草籽油是从维药瘤果黑种草籽中采用常规压搾或溶剂萃取后减压除去溶剂得到的，并在体外证实了其蛋白酪氨酸磷酸酶PTP1B抑制剂的作用、抗脂质过氧化的能力，以及它形成的抗糖尿病及抗氧化的药物及保健品的用途。本发明所述的瘤果黑种草籽油作为制备治疗抗糖尿病蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂的药物或保健品的用途。本发明所述的瘤果黑种草籽油作为制备抗氧化药物或保健品的用途。本发明所述的瘤果黑种草籽油的药物用途，其中瘤果黑种草籽油是从维吾尔医常用药材一瘤果黑种草籽中，采取常规压搾或常规溶剂提取法、微波辅助溶剂提取、超声波辅助溶剂提取获得的瘤果黑种草籽油，具体操作步骤按下列进行用小极性溶剂包括石油醚，己烷，庚垸，二氯甲烷，氯仿，乙醚以及它们的各种混合溶剂直接浸泡瘤果黑种草籽，然后减压蒸馏除去溶剂即得瘤果黑种草籽油；或使用大极性的溶剂如甲醇，乙醇或0%—30%浓度的甲醇、乙醇的水溶液，于20-98'C温度条件下提取瘤果黑种草籽，该提取物浓縮后以浓度0%_30%甲醇或乙醇溶解分散，再以有机溶剂如石油醚，己垸，庚垸，二氯甲烷，氯仿萃取，将萃取物浓縮干即得瘤果黑种草籽油。在传统维吾尔医学中，瘤果黑种草籽在维吾尔医药中，黑种草具有利尿、补脑、补肾、活血、解毒、下乳、通经、止咳、乌发、抗衰老等功效，是维吾尔医学中一种习惯用药，瘤果黑种草籽油目前被制成复方斯亚旦生发油、复方斯亚旦生发酊主要用于乌发和生发。到目前为止，关于瘤果黑种草的研究仅限于郝海峰、刘玉明、倪君君等先后从瘤果黑种草籽中分离得到了16个化合物，以及田泽等考察从其中分离得到的两种常春藤皂苷的抗肿瘤活性，但对其降糖活性和抗氧化性的研究尚未见报道。参见附1为本发明免疫印迹方法分析过度表达PTP1B的CH0细胞中磷酸化AKT的电泳图，其中l空白对照，2胰岛素刺激后对照，3阳性对照，4测试样品。具体实施方式实施例1取干燥瘤果黑种草籽(^z^e"a^朋^ii/kra)10Kg，利用常规的压榨机压榨的方法，得到瘤果黑种草油。实施例2取干燥的瘤果黑种草籽GVi《e7Ja^/a"^/h'/era尸rej7.)10Kg，粉碎后，利用石油醚常温浸泡7天，过滤除去草籽，滤液利用旋转蒸发仪，除去石油醚得到瘤果黑种草籽油。实施例3:取瘤果黑种草(WgeWa^a/^h'/kra/^re，.)的干燥种子200g，粉碎，置于2L具塞烧瓶，将烧瓶置超声波提取仪，以石油醚室温超声提取3次，每次1.5L，每次浸提时间为0.5小时，合并提取液，过滤，于旋转蒸发仪内减压浓縮至干，得到油状物75g。实施例4取瘤果黑种草(M>eWa^7朋oWj'/era尸re".)的干燥种子10Kg，粉碎，置于50L提取罐，以70%乙醇室温冷浸提取4次，每次乙醇用量为30L，每次浸提时间为7天，合并提取液，于旋转蒸发仪内减压浓縮至干，加入10%的甲醇水溶液2L溶解，并以石油醚(60-90°C)萃取5次，每次2L，合并萃取液，于旋转蒸发仪内减压浓縮至干，得到油状样品3560g。实施例5取瘤果黑种草0V_z>eW<3^朋甴力'/era/^rejT7.)的干燥种子100g，粉碎，置于1L具塞烧瓶，将烧瓶置微波炉中，以95%乙醇微波辅助萃取3次，每次600mL，每次浸提时间为5min;合并提取液，过滤，于旋转蒸发仪内减压浓縮至干，得到油状物18g。实施例6瘤果黑种草籽油作为制备治疗抗糖尿病蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂的药物或保健品的用途的生物活性筛选筛选方法用对-硝基苯基磷酸二钠(pNPP)作为底物，以在阳性药物钒酸钠为对照，利用酶标仪进行PTP1B酶抑制剂的高通量筛选，根据PTPlB水解pNPP的磷酸基团而产生颜色反应来测定PTP1B的活性。酶反应体系组成如下缓冲液(50mMHEPES，pH7.3，100mM氯化钠，0.1%牛血清白蛋白，and1mM二硫代苏糖醇)，PTP1B融合蛋白，pNPP，PTPIB特异抑制剂钒酸钠(100ug/mL)。反应体系混匀后在37t:放置30rnin，加入1M氢氧化钠终止反应，置比色仪上测定405波长条件下的吸收值(A)，测定结果减去本底值后计算酶活性。筛选结果-.<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>结论:从实验结果表明，瘤果黑种草籽油具有蛋白酪氨酸磷酸酶1B抑制剂功效。免疫印迹实验1)脂质体转染仓鼠卵巢癌细胞(CHO)在传代后在F12+10呢胎牛血清(FBS)培养基中培养30h后，按照Lipofectamine2000TM使用说明书上的方法将携带全长-PTP1B基因的pJ3H质粒DNA与脂质体混合后转染进CHO细胞中，6小时后，除去含有脂质体的培养基换上F12+10%FBS培养基继续培养过夜；2)给第一步中处理好的细胞更换含有测试样品的F12+10%FBS培养基，3小时后加入适量的胰岛素刺激5min，收获细胞。在冰浴中，用细胞刮刮下细胞，收集细胞裂解液。3)电泳结束后，取出凝胶，在Tris/甘氨酸缓冲液中漂洗数秒。取凝胶方法用刀片将两玻璃板分开，将多余的凝胶划去，上部以浓縮胶为准全部弃去，下部以分子量标准最小分子带下一点全部划去，取一10ml注射器注满转印缓冲液，插入玻璃板与凝胶之间注水，使水的压力将两者自然分开,边推边进,反复多次注水,直至凝胶从玻璃板上滑落下来。打开电转印夹，每侧垫上一块专用的用转印液浸泡透的海面垫，再各放一块转印液浸透的滤纸，滤纸与海面垫大小相同或与PVDF膜，凝胶大小相同均可，将凝胶平放在阴极侧滤纸上，最后将膜平放在凝胶上，去除气泡，夹好电转印夹。电泳槽加满电转印液，插入电转印夹，将电泳槽放入冰箱内(电转印液之前要放入冰箱内预冷)，连接好电极，接通电流，转印夹的膜应对电泳槽的正极。利用电转仪将SDS-PAGE上的蛋白质转移到膜上。条件400mAlh或280mA，1.5-2h;4)封闭在进行抗体杂交之前，需要先对转印膜进行封闭，以防止免疫试剂的非特异性吸附。①洗转印膜室温漂洗3次xl0min，以尽量洗去转印膜上的SDS，防止影响后面的抗体结合。取漂洗的转印膜，放入含5%脱脂奶粉的封闭液内，摇床震动，室温封闭2h，也可在4。C过夜。③用缓冲液，PH7.6室温漂洗3次xlOmin.5)抗体杂交抗体表面主要采用间接法。①封闭后的杂交膜放入杂交袋中，加入抗体稀释液，封口，4"C孵育过夜或室温(22-25°C)摇动孵育2h.②液洗膜3次xlOmin③加入二抗稀释液，室温lh，洗膜3xlOmin)6)检测采用增强化学发光(ECL)检测是利用辣根过氧化物酶催化化学发光物质，生成一种不稳定的中间物质，其衰变时在暗室内形成明显的肉眼可见的化学发光带，利用X线胶片感光原理，将结果记录下来:ECM显色剂配制按lmlH20加显色剂A、B各1滴，混匀。在暗室将杂交后印迹膜放入显色盒中，加上混合好的显色液，约1-5分钟用，纸巾吸去印迹膜边缘或者边角部分多余的显色液，将一透明的玻璃纸盖住抚平，并确定干的表面与胶片接触.将印迹膜在暗室中使胶片以确定所测抗原的正确暴光时间，暴光时间可短至几秒也可以长到数小时.冲洗胶片步骤先在显影液中冲洗至胶片上出现条带或者胶片透明为止，在放入定影液中漂洗，十秒即可。结果表明可以增加中细胞磷酸化AKT的含量，这使得瘤果黑种草籽油能通过PI3K/AKT途径刺激GLUT4转运，从而达到降低血糖的目的。实施例7:作为制备抗氧化药物或保健品的用途功能以卵黄脂蛋白为底物的脂质过氧化模型反应包括1:25稀释的卵黄悬液(卵黄用等体积的PH7.45，0.1M磷酸缓冲液(PBS)配成，用前磁力搅拌起搅拌10min)0.15mL，25mm硫酸亚铁溶液0.15mL，最后，用PBS补足1.2mL，对照管中不加样品，样品体积用PBS补齐并提前加入2(mTCA溶液0.675mL，试验开始后将上述两种试管同时置于37。C的水浴中放置15min。取出后，药品关加入20%TCA溶液0.675mL静止10min后，转移至1.5mL离心管中，7000rmp/min离心7-8min，取上清分别加入硫代巴比妥酸溶液(0.8%)0.5mL，混匀后，分为两份，在沸水浴中放置15min，取出冷却。以PBS溶液调零，721型分光光度计测定As32值，样品的抗氧化程度用对卵黄脂蛋白脂质过氧化的抑制率表示A(W。二(对照管A碟值-样品管As32值)/对照管A532值X100%浓^抑制率\样品123456、100HgM86.787.986.286.286.787.9结果表明瘤果黑种草籽油具有抗脂质过氧化的能力。权利要求1、一种瘤果黑种草籽油作为制备治疗抗糖尿病蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂的药物或保健品的用途。全文摘要本发明涉及瘤果黑种草籽油的药物用途，该瘤果黑种草籽油是从维吾尔医常用药材--瘤果黑种草籽中采用常规压榨或溶剂萃取后减压除去溶剂得到的，通过体外实验证实的它所具有的蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)抑制剂的效果以及抗脂质过氧化和清除氧自由基的功效。它形成的抗糖尿病药物及抗氧化药物及保健品的用途。文档编号A61P3/00GK101129497SQ20071014749公开日2008年2月27日申请日期2007年9月17日优先权日2007年9月17日发明者信学雷,吴汉夔,阿吉艾克拜尔·艾萨,阿布力米提·伊力申请人:中国科学院新疆理化技术研究所