具有改进的生产力的酵母和产生产物的方法
【专利说明】具有改进的生产力的酵母和产生产物的方法
[oow] 相关申请 W02]本申请要求2014年7月3日在韩国知识产权局提交的韩国专利申请No. 10-2014-0083234的权益，其完整公开内容通过提述并入本文。
[0003] 通过提述并入的电子提交材料
[0004] 通过提述完整并入本文中的是随本文提交的计算机可读的核巧酸/氨基酸序列 表：2015年4月2日创建的名称为^I46660CN_Sequence list, txt"的_ASCII灯ext)文 件。 发明领域
[0005] 本公开设及能够W增加的速率消耗葡萄糖的酵母细胞，W及一种通过使用该酵母 细胞有效生产糖酵解衍生的产物的方法。
[0006] 发明背景
[0007] 产物如有机酸和醇被广泛用作食品、药物和化学工业中的构建块材料。已知所述 材料产自石油，但正开发通过使用环境友好的微生物来产生所述材料的方法。
[0008] 通过使用微生物产生产物的方法由于发酵可能花费较长时间且需要用于分离产 物的高成本。运类微生物可W包括酵母。在通过微生物来产生产物的方法中，改进微生物 的生产力将是有利的。
[0009] 实际上，提高生产力的办法依赖于W下假设，即生产环境如酸应激限制生产力。菌 株开发的另一聚焦点是产物形成本身，在该意义上，应提高设及产物形成的酶的活性。一般 地，增加的酶活性的例子可W包括中屯、代谢途径如糖酵解，其提供产物生产所需的中间物。
[0010] 因此，仍需要具有增加的目的产物生产力的酶和通过使用该酶产生运类产物的方 法。
[0011] 发明概述
[0012] 提供一种重组酵母细胞，其具有GCRl和GCR2的至少一种的增加的活性，其中相比 于不包含增加GCRl和GCR2的至少一种的活性的遗传修饰的同一类型的酵母细胞，所述酵 母细胞包含增加GCRl和GCR2的至少一种的活性的遗传修饰。在一个方面，相比于不包含 增加GCRl和GCR2的至少一种的活性的遗传修饰的同一类型的酵母细胞，所述酵母细胞能 够W增加的葡萄糖消耗速率消耗葡萄糖。在另一个方面，相比于不包含增加GCRl和GCR2 的至少一种的活性的遗传修饰的同一类型的酵母细胞，所述酵母细胞具有增加的糖酵解中 间物或糖酵解中间物衍生的材料的生产力。
[0013] 在再一个方面，相比于不包含增加GCRl和GCR2的至少一种的活性的遗传修饰的 同一类型的酵母细胞，所述酵母细胞具有增加的糖酵解。
[0014] 在一个实施方案中，所述重组酵母细胞包含编码GCRl的外源多核巧酸和编码 GCR2的外源多核巧酸的至少一种。在一个具体的实施方案中，GCRl和GCR2蛋白分别包含 与SEQ ID NO: 1和3具有约75%或更高序列同一性的氨基酸序列。在另一个具体的实施方 案中，编码GCRl蛋白的多核巧酸与SEQ ID NO: 2或59具有约95%或更高序列同一性，且编 码GCR2蛋白的多核巧酸与SEQIDN0:4具有约95%或更高序列同一性。
[0015] 在一个方面，相比于不包含增加GCRl和GCR2的至少一种的活性的遗传修饰的同 一类型的酵母细胞，所述重组酵母细胞还包含增加W下至少一种酶活性的遗传修饰，所述 酶为将丙酬酸转化成乳酸的酶，或用于将丙酬酸转化成乙醇的途径的酶。具体地，所述重组 酵母细胞还包含W下至少一种：编码将丙酬酸转化成乳酸的酶的外源多核巧酸，或编码用 于将丙酬酸转化成乙醇的途径的酶的外源多核巧酸。
[0016] 在另一个方面，在重组酵母细胞中缺失或破坏至少一种W下基因：编码丙酬酸脱 簇酶的基因、编码k乳酸细胞色素C氧化还原酶的基因、编码甘油-3-憐酸脱氨酶的基因、 和编码醇脱氨酶的基因。
[0017] 所述酵母细胞是酵母属（Saccharomyces)、接合酵母属狂ygosaccharomyces)、毕 赤酵母属（Pichia)、克鲁维酵母属化Iuyveromyces)、假丝酵母属（Candida)、裂殖酵母属 (化izosaccharomyces)、Issachenkia或汉逊酵母属（Hansenula)菌株。在一个具体的实 施方案中，所述重组酵母细胞是包含编码GCRl的外源基因或编码GCR2的外源基因的至少 一种的酵母属菌株细胞。具体地，所述酵母菌株是酿酒酵母（S.cerevisiae)。
[0018] 还提供一种用于增加酵母细胞中的糖酵解速率的方法，包括将编码GCRl和GCR2 的至少一种的多核巧酸引入所述酵母细胞中。
[0019] 进一步提供一种产生糖酵解中间物或糖酵解中间物衍生的产物的方法，其通过培 养所述重组酵母细胞W产生糖酵解中间物或糖酵解中间物衍生的产物，并从培养溶液回收 所述糖酵解中间物或糖酵解中间物衍生的产物。
[0020] 发明详述
[0021] 现将对实施方案进行详细提述。在此方面，目前的实施方案可能具有不同形式且 不应理解为受限于本文中陈述的说明。因此，下文仅描述了实施方案W解释说明书的方面。 如本文中使用的，术语"和/或"包括一种或多种所列关联项的任意和所有组合。表述如"至 少一种"在置于一组要素之后时，修饰整组要素而不修饰该组的单个要素。
[0022] 术语细胞、酶、多肤或蛋白质的"活性增加"或"增加的活性"等可W指细胞、酶、多 肤或蛋白质活性的任意可检测的增加。活性中的增加意指细胞、酶、多肤或蛋白质的活性水 平高于在可比的细胞、酶、多肤或蛋白质中测量的活性水平。如此，例如，重组（经遗传工程 化）细胞、酶、多肤或蛋白质活性中的增加可W是相对于未经遗传工程化的同一种类的细 胞、酶、多肤或蛋白质（例如野生型或亲本细胞）的活性。例如，重组（经遗传工程化）细 胞、酶、多肤或蛋白质的活性相比于初始（未经遗传工程化）的细胞、酶、多肤或蛋白质可 W增加了约5%或更多、约10%或更多、约15%或更多、约20%或更多、约30%或更多、约 50%或更多、约60%或更多、约70%或更多、约100%或更多、约200%或更多、或约300%或 更多。增加的活性可通过使用本领域普通技术人员已知的方法来验证。转录因子如GCRl 和GCR2的体内活性水平通过其编码转录因子如GCRl和GCR2的祀基因的表达水平来验证。 表达水平可通过使用测量蛋白质水平、或mRNA水平的已知方法，如化ISA、Western印迹、 PCR、Nodhern印迹等来测量。
[0023] 多肤、酶或蛋白质的活性增加可通过编码酶、多肤或蛋白质的多核巧酸的增加的 表达，或蛋白质、多肤或酶的比活性的增加来实现。表达增加可W通过W下来实现：将编码 蛋白质、多肤或酶的外源多核巧酸引入细胞中，增加细胞中编码蛋白质、多肤或酶的内源多 核巧酸的拷贝数，或突变编码蛋白质、多肤或酶的内源多核巧酸的调控区来增加表达。如 其在本文中使用的，"外源"意图指将所提述的分子或所提述的活性引入宿主微生物生物体 中。所述分子可例如通过将编码核酸引入宿主遗传材料中，如通过整合到宿主染色体或作 为非染色体遗传材料如质粒来引入。因此，术语"外源"如其关于编码核酸的表达使用的， 指的是将编码核酸W可表达形式引入微生物体中。当关于生物合成活性使用时，术语"外 源"指引入宿主参照生物体中的活性。外源核酸可W是同源或异源编码核酸，其在引入宿主 微生物体后表达所述的活性。相反，术语"内源"指在给定遗传修饰之前即存在于宿主中的 所述分子或活性（例如一种细胞天然的活性）。类似地，当述及编码核酸的表达时，该术语 指在给定遗传修饰之前编码核酸（例如一种细胞天然的核酸）在微生物体内的表达。术语 "异源"指源自所述物种W外来源的分子或活性，而"同源"指源自与宿主微生物体相同物种 的分子或活性。因此，本发明的编码核酸的外源表达可利用异源或同源编码核酸之一，或两 者皆可。
[0024] 术语"拷贝数增加"可W是通过引入外源基因或扩增内源基因实现的拷贝数增加， 且包括通过遗传工程化细胞W具有原先不存在于细胞的基因。基因的引入可由媒介物如载 体介导。引入可W是瞬时引入，其中基因不整合到基因组，或者基因的引入可W设及基因插 入基因组。引入可通过例如W下来实施，将插入编码祀多肤的多核巧酸的载体引入细胞，然 后在细胞中复制该载体或将多核巧酸整合到基因组中。
[0025] 如本文中使用的，术语"遗传修饰"可W指引入编码多肤的多核巧酸（即基因拷贝 数的增加），或对亲本细胞的遗传材料进行至少一个核巧酸的取代、添加、插入或缺失，或对 亲本细胞遗传材料的化学突变。换言之，遗传修饰可包括与多肤的编码区或其功能片段有 关的情况，所述多肤与所述及的物种异源、同源、或既异源又同源。遗传修饰还可W指在能 修饰基因或操纵子的表达的非编码调控区中的修饰，其中所述非编码调控区包括5'-非编 码序列和/或3'-非编码序列。
[00%] 术语"基因"指表达特定蛋白质的核酸片段且可包含编码区W及调控序列如 5' -非编码序列或3' -非编码序列。调控序列可包括启动子、增强子、操纵子、核糖体结合位 点、聚A结合位点、和终止子区。
[0027] 术语"分泌"意指从细胞内部将材料运输到周质空间或胞外环境。
[0028] 本文中使用的术语"有机酸"不仅涵盖中性有机酸，而且还涵盖带负电荷的有机 酸及其盐（可交换）。有机酸可包括乙酸、乳酸、丙酬酸和TCA循环中间物，如巧樣酸、衣康 酸、异巧樣酸、草酷班巧酸、a-酬戊二酸、班巧酸、班巧酷-CoA、延胡索酸、马来酸、或草酷 乙酸。例如，乙酸（aceticacid)与乙酸醋/根（acetate)或其盐可交换使用。
[0029] 本文中使用的术语细胞、酶、蛋白质或多肤的"活性降低"或"降低的活性"意指给 定的细胞、酶、蛋白质或多肤的活性水平低于可比的细胞、酶、蛋白质或多肤的活性水平。如 此，例如，重组（经遗传工程化的）细胞、酶、蛋白质或多肤的活性中的降低可W是相对于未 经遗传工程化的同一种细胞、酶、蛋白质或多肤（例如野生型或亲本细胞）的活性。例如，重 组（经遗传工程化的）细胞、酶、多肤或蛋白质的活性相比于初始（未经遗传工程化的）细 胞、酶、蛋白质或多肤的相同生物活性可W降低约10%或更多，约20%或更多，约30%或更 多，约40%或更多，约50%或更多，约55%或更多，约60%或更多，约70%或更多，约75% 或更多，约80%或更多，约85%或更多，约90%或更多，约95%或更多，或约100%。可通过 使用本领域普通技术人员已知的方法来验证具有降低的活性的细胞、多肤、蛋白质或酶。活 性降低包括其中酶、蛋白质或多肤表达但酶、蛋白质或多肤活性不可检测或降低的情况，W 及其中编码酶或多肤的基因不表达或，甚至当该基因表达时，该表达低于未经遗传工程化 基因的表达的情况。
[0030] 酶的活性、蛋白质的活性或多肤的活性的降低可通过编码该酶、蛋白质或多肤的 基因的缺失或破坏所导致。本文中使用的术语"缺失"或"破坏"指突变、取代或缺失基因 的一部分或整个基因或调控区（如基因的启动子或终止子）的一部分或整个调控区，或将 至少一个碱基基团插入到基因用于防止基因表达或防止表达的酶、多肤或蛋白质显示活性 或使得表达的酶、多肤或蛋白质相比于未经遗传工程化的细胞显示降低的活性水平。基因 的缺失或破坏可通过基因操纵如同源重组、突变生成或分子进化来实现。当细胞包含多个 相同基因或至少两个不同的多肤旁系同源基因时，可缺失或破坏一个或多个基因。
[0031] 本文中使用的术语核酸或多肤的"序列同一性"指当两条序列联配W在相应位置 处尽可能地彼此匹配时，两条联配序列之间的碱基基团或氨基酸残基的相似性程度。序列 同一性是通过联配至最佳状态并在特定比较区域比较两条序列来测量的值，其中特定比较 区域内的序列的一部分可W相比于参照序列添加或缺失。序列同一性百分比可W例如通 过W下来计算，比较在全比较区内联配至最佳的两条序列；获得匹配的位置数目，其通过测 定由两条序列中相同氨基酸或核酸所代表的位置数；将匹配的位置数目除W比较区内的位 置总数目（即范围大小）；并通过对结果乘W100来获得序列同一性的百分比。序列同一 性百分比可通过使用常见的序列比对程序来测定，例如BLASTP或BLASTN(NCBI)，CLCMain WorlAench(化C61〇)，]?6邑411即"值臟5141?Inc)。
[0032] 术语"同一类型的酵母细胞"指属于同一物种但没有增加GCRl或GCR2,或者GCRl 和GCR2的特定遗传修饰的酵母细胞，包括来自相同物种的野生型酵母细胞。
[0033] 在确认具有相同或相似功能或活性的许多不同多肤或多核巧酸时，可W使用几个 水平的序列同一性。例如，序列同一性可包括约50%或更高，约55%或更高，约60%或更 高，约65 %或更高，约70 %或更高，约75 %或更高，约80 %或更高，约85 %或更高，约90% 或更高，约95%或更