二元产物的发酵方法及其两种发酵产物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于发酵和农药领域，具体而言，本发明涉及发酵方法及其二元产物一一 发酵的奈马菌素和其发酵杂质，可用于防治植物病虫害。
【背景技术】
[0002] 奈马菌素（Nemadectin)，又称尼莫克汀，通常是由链霉发酵产生。奈马菌素本身主 要作为莫西克汀（Moxidectin)的合成中间体，很少直接使用；而莫西克汀主要作用为兽用 抗生素，用于治疗家畜线虫、蜱、蚤等寄生虫病。
[0003] 例如，中国专利申请第201110242857号公开了一种发酵生产尼莫克汀的方法，但 是其研宄仅涉及发酵液中的发酵生产尼莫克汀的方法本身。
[0004] 中国专利申请第201210414027号公开了一种尼莫克汀的提纯方法，对发酵液进 行多次萃取和结晶，用以获得纯度在90%以上的尼莫克汀，其没有研宄其他发酵液成分，事 实上提纯过程在尽可能地避免对发酵液中其他成分的获取。
[0005] 中国专利申请第201310298096号公开了一种尼莫克汀的纯化方法，将尼莫克汀 粗品在醋酸二乙胺等液态有机盐中进行结晶，可以进一步提高原尼莫克汀的纯度；中国专 利申请第201310563411号尽管采用萃取、离子交换树脂和大孔吸附树脂的不同提纯方法， 但是思路仍旧是一致的，即提供一种制备高纯度尼莫克汀的方法，仍旧尽可能地避免对发 酵液中其他成分的获取。
[0006] 综上所述，由于奈马菌素本身直接使用的效果有限，主要作为莫西克汀的合成中 间体，所以现有技术关注获得高纯度的奈马菌素本身以便进行莫西克汀的化学合成，而缺 乏研宄奈马菌素的发酵及其中各种成分的动机。
[0007] 然而，本发明人并没有受现有技术的影响，在自己对奈马菌素的更为基础的发酵 工作的多年研宄经验的基础上，在因为产生杂质较多而根据现有技术的原则被弃用的发酵 手段中继续研宄，尽管杂质较多，但是本发明人没有为了获取高纯度的奈马菌素而弃去，反 而不懈努力，十分令人意外地在发酵杂质中发现了一种高含量的杂质，其能单独和/或同 同时发酵获得的奈马菌素一起起到良好的防治病虫害的作用；而且发酵后对奈马菌素及其 发酵杂质的提纯过程简便、成本低，只需要上一次大孔吸附树脂，分别收集穿流液和洗脱液 即可，无需萃取和频繁地上柱。因此，综合考虑奈马菌素及其发酵杂质这二者，综合成本更 低、防治病虫害效果更好，便于推广应用。
【发明内容】
[0008] 本发明要解决的技术问题在于提供新的二元产物（即，两种产物）的组合物的发 酵方法及其发酵制备的产物和配制成的农药制剂等。另外，本发明要解决的技术问题在于 提供不同产物中的成分及抗病虫害应用等。
[0009] 具体而言，在第一方面，本发明提供了两种产物的同时发酵方法，其包括：
[0010] (1)将链霉菌接种于种子培养基（优选所述种子培养基的配方：葡萄糖20g，蔗糖 l〇g，大豆粉22g，酵母粉5g，MgS04 lg，pH6.8,用蒸馏水定容至1L)中培养（优选以30°C培 养），得菌种活化物；
[0011] ⑵将菌种活化物接种于扩大培养基（优选所述扩大培养基的配方：葡萄糖20g， 鹿糖20g，大豆粉25g，酵母粉8g，MgS0 4 lg，CaC03 lg，pH6. 8,用蒸馏水定容至1L)中培养 (优选以30 °C培养），得扩大培养物；
[0012] (3)将扩大培养物接种于发酵培养基（优选所述发酵培养基的配方：葡萄糖5g，蔗 糖 l〇g，玉米粉 50g，大豆粉 30g，MgS04 lg，CaC03 lg，NaCl lg，K2HP04 2g，生物素 0? 05g，pH 6. 5,用蒸馏水定容至1L)中培养（优选以28°C培养），得发酵培养物；
[0013] (4)过滤发酵培养物，保留菌体，加入有机溶剂（优选是醇，如甲醇或乙醇），浸提 后过滤，收集滤液并加水稀释有机溶剂（优选稀释有机溶剂浓度至55~75% (V/V))并 上样于大孔吸附树脂层析柱，用水洗脱并收集穿流液，任选进行干燥，获得含杂质A的组合 物；和，
[0014] (5)用水洗脱后，用甲苯洗脱并收集洗脱液，任选进行干燥，获得含奈马菌素的组 合物。
[0015] 经本发明人摸索，本发明第一方面的发酵方法比较简便、成本低，尤其是只用了一 个层析柱就可以同时获得两种产物一一含杂质A的组合物和含奈马菌素的组合物。因此， 优选本发明第一方面的发酵方法包括且仅包括使用一个层析的步骤。
[0016] 优选在本发明第一方面的发酵方法中，种子培养基的体积 <扩大培养基的体 积< 发酵培养基的体积。更优选地，种子培养基、扩大培养基和发酵培养基的体积比为 1 : 15 ~25 : 100 ~200。
[0017]在本发明第一方面的发酵方法中，步骤（1)、步骤（2)和步骤（3)的培养时间可以 分别是12~48小时，优选是16~36小时，如20~30小时。另外，步骤（1)、步骤⑵和 步骤（3)的培养可以是震荡培养，防止菌体凝聚。
[0018] 优选在本发明第一方面的发酵方法中，在步骤（4)中，菌体的重量和有机溶剂的 体积之比（g/mL)为1 : 2~9,优选为1 : 3~7。
[0019] 经本发明人摸索的本发明第一方面的发酵方法的二元产物之一--含奈马菌素 的组合物中奈马菌素的纯度高，能达到90%左右的水平，达到了能作为合成原料而用于合 成莫西克汀的水平。所以，优选本发明第一方面的发酵方法还包括用该含奈马菌素的组合 物合成莫西克汀的步骤。这是现有技术中使用奈马菌素的焦点，在此不再赘述。另外，优选 在本发明第一方面的发酵方法中，奈马菌素的纯度为80~95%，优选为85~93%。
[0020] 在本文中，如无相反指示，组合物中物质的纯度即为该组合物经干燥后（即扣除 溶剂后）的该物质的含量，指的是通过面积归一法对组合物的HPLC图谱中该物质的峰面积 所占所有峰面积的比例而计算出来的，通常用百分比来表示，这对于本领域技术米说是能 熟练操作的，事实上，一些商品化的HPLC仪可以直接提供该纯度/含量。该纯度含量基本 等于摩尔百分比含量。
[0021] 另外，本发明人还令人意外地发现了，本发明第一方面的发酵方法还能获得杂质A 或含其的组合物，该杂质本身就具有防治植物病虫害的作用，而且还能配合奈马菌素在防 治植物病虫害中起增效的作用。所以，本发明也提供了本发明第一方面的发酵方法的二元 产物之一--含杂质A的组合物，优选其由本发明第一方面的发酵方法制备，也优选经本发 明第一方面的发酵方法制备获得含杂质A的组合物后再进一步提纯出杂质A。考虑到成本 因素，直接应用含杂质A的组合物是更优选的。优选在本发明第一方面的发酵方法中，含杂 质A的组合物中杂质A的纯度为40~75%，优选为55~65%。该纯度的含杂质A的组合 物已经足以具有防治植物病虫害的作用了。
[0022] 尽管还没有解析出杂质A的化学结构，但是杂质A是客观确定的。为了清楚起见， 在本文中，杂质A被定义为在本发明第一方面的发酵方法制备的含杂质A的组合物的HPLC 图谱上的5~6min处的峰所对应的成分。相应地，奈马菌素也可以被定义为在本发明第一 方面的发酵方法制备的含奈马菌素的组合物的HPLC图谱上的10~11. 2min处的峰所对应 的成分。
[0023] 在第二方面，本发明提供了用于防治植物病虫害的组合物，其包含奈马菌素和杂 质A。本发明第二方面的组合物是农药组合物，即向植物施用而用于防治植物病虫害的药 物。
[0024] 考虑到成本因素，可以不提纯奈马菌素和/或杂质A而直接复配含其的组合物。所 以，优选本发明第二方面的组合物包含含奈马菌素的组合物和含杂质A的组合物。更优选 地，其中，含奈马菌素的组合物和/或含杂质A的组合物是由本发明第一方面的发酵方法制 备的。
[0025] 本发明第二方面的组合物还可以含有其他杂质，事实上，即使本发明的杂质B也 是有益的，其中杂质B被定义为在本发明第一方面的发酵方法制备的滤液的HPLC图谱上的 8. 8~9. 8min处的峰所对应的成分。优选在本发明第二方面的组合物中，奈马菌素和杂质 A的含量比为1~10 : 1~10,优选为5~9 : 1~5。
[0026] 在第三方面，本发明提供了农药制剂，其包括本发明第二方面的组合物和农药上 可接受的助剂。农药制剂是有形的产物，可以是水剂、乳剂、粉剂等剂型。在本文中，"农药 上可接受的助剂"指在农药中可以添加而配制形成制剂的增效剂和/或辅料。增效剂通常 是其他农药化合物或农药组合物，可以与本发明第一方面所述的农药组合物复配形成农药 制剂；而辅料通常是无抗病虫活性的试剂，包括载体（如，水）、乳化剂、稳定剂、填充剂等。
[0027] 在第四方面，本发明提供了杂质A在防治植物病虫害（优选是蜱螨目昆虫、鳞翅目 昆虫、线虫，如螨虫）中的应用；相应地，本发明还提供了杂质A在制备用于防治植物病虫害 (优选是蜱螨目昆虫、鳞翅目昆虫、线虫，如螨虫）的农药组合物（如，本发明第二方面的组 合物）或农药制剂（如，本发明第三方面的农药制剂）中的应用。
[0028] 优选本发明第四方面的应用是联合的应用，即，杂质A同其他物质联合在防治植 物病虫害中的应用，或，杂质A同其他物质联合在制备用于防治植物病虫害的农药组合物 或农药制剂中的应用。更优选地，本发明第四方面的应用是联合奈马菌素的应用，即其他物 质是奈马菌素。更加优选地，其中，奈马菌素和杂质A的含量比为1~10 : 1~10,优选为 5~9 : 1~5〇
[0029] 在第五方面，本发明提供了鉴定本发明第二方面的组合物或本发明第三方面的农 药制剂的方法，其包括进行HPLC检测的步骤。如果检测出含有奈马菌素（即，HPLC图谱上 具有10~11. 2min处的峰），并且检测出含有杂质A( g卩，HPLC图谱上具有5~6min处的 峰），则可以认定是本发明第二方面的组合物或本发明第三方面的农药制剂。优选可以进 一步检测各成分的含量，判断奈马菌素和杂质A的含量比是否为1~10 : 1~10,优选为 5~9 : 1~5〇
[0030] 本发明具有以下有益效果：通过较简便、低成本的发酵方法能