专利名称：一种tag代谢障碍型肥胖酵母模型的构建方法
技术领域：
本发明属于酵母模型的构建领域，特别涉及一种TAG代谢障碍型肥胖酵母模型的构建方法。
背景技术：
现有的降脂药物筛选肥胖模型主要有(l)DIO(Diet-1nduced Obese)模型，其特点是:通过给动物长期大量喂食高脂肪、高糖和高蛋白饲料，最终诱发肥胖及肥胖有关的代谢疾病，这一特点和部分人类肥胖的形成很相似。啮齿动物在三高饲料饲喂下很容易肥胖，是最常用的DIO研究的动物模型。这一模型的优点是能够很好的模拟人类肥胖，具有高度的相似性，能够为药物的动物试验及临床试验提供依据，缺点是周期长，成本高，操作繁杂，且约一半的动物因存在食物抵抗并不能被诱导成肥胖模型，无满足大规模高通量筛选的要求，因此不能作为降脂药物筛选平台。(2)下丘脑型肥胖模型，这类模型包括谷氨酸钠和金硫葡萄糖诱发的肥胖动物模型，下丘脑控制的内分泌活动与肥胖的产生极其相关，通过注射谷氨酸钠(MSG)能够使下丘脑结节漏斗出多巴胺系统受损而致内分泌等功能低下，造成肥胖。而注射金硫葡萄糖(GTG)则直接损伤下丘脑弓状核(ANH)，促使动物多食，间而体重增加，血中TAG升高。这类模型克服了动物因食物抵抗而无法诱导成肥胖模型的问题，保证了模型建立的成功率，但依然没有解决成本高，筛选规模小，周期长的缺点。(3)基因改造肥胖动物模型，这类模型主要是通过基因敲除脂类代谢相关基因造成营养代谢障碍来建立肥胖模型，如营养障碍性脂肪肝(fatty liver dystrophy)小鼠,这类模型的优点是,不用通过饲喂大量高脂高糖食物来诱导肥胖，能够深入细致地明确一个或几个基因的在肥胖形成中作用。不足之处为肥胖问题属多基因多因素所致，而非少数基因的作用，并且模型建立技术复杂、成本高、周期长。另外，由于动物本身遗传背景和修饰基因的不同，不一定会出现预期的表型。酵母作为高等真核生物特别是人类基因研究的模式生物，1970年就曾报道酵母与人类着色性干皮病子核苷酸切除修复途径上相似，而1990年发现人类着色性干皮病相关基因Xro与酵母RAD3有极高的同源性，Francoise等研究的人类170个基因中，其中42%与酵母基因有明显的同源性。以酵母作为人类疾病模型有其独到的优势，2003年首个帕金森氏症酵母模型诞生，而到2006年，Liebman通过阿兹海默症酵母模型高通量筛选，识别出能够抑制A-beta独立聚集小分子，从而阻止了阿兹海默症A-beta蛋白块的形成，达到治疗的目的。以酵母为模型的人类疾病研究具有同源性高，易于建立，成本低，运行周期短，操作简便，可大规模筛选等优势，具有上述几种模型无可替代的作用。迄今未见有关肥胖相关酵母模型的建立，尚不存在用酵母肥胖模型筛选降脂药物的案例。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种TAG代谢障碍型肥胖酵母模型的构建方法，该方法构建出的肥胖酵母模型主要有实验周期短，建设成本低，运行耗费少，操作简便等优势；能够为酵母和人类脂类代谢机制研究及降脂药效评价提供平台，是一个高效而可靠，简便快捷的降脂药物筛选模型。本发明的一种TAG代谢障碍型肥胖酵母模型的构建方法，包括:(1)以酿酒酵母ΒΥ4742α作为敲除对象，设计含有酿酒酵母基因组上TGL3和TGL4基因上下游同源序列的引物，利用PCR技术，以PRS400系列质粒为模板，扩增出含有筛选标记的DNA片段；通过酿酒酵母电转化技术，将该DNA片段转入酿酒酵母中，利用筛选型培养基筛选出成功敲除的酵母；(2)利用Gap repair技术获取PAHl表达质粒YEplacl95_PAHl:利用PCR技术扩增获取PAHl上下游序列，并通过在扩增引物上分别设计上游的promoter区中的Hindlll、NOTI和下游的terminator区中的BamH1、NOTI四个酶切序列及相应的保护碱基，以三片段一次性连接的方式将PAHl上下游序列插入到表达质粒YEplacl95中；通过NOTI及terminate区上的PstI酶切位点对构建好的YEplacl95-promoter_terminator进行双酶切，创造出一个酵母难以通过自身连接修复的缺口 Gap，通过酿酒酵母电转化技术，将含有该Gap的质粒转入酵母，使酵母以自身基因组作为修复Gap的模板，将PAHl基因复制到质粒中；通过筛选平板剔去没有成功复制PAHl或修复YEplacl95的酵母，针对筛选出来的酵母以酵母质粒提取技术进行质粒提取，并借助大肠杆菌DH5ci进行富集，得到PAHl高表达质粒 YEplacl95-PAHl ；(3)利用酿酒酵母高效转化方法将PAHl高表达质粒YEplacl95_PAHl转入TGL3和TGL4缺陷型酵母中，得到TAG代谢障碍型肥胖酵母模型。所述步骤(I)中的TGL3或TGL4基因上下游同源序列的引物序列具体为H08-F:5’-GGAGTACAGGTATATGTAATAAAAGTCTGagattgtactgagagtgcac-3’ ；H09-R:5’-TAGAGGATATATAAGCAAGCCCGTGTTTTctgtgcggtatttcacaccg-3’ ；H079-F: 5’-cgggatccGGCTCATTGCACGTTTGCAG-3’ ；H0104-R:5’-ATGTAGTGGCGTCTTGGTTC-3’ 。其中敲除TGL4基因所用引物为H08-F和H09-R，敲除TGL3基因所用引物为H079-F和 H0104-R。所述步骤(2)中利用PCR技术扩增获取PAHl上下游序列，其具体引物序列为H021-F:5’-cgggatcCGTTCGCAGTTCCTAACACTG-3’ ;H022-R:5’-ataagaatgcggccgCTATCTTCAGTAATTTCTTCC_3’H023-F:5’-ataagaatgcggccgCGATCCATACTGCATATTAA-3’H024-R:5’-acgccaagctTGGGCGTACAATAATTGCTT-3’其中PAHl上游DNA片段扩增所用引物为H021-F和H022-R，下游DNA片段扩增所用引物为H023-F和H024-R。 所述步骤(1)中的PCR反应体系为:
权利要求
1.一种TAG代谢障碍型肥胖酵母模型的构建方法，包括: Cl)以酿酒酵母BY4742ci作为敲除对象，设计含有酿酒酵母基因组上TGL3和TGL4基因上下游同源序列的引物，利用PCR技术，以PRS400系列质粒为模板，扩增出含有筛选标记的DNA片段；通过酿酒酵母电转化技术，将该DNA片段转入酿酒酵母中，利用筛选型培养基筛选TGL3TGL4双缺陷型酵母； (2)利用PCR技术扩增获取PAHl上下游序列，并通过在扩增引物上分别设计上游的promoter区中的HindII1、NOTI和下游的terminator区中的BamH1、NOTI四个酶切序列及相应的保护碱基，以三片段一次性连接的方式将PAHl上下游序列插入到表达质粒YEplacl95中；通过NOTI及terminate区上的PstI酶切位点对构建好的YEplacl95-promoter-terminator进行双酶切，创造出一个酵母难以通过自身连接修复的缺口 Gap，通过酿酒酵母电转化技术，将含有该Gap的质粒转入酵母，使酵母以自身基因组作为修复Gap的模板，将PAHl基因复制到质粒中；通过筛选平板剔去没有成功复制PAHl或修复YEplacl95的酵母，针对筛选出来的酵母以酵母质粒提取技术进行质粒提取，并借助大肠杆菌DH5 α进行富集，得到PAHl高表达质粒YEplacl95_PAHl ； (3)利用酿酒酵母高效转化方法将PAHl高表达质粒YEplacl95-PAHl转入TGL3和TGL4缺陷型酵母中，得到TAG代谢障碍型肥胖酵母模型。
2.根据权利要求1所述的一种TAG代谢障碍型肥胖酵母模型的构建方法，其特征在于:所述步骤(I)中的TGL3或TGL4基因上下游同源序列的引物序列具体为:H08-F:5’-GGAGTACAGGTATATGTAATAAAAGTCTGagattgtactgagagtgcac-3’ ；H09-R:5’-TAGAGGATATATAAGCAAGCCCGTGTTTTctgtgcggtatttcacaccg-3’ ；H079-F:5’-cgggatccGGCTCATTGCACGTTTGCAG-3’ ；`H0104-R:5’-ATGTAGTGGCGTCTTGGTTC-3’ ； 其中敲除TGL4基因所用引物为H08-F和H09-R，敲除TGL3基因所用引物为H079-F和H0104-R ； 步骤(2)中利用PCR技术扩增获取PAHl上下游序列，其具体引物序列为 H021-F:5’-cgggatcCGTTCGCAGTTCCTAACACTG-3’ ；H022-R:5’-ataagaatgcggccgCTATCTTCAGTAATTTCTTCC-3’ ；H023-F:5’-ataagaatgcggccgCGATCCATACTGCATATTAA-3’ ；H024-R:5’-acgccaagctTGGGCGTACAATAATTGCTT-3’ ； 其中PAHl上游DNA片段扩增所用引物为H021-F和H022-R，下游DNA片段扩增所用引物为 H023-F 和 H024-R。
3.根据权利要求1所述的一种TAG代谢障碍型肥胖酵母模型的构建方法，其特征在于:所述步骤(I)中的PCR体系为ddH2014.2 μ L，10XPFU PCR Buffer2 μ L，H08-F 或 H079-FlyL，H09-R 或 H0104-R1 μ L，IOmM dNTP0.3 μ L，5u/μ L PFU DNAPolymerase0.5μ L，PRS405或PRS4001 μ L ；PCR反应条件为变性温度为95°C，退火温度为55°C，72°C延伸时间为5分钟，循环次数为35 ； 步骤(2)中的 PCR 反应体系为 ddH2014.2 μ L, 10XPFU PCR Buffer2 μ L, Η021 或Η0231 μ L, Η022 或 Η0241 μ L,IOmM dNTP0.3 μ L，5u/μ L PFU DNA Polymerase0.5 μ L,Genetic DNAl μ L ;PCR反应条件为变性温度为95°C，退火温度为55°C，72°C延伸时间为I分钟，循环次数为33。
4.根据权利要求1所述的一种TAG代谢障碍型肥胖酵母模型的构建方法，其特征在于:所述步骤(I)中的筛选标记为Leu2或KanMX4筛选标记，所用筛选培养基为合成培养基，其组成为1.7g/L无氨基酵母基础氮源，1.2g/L谷氨酸、亮氨酸缺陷氨基混合物或氨基混合物加 100mg/L 的 G418。
5.根据权利要求1所述的一种TAG代谢障碍型肥胖酵母模型的构建方法，其特征在于:所述步骤(2)中的利用PCR技术所获取PAHl上下游各一段序列具体为PAHl起始密码子上游-497bp至-15bp的启动子区和PAHl终止密码子下游29bp至622bp的终止区。
6.根据权利要求1所述的一种TAG代谢障碍型肥胖酵母模型的构建方法，其特征在于:所述步骤(2)中的HindII1、NOTI和下游的terminator区中的BamH1、NOTI四个酶切序列及相应的保护碱基具体为在引物前端设计acgccaagctt序列引入HindIII酶识别位点及保护碱基，在引物前端设计ataagaatgcggccgc序列引入NOTI酶设别位点及保护碱基,设计cgggatcc引入BamHI酶识别位点及保护碱基。
7.根据权利要求1所述的一种TAG代谢障碍型肥胖酵母模型的构建方法，其特征在于:所述步骤(3)中得到的TAG代谢障碍型肥胖酵母模型应用于降脂药物的初步筛选及药效评价，具体步骤如下: 肥胖酵母模型在30°C、180rpm、合成培养基中过夜培养，次日接种到新鲜合成培养基中培养，同时加入相应浓度的待测药物进行处理，处理30小时后，酵母菌株离心收集，加入菌体等量的玻璃珠，同时加入Iml甲醇氯仿混合液，在振荡器中剧烈震荡10分钟，确保细胞充分破裂；高速离心，去除玻璃珠和菌体残渣，加入500 μ I的柠檬酸和600 μ I氯仿，充分混匀后高速离心，去除杂质，将上层上清移入真空干燥器中进行干燥；次日，用30 μ I甲醇与氯仿混合液 洗脱下来后，进行薄层色谱分析，对脂肪组分进行分析。
8.根据权利要求7所述的一种TAG代谢障碍型肥胖酵母模型的构建方法，其特征在于:所述次日接种的初始培养菌浊度0D_为0.1 0.2A。
9.根据权利要求7所述的一种TAG代谢障碍型肥胖酵母模型的构建方法，其特征在于:所述甲醇和氯仿的混合液中甲醇与氯仿体积比为2:1，所用柠檬酸的浓度为50mmol/L。
10.根据权利要求7所述的一种TAG代谢障碍型肥胖酵母模型的构建方法，其特征在于:所述薄层色谱分析的工艺参数为:硅胶板HSGF-254，2.5cm*8cm，扩展剂为体积比为40:10:1的正己烷、乙醚和甲酸。
全文摘要
本发明涉及一种TAG代谢障碍型肥胖酵母模型的构建方法，包括以酿酒酵母BY4742α单倍体为出发菌株，针对三酰甘油代谢中起主要作用的水解酶编码基因TGL3、TGL4进行敲除，同时高表达PAH1基因，人为制造TAG代谢障碍，造成胞内TAG过度积累，建立酵母肥胖模型，并利用该模型进行降脂药物的初步筛选及药效评价。本发明构建出的肥胖酵母模型主要有实验周期短，建设成本低，运行耗费少，操作简便等优势；能够为酵母和人类脂类代谢机制研究及降脂药效评价提供平台，是一个高效而可靠，简便快捷的降脂药物筛选模型。
文档编号C12N15/81GK103103211SQ201310016430
公开日2013年5月15日 申请日期2013年1月16日 优先权日2013年1月16日
发明者黄志伟, 房志家, 陈婷, 张兴群 申请人:东华大学