一种改造尿素代谢调控途径降低酿酒酵母尿素积累的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种改造尿素代谢调控途径降低酿酒酵母尿素积累的方法，属于微生 物遗传和分子生物学领域。
【背景技术】
[0002] 氨基甲酸乙酯被认为是一种对人有潜在致癌性的物质，并在1974年被国际癌症 研究机构（IARC)划为2B级的致癌化合物。此后，研究人员又发现氨基甲酸乙酯也可以直 接诱发人的肝癌，进一步促使IARC在2007年将氨基甲酸乙酯的致癌等级由2B级提升到了 2A级（与甲醛同级）。而黄酒中的氨基甲酸乙酯，已经成为危害消费者健康和影响其市场 竞争力的重要隐患。
[0003] 在清酒和黄酒中，由酿酒酵母代谢产生的尿素都是氨基甲酸乙酯最主要的前体物 质。在发酵过程中，酵母细胞内的尿素主要由精氨酸代谢产生。酿酒酵母尿素代谢的强弱 与两个特异性的激活因子Dal81p和Dal82p的活性密切相关。
[0004] DalSlp和Dal82p是酿酒酵母中尿素代谢的两个重要的激活因子，在尿素代谢基 因（DUR1，2和DUR3)的启动子上都有它们的结合区。缺少Dal81p和Dal82p的激活作用， DUR1，2和DUR3的表达量将显著的下降。为了增强菌株的尿素代谢能力，可以采取Dal81p 和Dal82p过量表达的策略。
[0005] 泛素化调控是酿酒酵母控制胞内非偏好型氮源代谢的一种方式。在偏好型氮源环 境中，非偏好型氮源的透性酶或激活因子可被泛素标记，并被转运至液泡内降解。因此，可 以通过对透性酶或激活因子上的泛素化位点进行定点突变，延长这些蛋白在胞内的存留时 间，提高非偏好型氮源的代谢速率。
【发明内容】
[0006] 本发明通过改造尿素代谢途径相关激活因子，降低了酿酒酵母发酵过程中尿素积 累，通过这种遗传改造，可以从根本上减少酿酒酵母发酵过程中尿素的积累。
[0007] 本发明的第一个目的是提供一种降低酵母尿素积累的方法，所述方法是对尿素代 谢途径调控因子Dal81p和Dal82p进行改造。
[0008] 所述改造是同时过量表达调控因子Dal82p和消除了泛素化调控位点的DalSlp。
[0009] 在本发明的一种实施方式中，所述Dal81p的泛素化调控位点指的是其第69和918 位赖氨酸（K)。
[0010] 在本发明的一种实施方式中，所述消除了泛素化调控位点的DalSlp是指将氨基 酸序列为SEQIDNO. 1的Dal81p的第69位、918位的氨基酸突变成丙氨酸。
[0011] 在本发明的一种实施方式中，所述Dal82p的氨基酸序列是SEQIDN0. 2所示的序 列。
[0012] 在本发明的一种实施方式中，所述过量表达，指的是将Dal81p__^PDal82p先 后连接到表达载体PY26-GPD-TEF上，构建表达载体pY26-Dal81pK69A,K91SA-Dal82p，并转化到 酵母中表达。
[0013] 在本发明的一种实施方式中，所述表达载体pY26-GPD-TEF的核苷酸序列是SEQID NO. 11所示的序列。
[0014] 在本发明的一种实施方式中，所述方法具体是：将氨基酸序列为SEQID NO. 1的Dal81p的第69位、918位的氨基酸突变成丙氨酸得到Dal81p K69A, K918A?再将 Dal82pDal81pK69A,_#氨基酸序列为SEQIDN0. 2的Dal82p先后连接到表达载体PY26-GPD-TEF上，构建得到重组载体pY26-Dal81pK69A,K91SA-Dal82p，并将重组载体转化到宿 主酵母中表达。
[0015] 在本发明的一种实施方式中，所述宿主酵母是酿酒酵母。
[0016] 在本发明的一种实施方式中，所述宿主酵母是酿酒酵母CEN.PK2_lC(MATa; ura3-52 ;trpl-289 ;leu2-3_112 ;his3A1 ;MAL2-8c;SUC2)单倍体模式菌株。
[0017] 本发明的第二个目的是提供一种尿素积累能力降低的酵母，所述酵母过表达调控 因子Dal82p和消除了泛素化位点的Dal81p。
[0018] 在本发明的一种实施方式中，所述酵母的构建方法是：（1)将氨基酸序列为SEQ 10勵.1的0&181?的第69位、918位的氨基酸突变成丙氨酸得到0 &181?K69A，K918A;(2) 将Dal82pDal81pK69A,K91SA和氨基酸序列为SEQIDNO. 2的Dal82p先后连接到表达载体 PY26-GPD-TEF上，构建得到重组载体pY26-Dal81pK69A,K91SA-Dal82p; (3)将重组载体转化到 宿主酵母中表达。
[0019] 在本发明的一种实施方式中，所述宿主酵母是酿酒酵母，可以是酿酒酵母CEN. PK2-lC〇
[0020] 本发明还要求保护所述酵母在食品方面的应用。
[0021] 所述的尿素积累减少，指的是基因工程菌株相对于野生菌株，在偏好型氮源阻遏 培养基中尿素的积累情况。偏好型氮源阻遏培养基指的是在YNB培养基中添加了酿酒酵母 偏好型氮源。
[0022] 本发明的有益之处：本发明对酿酒酵母尿素代谢途径相关激活因子进行了遗传改 造，通过对2个激活因子的改造，尿素积累量分别减少了 55. 7%。通过对酿酒酵母的这种遗 传改造，可以从根本上较少酿酒酵母发酵过程中尿素的积累。
【附图说明】
[0023] 图1 :代谢改造Dal81p和Dal82p对菌株尿素利用情况的影响。
【具体实施方式】
[0024] 尿素的检测方法参考文献KnorstMT,NeubertR,WohlrabW.Analyticalmethods formeasuringureainpharmaceuticalformulations.JournalofPharmaceuticaland BiomedicalAnalysis15, 1627-1632 (1997)。
[0025] 材料与方法
[0026] 本发明所用酿酒酵母菌株为CEN.PK2-lC(MATa;ura3-52 ;trpl-289 ;leu2-3_112 ; his3Al;MAL2-8%SUC2)单倍体模式菌株，其他操作均为常规分子生物学操作。
[0027] 大肠杆菌的培养使用LB培养基，酿酒酵母的活化使用YH)培养基，酿酒酵母尿素 利用情况使用使用偏好型氮源阻遏培养基。这些培养基的配方如下。
[0028] LB培养基：10g·L1蛋白胨，5g·L1酵母浸膏，10g·LWaCl，ρΗ7· 4。筛选 E.coliJM109转化子时，培养基中添加氨苄青霉素100μg·mLS
[0029] YPD培养基：20g·L1蛋白胨，lOg·L1酉孝母浸膏，20g·L1葡萄糖；
[0030] 酵母转化筛选培养基：1. 7g·LiNB合成培养基（无氨基酸和硫酸铵），20g·L1 葡萄糖，lOmmol·L1硫酸铵，40mg·L1组氨酸，40mg·L1色氨酸，40mg·L1亮氨酸；
[0031] 偏好型氮源阻遏培养基：1. 7g*LWNB合成培养基（无氨基酸和硫酸铵），20g*L1 葡萄糖，lOmmol·L1谷氨酰胺，lOmmol·L1 (尿素或其他单一的非偏好型氮源）。培养不同 的营养缺陷型基因工程菌株时，需补加菌株生长所必需的氨基酸或尿嘧啶（40mg·L3。 [0032] 实施例1
[0033] Dal81p泛素化位点的消除：使用MutanBESTkit定点突变试剂盒将氨基酸序列为 SEQIDNO. 1的Dal81p序列上的第69位和第918位的赖氨酸（K)位点突变为丙氨酸（A)， 所用引用见表1。
[0034] 表1Dal81p上泛素化位点定点突变引物
[0035]
[0036] 将突变产物连接至克隆载体pMD-19TSimple，转化大肠杆菌JM109。挑取阳性转 化子，经Sanger测序验证正确的用于下一步的过量表达。
[0037] Dal8lpK69A,K91SA^PIDal82p表达载体的构建：设计引物扩增得至丨」DALS1 K69A, K918A和氨基 酸序列如SEQIDNO. 2的DAL82基因（正向引物添加SmaI或NotI限制性内切酶酶切位 点；反向引物添加HindIII或BglII限制性内切酶酶切位点）（见表2)。通过酶切-连 接的方式，将DAL81__a和DAL82分别先后亚克隆至表达载体pY26-GPD-TEF上，构建重 组载体pY26-Dal8lpK69A,K91SA-Dal82p〇
[0038] 表 2 扩增DAL81K69A,_JPDAL82 基因的引物
[0039]
[0040] 将重组载体转化酿酒酵母CEN.PK2-1C，在酵母转化筛选培养基上挑取阳性转化 子，用于尿素利用情况的进一步研究。
[0041] 将基因工程菌株和对照菌株（未经改造的菌株），经30°C摇床（200r/min)培养 24h活化后，接种至偏好型氮源阻遏培养基中，在30°C摇床（200r/min)的条件下培养48h， 其间每隔8h检测培养基中尿素的利用情况。
[0042] 对酿酒酵母基因工程菌株CEN.PK2-lC(pY26-Dal81pK69A,K91SA-Dal82p)和对照菌株 在真实的发酵条件下，尿素利用情况进行检测。在添加了尿素的偏好型氮源阻遏培养基中， 检测了 48h发酵过程中尿素含量的变化情况，实验结果如图1所示。结果表明，48h后检测 的尿素含量比对照菌株分别下降了 55. 7%。
[0043] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种降低酵母尿素积累的方法，其特征在于，所述方法是对尿素代谢途径调控因子 Dal81p和Dal82p进行改造。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述改造是同时过量表达调控因子 Dal82p和消除了泛素化调控位点的DalSlp。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述消除了泛素化调控位点的DalSlp是 指将氨基酸序列为SEQIDNO. 1的Dal81p的第69位、918位的氨基酸突变成丙氨酸。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Dal82p的氨基酸序列是SEQIDNO. 2 所示的序列。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具体是：将氨基酸序列为 SEQIDNO. 1的Dal81p的第69位、918位的氨基酸突变成丙氨酸得到Dal81p_A,K9m，再 将Dal82pDal81pK69A,K91SA和氨基酸序列为SEQIDNO. 2的Dal82p先后连接到表达载体 PY26-GPD-TEF上，构建得到重组载体pY26-Dal81pK69A,K91SA-Dal82p，并将重组载体转化到酵 母中表达。6. 根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于，所述酵母是酿酒酵母。7. -种尿素积累能力降低的酵母，其特征在于，所述酵母过表达调控因子Dal82p和消 除了泛素化位点的Dal81p。8. 根据权利要求7所述的酵母，其特征在于，所述酵母的构建方法是：（1)将氨基酸序 列为SEQIDNO. 1的Dal81p的第69位、918位的氨基酸突变成丙氨酸得到Dal81p_A,K91SA; (2)将Dal82pDal81pK69A,K91SA和氨基酸序列为SEQIDNO. 2的Dal82p先后连接到表达载体PY26-GPD-TEF上，构建得到重组载体pY26-Dal81pK69A,K91SA-Dal82p; (3)将重组载体转化到 酵母中表达。9. 根据权利要求7或8所述的酵母，其特征在于，所述酵母是酿酒酵母。10. 权利要求7所述酵母在食品方面的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种改造尿素代谢调控途径降低酿酒酵母尿素积累的方法，属于微生物遗传和分子生物学领域。本发明方法是对尿素代谢途径相关激活因子的改造，具体是在消除Dal81p的泛素化调控位点的基础上，对Dal81pK69A,K918A和Dal82p进行过量表达。按照本发明方法对酿酒酵母尿素代谢途径相关激活因子进行遗传改造后，可以从根本上较少酿酒酵母发酵过程中尿素的积累，尿素积累量减少了55.7％。
【IPC分类】C12N1/19, C12N15/81, C12R1/865
【公开号】CN105274133
【申请号】CN201510816366
【发明人】周景文, 陈坚, 堵国成, 吕永坤, 赵鑫锐
【申请人】江南大学
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2015年11月20日