专利名称：：动植物或微生物代谢物或海水中活性成分的降幂筛选方法
技术领域：
：本发明涉及一种动植物或微生物代谢物或海水中活性成分的降幂筛选方法。
背景技术：
：目前分离筛选动植物或微生物代谢物或海水中活性成分常用的方法很多。按现有的分离筛选方法，例如将涉及l(T种成分的样品进行分离筛选，必须先将该样品中1()M个组分分离，然后对10M个组分分别用筛选模型(如生物培养筛选模型、体外抗肿瘤培养筛选模型、生物抗菌培养筛选模型等等)实验进行篩选，尽管筛选出的是一种活性最强的成分，但其他10M-1种组分的分离筛选实验必须全部进行，程序复杂，工作繁重，费时费力
发明内容本发明的目的是提供一种动植物或微生物代谢物或海水中活性成分的降幂筛选方法，它能克服现有技术上的上述缺点。一种动植物或微生物代谢物或海水中活性成分的降幂筛选方法，其特征是将含有待降幂筛选活性成分的样品，用公知的纸色谱或薄层色谱或电泳展开；将纸色谱的纸或薄层色谱上的涂布层或凝胶电泳上的凝胶分成N份，再将N份中的每份分成二部分，成为2N份，将其中N份分别用公知的筛选模型实验进行筛选；将另N份保存备用；用筛选模型实验筛选出促进生长或抑制生长的活性最高的第X份或活性较高的第Y份，用气相色谱-质谱联用仪对第X份或第Y份进行成分检测；如果检测出的成分不单一，可将备用的第X份或第Y份再进行同样的筛选，直至用气相色谱-质谱联用仪、核磁共振仪及红外光谱仪鉴定出所需要的活性成分结构为止。本发明的优点在于样品中含有NM种成分，每次分为N份，按本发明的方法进行M次降幂筛选，组分由N"降为N"即一个，只须做NM个模型筛选实验，不必做N"个模型筛选实验就可将最强的活性成分筛选鉴定出来，用的装置简单，省时省力，快捷准确，能提高工作效率；应用领域广泛；市场前景及产业化后经济、社会效益可观。具体实施方式实施例1植物党参中促进黑曲霉真菌生长的活性成分的降幂筛选应用公知的纸色谱结合公知的生物培养筛选模型实验对植物党参中促进黑曲霉真菌生长的活性成分进行降幂篩选，实施步骤如下先制备含党参30%(重量百分浓度，下同)的党参水浸取液。将新文纸剪成20cm(宽)x30cm(高)的长方形，将其立于玻璃槽上，制成公知的纸色镨装置，用市售的微量注射器吸取上述党参水浸取液，滴加到上述的色"^普纸下沿，滴加面积为20cm(宽)xlcm(高)，以蒸镏水作为展开剂进行展开后，将上述纸色谱装置平放，凉干。将凉干后的色谱纸纵向等距离分成10份，再将各份分为二部份，每部分都为10份，同一部分中每份的面积都相同，分别标记为l1/4，13/4';21/4,2〗/4;3i/4,3〗/4，;4i〃，4〗/4;5i〃，53.,4，;61"，63/4，;7i/4,73/4';8〃4，83/4';91/4,93/4';101/4，103/4',第一部分中一份的面积为另一部份中一份面积的1/3,将其中的一组10份(l1/4，21/4,31/4,41/4，51/4,61/4,71/4,81/4,91/4,101/4)分别放于含有10%葡萄糖的黑曲霉培养液中，灭菌后接入黑曲霉菌种，使其在黑曲霉培养液中的浓度为1%，于35。C有氧培养24h，对照组采用同样大小的本底纸。其余的10份(13/4,，2s/4，,〗3/4，43/4，，53/4，，6'3/4，73/4，,83/4，,93/4'，10〗/4，)置无菌箱中保存备用。用紫外吸收光谱法测定培养液中还原糖的浓度，还原糖的浓度用公知的3,5—二硝基水杨酸比色法检测，检测结果第7!/4份色谱纸的实验组与对照组比较OD54Qn值最低，第7:/4份活性最高。用气相色谱-质谱联用仪测定第71/4份色谱纸上的成分不单一。重复上述分离筛选实验，用备用的第73/4'份色谱纸，制备出水浸取液，用上述同样的纸色谱装置展开，将色谱纸再等分成10份，，每部分都为10份，再将各份分为二部份，同一部分中每份的面积都相同，分别标记为l/4，I3/4;2〃4,23/4;3〃4，〗3/4;4i/4,43/4，;5〃4，53〃，;6〃4，6〗/4，;71/4，73/4';81/4,83/4';91/4，93/4';101/4,103/4'，第一部分中一份的面积为另一部份中一份面积的1/3，将其中的一组IO份(l1/4，21/4,31/4,41/4，51/4，61/4，71/4,81/4，91/4，101/4)分别放于黑曲霉培养液中，灭菌后接入黑曲霉菌种，使其在黑曲霉培养液中的浓度为1%,于35。C有氧培养24h，对照组采用同样大小的本底纸。其余的10份(13/4',23/4',33/4',43/4',53/4',6'3/4，73/4'，83/4',93/4',103/4')置于无菌操作箱中保存备用，筛选结果对黑曲霉增殖最大的是其中的第41/4份。用气相色谱-质谱联用初步测定第41/4份的成分不单一。再用无菌箱保存的对应的第43/4'份色谱纸制备出水浸取液，用上述同样的纸色谱装置展开，重复上述筛选实验，筛选结果以第51/4份对黑曲霉增殖最大。将备用的第53/4'份再进行同上述步骤的降幂筛选后，取对黑曲霉增殖最大的一份，用丙酮提取活性成分，用气相色镨-质谱联用仪,、核磁共振仪及红外光语仪鉴定出对黑曲霉增殖最大的活性成分结构。'本实施例通过党参植物水浸取液促进黑曲霉生长的培养降幂筛选实验，依据黑曲霉的增殖速率，筛选出化感作用最强或较强的植物天然成分，根据党参活性成分的结构进行化感机理探讨。用于黑曲霉发酵生产葡萄糖酸，能缩短发酵周期，达到节能降耗的目的。上述方法不仅应用于物种之间产生化感作用的活性成分的降幂筛选，还可用于抗肿瘤中草药活性成分的降幂筛选，也可用于癌症多发地区的病因普查、海洋和淡水系及污泥中抗癌、抗菌药物活性成分的降幂筛选。上述方法的建立对国际通行标准促进大宗中药材、化学及生物合成新药、中成药与以中药材为原料出口的新产品质量标准提供了应用及分析方法；对于中药制药筛选研究，建立既符合中医药传统理^仑又能与国际新药标准中药制备工艺、中药质量控制、药理药效学评价、安全性评价提供了应用及分析方法，具有广阔应用前景。实施例2植物栝楼中促进光合细菌生长的活性成分的降幂筛选应用公知的薄层色i普法结合公知的生物培养筛选模型实验对植物栝楼中促进光合细菌生长的活性成分进行降幂筛选，实施步骤如下先制备30%栝楼水浸取液，再将长方形玻璃板20cm(宽)x25cm(高)用蒸馏水沖洗。将颗粒直径为20-25纳米的市售的二氧化硅溶胶与聚乙烯醇水溶液的混合物(两者的重量比为1:1)涂布于玻璃板上，制成公知的薄层色谱装置，用市售的微量注射器吸取栝楼水浸取液滴加到薄层涂布物下沿，滴加面积为20cm(宽)xicm(高)，'以蒸馏水作为展开剂进行展开后，将薄层色谱装置平放，凉干。将凉干后的薄层涂布物层从上述玻璃板上取下，然后纵向等距离分成10份，再将各份分为二部份，每部分都为10份，同一部分中每份的面积都相同，分另l)才示"i己为li/4,2丄/4，2s/4，;3〃4,33/4，;4i,4,43/4，;5〃4,53/4，;61/4，63/4，;7〃4,73/4，;81/4,83//;91/4,93/4';101/4,103/4',第一部分中一份的面积为另一部份中一份面积的1/3，将其中的一组IO份(11/4,2l/4，3i/4,4i/4,5i/4，61/4，7〃4，81/4，91/4,101/4)分别放于灭菌后的光合细菌培养液中，接入光合细菌菌种，使其在光合细菌培养液中的浓度为10%,于35。C经24h的无氧培养，对照组采用同样大小的薄层本底涂布物，其余的10份(13,4',23/4',33/4',43/4',53/4'，6'3/4，73/4',83/4',93/4',103/4')置无菌操作箱中保存备用。用紫外吸收光谱法测定光合细菌培养液的吸光度，用OD"』值依据公式N=(7.62xOD66。nm+0.146)x109计算光合细菌的数量，实验组与对照组比较，0D6,m值为第5!/4份最高。用气相色谱-质谱联用仪测定第51/4份的成分不单一。重复上述分离筛选实验，用与光合细菌增殖最大的对应的第53/4'份制备出水浸取液，用上述同样薄层色谱展开，将薄层色谱涂布层再等分成10份，再将各份分为二部份，每部分都为10份，同"部分中每份的面积都相同，分别标记为11/4，13/4';21/4,23/4';31/4,33/4';4i"，4^/4;5〃4,5〗/4;6〃4,63/4;7"4，7〗/4;8i/4,83//;9i",93/4';101/4，103/4',第一部分中的一份的面积为另一部份中一份的面积的1/3，将其中的一组10份(11/4，21/4,31/4，41/4,51/4,61/4，71/4,81/4，91/4,101/4)分别放于培养液中，灭菌后接入光合细菌菌种，使其在光合细菌培养液中的浓度为10%,于35。C无氧培养24h,对照组采用同样大小的薄层本底涂布物。其余的10份(13/4'，23/4',33/4',43/4'，5〗/4',6'3/4,73/4，,83/4',93/4',103/4')于无菌操作箱中备用，筛选结果为第81/4份对光合细菌增殖最大。用气相色语-质镨联用测定第81/4份的成分不单一。再用对应的无菌箱保存的薄层第83/4'份制备出水浸取液，再进行上述同样的降幂筛选实验，结果对光合细菌生长的影响以第41/4份为最好，第61/4份次之，第61/4份视为促进作用较强的活性成分。用备用的第43/4'份和第63/4'份分别制备出水浸取液，再进行同上述步骤的降幂筛选后，取对光合细菌增殖最大和较大的二份分别用丙酮浸取天然活性成分，用气相色谱-质谱联用仪、核磁共振仪及红外光i普仪鉴定出活性成分结构，活性成分是1—十八烷烯。本实施例对于建立中医药理论和疗效的中医药数据获取、中药复方多成分、多靶点、整体作用的研究提供了应用及分析方法；对建立中药多成分体系质量控制，评价方法及技术标准制订提供了应用及参考方法，具有广泛应用前景。实施例3植物半枝莲中抑制肿瘤细胞活性成分的降幂筛选，本实施例应用公知的薄层色谱法结合公知的S18Q抗肿瘤体外细胞培养筛选模型，对植物半枝莲中抑制癌细胞Sm生长的活性成分进行降幂筛选，实施步骤如下先制备浓度为30%的半枝莲水浸取液，再将长方形玻璃板20cm(宽)x25cm(高)用蒸馏水清洗。将市酬的颗粒直径为20-25纳米的市售二氧化硅溶胶与聚乙烯醇水溶液的混合物(两者的重量比为1:l)涂布于玻璃板上，制成公知的薄层色谱装置，用市售的微量注射器吸取半枝莲水浸取液滴加到薄层涂布物的下沿，滴加面积为20cm(宽)x1cm(高)，以蒸馏水作为展开剂进行展开后，将薄层色谱装置平放，凉干。将凉干后的薄层涂布物层从玻璃板上取下，然后纵向等距离分成8份，再将各份分为二部份，每部分都为8份，同一部分中每份的面积都相同，分别标记为11/4,13/4';21/4,23/4';31/4,.33/4';41/4，43/4';51/4，53/4';61/4,63/4';71/4，73/4';81/4，83/4'，第一部分中一份的面积为另一部份中一份面积的1/3，将其中的一组8份(11/4,21/4,31/4,41/4,51/4,61/4,71/4，81/4)进行公知的Su。体外实验。取接种Su。小鼠腹水，无菌培养，3天传代一次，传至6代后供实验使用。调S18。浓度为1Xl()5个/ml。用公知的方法布板每组4个复孔；对照组(0浓度)将100ml细胞水悬液加入到100ml培养基；阳性组将'100ml细胞水悬液加入到100ml培养基，稀释conA100ml;实验组将100ml细胞水悬液加入到100ml培养基，分别加入到8份(11/4,21/4,8:/4)中，培养68h后，向每孑L力口入iaTT，4h后加酸化异丙醇溶解，对照组采用同样大小的薄层本底涂布物。其余的8份(13/4',23/4'，33/4'，43/4'，53/4'，6'3/4，73/4'，83/4')置无菌操作箱中保存备用。用酶标仪于570nm波长测定培养液吸光度进行筛选，筛选结果与对照组比较为第51/4份抑制作用最强。用气相色谱-质谱联用仪测得第51/4份的成分不单一。将与之对应的第53/4'份备用的薄层涂布层制得水浸取液，重复上述降幂筛选实验，进行上述薄层色谱法展开后，将薄层涂布物层等分成5份，再将各份分为二部份，每部分都为5份，同一部分中每份的面积都相同，分别标记为A1/4，A3/4';B1/4，B3/4';C1/4,C'3/4;D1/4,D3/4';E1/4,E3/4'，第一部分中一份面积为另一部份中一份面积的1/3。将其中的5份(A1/4,B1/4，C1/4，D山，E1/4)进行上述Su。体外实验筛选，对照组采用同样大小的薄层本底涂布物。其余的5份(A3/4，,B3/4'，C3/4'，D3/4'，E3/4')置无菌操作箱中备用，筛选结果为C山份抑制作用最大。用气相色谱-质谱联用仪测得第Ci/4份的成分不单一。将对应的在无菌箱中保存的C3/4'制得水浸取液，再进行上述同样的降幂筛选实验，将薄层涂布层等分成10份，重复上述Sm体外筛选实验，筛选结果以第91/4份为最好。用备用的93/4'份再制出水浸取液，进行与上述步骤相同的降幂筛选后，取对Sm抑制作用最强的一组用丙酮浸取天然活性成分，用气相色谱-质谱联用仪、核磁共振仪及红外光谱仪鉴定出半枝莲抑制Su。活性成分的结构。本实施例对于治疗肿瘤、重大传染性疾病(病毒)、内分泌及代谢性疾病等的中药有效单体研究提供了应用及参考方法。实施例4促进T细胞生长的海水中活性成分(包括微生物菌落群的代谢产物)的降幂筛选本实施例应用公知的凝胶电泳分离细菌方法结合体外细胞培养筛选模型对海水中促进T细胞生长的海洋细菌及其代谢物进行降幂筛选，实施步骤如下取青岛市栈桥附近的海水1升，取50ml海水，在室温下，在凝胶电泳仪的凝胶层上展开。将凝胶层纵向分成8份，再将各份分为二部份，每部分都为8份，同一部分中每份的面积都相同，分别标记为11/4,]3/4，;2〃4，2〗/4;3"4,3〗/4;4〃4,43/4';5"4,5〗/4;'6"4，63/4，;7〃4，73/4';81/4,3/48',第一部分中一份面积为另一部份中一份面积的1/3。取li/4—8i/4(ll/4，2"4，3i/4，4i/4,5i/4，61/4，7i/4，81/4)份进行T细胞体外培养实验，将其他13/4'-8'3/4(13/4',23/4',33/4，，43/4'，53/4'，63/4'，73/4',83/4')份置无菌箱内贮存，以备再进一步实验。应用公知的T细胞体外培养实验筛选模型的操作流程，制备T细胞的水悬液，无菌取胸腺，应用公知的方法制备T细胞的水悬液，调T细胞浓度为5Xl()6个/ml，用公知的方法布板每组4个复孔；对照组(0浓度)将100mlT细胞水悬液加入到100ml培养基；阳性组将100mlT细胞水悬液加入到100ml培养基，稀释conA100ml;实验组将100mlT细胞水悬液加入到100ml培养基，分别加入到8份(11/4,21/4，31/4，4m，51/4,61/4,71/4，81/4)中，培养68h后，向每孑L力口入jnTT，4h后加酸化异丙醇，溶解后，用酶标仪于570nm波长测试T细胞培养液吸光度，将实验样与对照样吸光度对比进行筛选。按上述步骤重复降幂筛选2次。结果114，n5,ns组分经鉴定为光合细菌。如表l所示n4组光合细菌及其代谢产物对T细胞有明显的促进作用(p<0.05);n5及ns组的光合细菌及其代谢产物对T细胞有显著的促进作用(p<0.01)。表lT细胞体外实验筛选结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>本实施例对研究中药、保健药、保健品制备及质量控制、药理药效学评价、安全性评价以及的中药、新药、保健食品毒理、保健机理研究等方面提供了应用及参考方法。实施例5促进B细胞生长的海洋活性成分(包括微生物菌落群)降幂筛选本实施例应用公知的凝胶电泳分离细菌方法结合体外细胞培养筛选模型法对海水中促进B细胞生长的海洋细菌及其代谢物进行降幂筛选，实施步骤如下取青岛市栈桥附近的海水1升，取5Qml海水，在室温下，在凝胶电泳仪的凝胶上展开。将凝胶纵向分成8份，再将各份分为二部份，每部分都为8份，同一部分中每份的面积都相同，分别标记为l1/4，1_3"';2〃4，23/4';3〃4,33"';4〃4,43"';5i"，53"';6〃4,63//;7^"，73/4';81/4,3/48'，第一部分中一份的面积为另一部份中一份面积的1/3。取li/4-8i/4(l"4，2i/4,3i/4,4i,4,5i/4,61/4，7〃4，81/4)份进行T细胞体外培养实验，将其他13/4'-83/4'份(13/4',23/4'，33/4'，43/4'，53/4'，63/4'，73/4'，83/4')置无菌箱内贮存，以备再进一步实验。应用公知的B细胞体外培养实验筛选模型的操作流程制备分离细菌方水悬液，无菌取脾，用公知方法制备B细胞的水悬液，调B细胞浓度为5X106个/ml，用公知的方法布板每组4个复孔；对照组(0浓度)将IOOml细胞水悬液加入到100ml培养基；阳性组将100m细胞水悬液加入到100ml培养基，稀释conA100ml;实-睑组将100ml细月包水悬液力口入到100ml培养基，分另'J力口入到8l分(l1/4，21/4，31/4，41/4，51/4,61/4，71/4,81/4)中，培养68h后，每孑L力口入juTT，4h后力口酸化异丙醇，溶解后，用酶标仪于570nm波长测试B细胞培养液吸先度将实验样与对照样吸光度对比进行筛选。按上述步骤重复降幂筛选2次。结果n"ns组分经鉴定为光合细菌。如表2所示116组光合细菌及其代谢产物对B细胞有明显的促进作用(p<0.05);ns组光合细菌及其代谢产物对B细胞有显著的促进作用(p<0.01)。表2B细胞体外实验筛选结果__If^照导123456780.32±0.382±0.146±0.270±0.358±0.392±0.454±0.428*0.434±0.4250.0200.0180.0200.0230.0160.0350.0310.0730.1390.140本实施例对研究中药、保健药、保健品质量控制、药理药效学评价、安全性评价以及的中药、新药、保健食品毒理、保健机理都提供了参考方法。实施例6海洋活性成分(包括微生物菌落群)对S^生长影响的降幂筛选本实施例应用公知的凝胶电泳分离细菌方法结合体外细胞培养筛选模型法对海水中抑制S18。细胞生长的海洋细菌及其代谢物进行降幂筛选，实施步骤如下取青岛市栈桥附近的海水10升，取50ml海水，在室温下，进行在凝胶电泳仪的凝胶上展开，将展开组分的凝胶纵向分成8份，再将各份分为二部份，每部分都为8份，同一部分中每份的面积都相向，分另寸才示"i己为11/4，13/4';21"，23/4,;3〃4，33/4，;4〃4，43,4，;5!/4，53/4，;61/4,63/4';71/4，73/4';81/4，3/48',第一部分中一份的面积为另一部份中一份的面积的1/3。耳又11/4—81/4(11/4,21/4，31/4,41/4，51/4，61/4，71/4,81/4)份进行Su。细胞体外培养实验，'将其他13/4'-83/4'份(13/4'，23/4'，33/4，43/4,53/4，63",73/4'，83/4')置无菌箱内贮存，以备再进一步实验。取接种Sm小鼠腹水，无菌培养，3天传代一次，传至6代后供实验使用。调Sm浓度为lXl(T个/ml。用公知的方法布板每组4个复孔；对照组(G浓度)将100mlS18。细胞水悬液加入到100ml培养基；阳性组将100mlS18。细胞水悬液加入到100ml培养基，稀释conA100ml;实验组将100mlS18。细胞水悬液加入100ml培养基，分别加入到8寸分(l1/4，21/4,31/4,41/4，51/4，61/4，71/4，81/4)中，培养68h后，向每孔加入jiTT,4h后加酸化异丙醇溶解，用酶标仪于570nm波长测试S^。培养液吸光度，按上述步骤重复降幂筛选2次。将实验样与对照样吸光度进行对比，对比结果如表3所示，实验样li/4_8i/4(li/4,2i/4,3〃4，4!/4，5i/4,61/4,7i/4,81/4)与对照样无明显差另'J,li/4,21/4,31/4，41/4,51/4,61/4,71/4,.81/4经培养鉴定为光合细菌，说明光合细菌及其代谢产物对Sm无显著的刺激增殖作用表3S180体外实验筛选结果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>本实施例将为今后天然抗癌活性成分的筛选建立方法，可与16种抗肿瘤筛选模型及若干种抗菌筛选模型相结合进行降幂筛选，有可，见的应用前景。本发明中的各实施例的具体实施步骤需要无菌操作时均在无菌操作箱内进行操作。所属的活性成分来源除上述实施例中的动植物或微生物代谢物或海水外，还可以是化学、生物合成物。权利要求1、动植物或微生物代谢物或海水中活性成分的降幂筛选方法，其特征是将含有待降幂筛选活性成分的样品，用公知的纸色谱或薄层色谱或电泳展开；将纸色谱的纸或薄层色谱上的涂布层或凝胶电泳上的凝胶分成N份，再将N份中的每份分成二部分，成为2N份，将其中N份分别用公知的筛选模型实验进行筛选；将另N份保存备用；用筛选模型实验筛选出促进生长或抑制生长的活性最高的第X份或活性较高的第Y份，用气相色谱-质谱联用仪对第X份或第Y份进行成分检测；如果检测出的成分不单一，可将备用的第X份或第Y份再进行同样的筛选，直至用气相色谱-质谱联用仪、核磁共振仪及红外光谱仪鉴定出所需要的活性成分结构为止。全文摘要一种动植物或微生物代谢物或海水中活性成分的降幂筛选方法，其特征是将含有待降幂筛选活性成分样品，用公知的纸色谱或薄层色谱或电泳展开；将纸色谱的纸或薄层色谱上的涂布层或凝胶电泳上的凝胶分成N份，再将N份中的每份分成二部分，成为2N份，将其中N份分别用公知的筛选模型实验进行筛选；将另N份保存备用；用筛选模型实验筛选出促进生长或抑制生长的活性最高的第X份或活性较高的第Y份，用气相色谱-质谱联对第X份或第Y份进行成分检测；如果成分不单一，可将备用的第X份或第Y份再进行同样的筛选实验，直至用气相色谱-质谱联用、核磁共振谱及红外光谱鉴定出所需要的活性成分结构为止。本发明装置简单，快捷准确，能提高工作效率。文档编号G01N30/02GK101419199SQ200810016549公开日2009年4月29日申请日期2008年6月1日优先权日2008年6月1日发明者李兰生申请人:李兰生