基因工程改造的代谢木糖的微生物的制作方法

基因工程改造的代谢木糖的微生物的制作方法
【专利摘要】本发明提供了使用木糖作为固定碳源来培养产油微生物的方法。还提供了经过了基因工程改造以便代谢作为固定碳源的木糖以允许其将木糖转化成油的微生物。本发明所提供的方法的特定优点包括通过利用木糖的微生物发酵方法来生产油而不是生产醇。
【专利说明】基因工程改造的代谢木糖的微生物
相关申请的交叉引用
根据美国法典35篇119条(e)款，本申请要求享有2011年5月6日提交的美国临时专利申请号61/483，550和2011年6月15日提交的美国临时专利申请号61/497，501的权益。这些申请中的每一个都以引用的方式整体并入本文。
序列表引用 本申请包括如详述结尾处所示的序列表。
政府利益
本发明在加利福尼亚州政府的支持下在加利福尼亚州能源委员会授权号PIR-08-018下完成。所述能源委员会享有本发明的某些权力。
发明领域
本发明涉及产油微生物中木糖代谢途径的表达以允许它们代谢木糖以便生产脂类或其它有用的生物质，并且涉及由所述生物质生产的油类化学品、食品、燃料以及其它产品。
发明背景
在生物技术中一个重要且困难的挑战在于释放纤维素材料中碳捕获的巨大潜能用于转化成有价值的物质如液体燃料、化学品、食品和其它产品。一个特定的挑战涉及使用通常发现于解聚的的半纤维素中的木糖作为微生物异养培养的碳源。尽管在使用酵母来将木糖用于生产乙醇方面已做了很多工作，但是大多数酵母菌株不能利用木糖抑或仅能非常低效地利用木糖(参见 Jeffries, 2006，Curr.0p.Biotech.17:320-326 ;和 Wang等，2004, Biotechnol.Lett.26(11):885-890)。
某些产油微生物(例如，产油酵母和产油微藻)能够使固定碳能源转化成更高价值的产品，如甘油三酯、脂肪酸、碳水化合物以及蛋白质。此外，微藻自身可以作为食品来源体现价值。例如，已对产油微藻的某些物种进行了基因工程改造以生产“调制油”，这意味着其甘油三酯含量显示出脂肪酸链长度和饱和度的分布相对于它们所来源的品种发生了改变。参见 PCT 公布号 2008/151149、2009/126843、2010/045358、2010/063031 和 2010/063032 以及PCT 申请号 USl 1/038，463 和 USl 1/038，464。
使用产油微生物将木糖转化成有意义量的脂类和其它产品的能力将具有重要的环境意义，因为它可降低我们对化石燃料的依赖并降低微生物油的成本。
发明概述
一方面，本发明提供了一种植物界的微生物，所述微生物包含可操作以产生活性木糖代谢途径酶的重组核酸。在一些情况下，所述微生物在基本上由木糖组成的碳源上培养时能够增加细胞数量或产生脂类。在一些情况下，所述微生物将木糖转化成甘油三酯。在一些情况下，所述微生物在使用葡萄糖作为碳源来培养时能够积累按干细胞重量计10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%的甘油三酯。在一些情况下，所述微生物在纯木糖上培养时能够积累按干细胞重量计至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%的甘油三酯。在一些情况下，所述微生物在作为碳源的葡萄糖上培养时能够积累按干细胞重量计至少50%的甘油三酯并且在纯木糖上培养时能够积累按干细胞重量计至少20%的甘油三酯。在一些情况下，所述微生物在氮限制条件下在60%为葡萄糖且40%为木糖的碳源上培养，如通过同位素示踪所测量，这些细胞产生其中碳原子的至少5%、10%、20%、30%、40%、或50%来源于木糖的碳原子的脂类。在一些情况下，所述微生物在少于或等于21天、14天或7天中在具有2.5%木糖作为唯一碳源的培养基中能够消耗至少90%的木糖。
在一些情况下，所述重组核酸可操作以编码以下一种或多种:活性木糖转运体、木酮糖-5-磷酸转运体、木糖异构酶、木酮糖激酶、木糖醇脱氢酶或木糖还原酶。在一些情况下，所述重组核酸编码可操作地连接有质体靶向信号序列的木酮糖-5-磷酸转运体并且其中所述木酮糖-5-磷酸转运体可操作以转运木酮糖-5-磷酸到质体中。在一些情况下，所述重组核酸可操作以编码(a)具有质体靶向信号序列以便使木酮糖-5-磷酸转运到质体中的木酮糖-5-磷酸转运体蛋白、(b)木酮糖激酶以及(C)木糖异构酶抑或木糖醇脱氢酶与木糖还原酶二者。
在一些情况下，所述微生物属于绿色植物亚界(subkingdom Viridiplantae)。在一些情况下，所述微生物属于绿藻下界(infrakingdom Chlorophyta)或绿藻门(phyla Chlorophytae)、属于利藻亚门(subphylum Tetraphytina)、四胞藻纲(classTrebouxiophyceae)或者小球藻目(order Chlorellale)。在一些情况下,所述微生物属于小球藻属(genus Chlorella)或原藻属(genus Prototheca)。在一些情况下,所述微生物属于桑椹形原藻或原壳小球藻种。
在一些情况下，所述微生物进一步包含可操作以改变由微生物产生的脂类的脂肪酸特性的重组修饰。在一些情况下，所述重组修饰包含编码活性酰基-ACP硫酯酶、酮脂酰-ACP合成酶或脂肪酸去饱和酶或者可操作以减少或消除酰基-ACP硫酯酶、酮脂酰-ACP合成酶或脂肪酸去饱和酶的外源基因。
另一方面，本发明提供了一种用于生产微生物生物质或者生产由生物质产生的产品的方法，其中所述方法包括如上文或本文所讨论的，在包含木糖的培养基中异养地培养重组微生物以便将木糖转化成微生物生物质。在一些情况下，所述微生物生物质包含微生物脂类。在一些情况下，所述脂类用于制造选`自由以下组成的组的产品:化学品、润滑剂、清洁剂、燃料、食用油以及化妆品成分。在一些情况下，所述产品是选自生物柴油或可再生柴油的燃料。
在一些情况下，所述培养基包含多于50%为木糖的碳源。在一些情况下，所述碳源的多于 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90% 或 95% 为木糖。
另一方面，本发明提供了一种由如上文或本文所讨论的任何微生物生产或者通过上文或本文所讨论的任何方法生产的天然油。
另一方面，本发明提供了由上文所讨论的天然油生产的油类化学品、食用油、燃料或其它产品。
另一方面，本发明提供了利用木糖作为碳源的重组产油微生物。在一个实施方案中，所述产油微生物是微藻、产油酵母、产油真菌或产油细菌。在另一个实施方案中，所述重组微生物是微藻细胞，包括但不限于原藻属细胞，其包含允许细胞利用或者更有效地利用木糖作为碳源的一个或多个外源基因。在一些实施方案中，所述细胞是桑椹形原藻、克鲁格尼原藻(Prototheca krugani)、大型原藻(Prototheca stagnora)或小型原藻(Protothecazopfii)种的品种，并且在其它实施方案中，所述细胞具有与SEQ ID No:l至9中的一个或多个具有至少70%、75%、80%、85%或95%核苷酸同一性的23S rRNA序列。所述外源基因包含可操作地连接有启动子的编码序列，并且在一些实施方案中，所述启动子是来自原藻属物种的内源性基因。在另外的实施方案中，所述编码序列编码选自由以下组成的组的蛋白质:氧化还原酶途径蛋白、木糖异构酶途径蛋白、木糖易位体蛋白和木糖转运体蛋白。
在各种实施方案中，所述微藻细胞包含允许细胞利用或者更有效地利用木糖作为碳源的一个或多个外源基因。例如，本发明的微藻细胞包括已经过工程改造以包含以下的那些细胞:(i)编码木糖异构酶途径蛋白的一个或多个基因；或者(ii)编码氧化还原酶途径蛋白的一个或多个基因；或者(iii)编码木糖异构酶途径蛋白的一个或多个基因；(iv)编码木糖转运体蛋白的一个或多个基因；或者(V)编码木糖易位体蛋白一个或多个基因；或者(i)、(ii)、(iii)、(iv)和(V)的组合。在一个实施方案中，所述微生物细胞经过工程改造以表达木糖转运体蛋白和木糖异构酶途径蛋白。在另一个实施方案中，所述微生物细胞经过工程改造以表达木糖转运体蛋白和氧化还原酶途径蛋白。在又一个实施方案中，所述微生物细胞经过工程改造以表达木糖转运体蛋白、氧化还原酶途径蛋白和木糖异构酶蛋白。在另一个实施方案中，所述微生物细胞经过工程改造以表达木糖转运体蛋白、氧化还原酶途径蛋白和木糖易位体蛋白。在另一个实施方案中，所述微生物细胞经过工程改造以表达木糖转运体蛋白、木糖异构酶途径蛋白和木糖易位体蛋白。在另一个实施方案中，所述微生物细胞经过工程改造以表达木糖转运体蛋白、木糖异构酶途径蛋白、木糖异构酶途径蛋白和木糖易位体蛋白。
在本发明的一些实施方案中，重组产油微生物包含编码选自GPT-A-XPT(SEQ IDNO:45)、GPT-F-XPT(SEQ ID NO:47)或 S106SAD-XPT(SEQ ID NO:49)的木糖易位体蛋白的第一外源基因、编码选自 SUTl (SEQ ID NO:37)、GXSI (SEQ ID NO:39)、XLTI (SEQ ID NO:43)或同向转运体(SEQ ID N0:41)的木糖转运体蛋白的第二外源基因、编码选自XylA(SEQID NO: 15)或XYL3(SEQ ID NO: 51)的氧化还原酶途径蛋白的第三外源基因以及编码选自XYLl (SEQ ID NO:35), XYL2 (SEQ ID NO:50)或 XYL3 (SEQ ID N0:51)的木糖异构酶途径蛋白的第四外源基因。
在一个实施方案中，重组产油微生物包含编码XylA、XYL3、SUTl和GPT-F-XPT的外源基因。在一个实施方案中，重组产油微生物包含编码XylA、XYL2、XYL3、XLTl和S106SAD-XPT的外源基因。在一个实施方案中，重组产油微生物包含编码XylA、XYLU XYL3、XLTl和S106SAD-XPT的外源基因。在一个实施方案中，重组产油微生物包含编码XylA、XYLl、XYL3、GXSl和GPT-A-XPT的外源基因。在一个实施方案中，重组产油微生物包含编码XYLl、XYL2、XYL3、同向转运体和GPT-F-XPT的外源基因。在一个实施方案中，重组产油微生物包含编码XYL1、XYL2、XYL3、GXSl和GPT-F-XPT的外源基因。在一个实施方案中，重组产油微生物包含编码XYL2、XYL3、同向转运体和S106SAD-XPT的外源基因。在一个实施方案中，重组产油微生物包含编码XYL2、XYL3、XLT1和S106SAD-XPT的外源基因。在一个实施方案中，重组产油包含编码XYL2、XYL3、GXSl和GPT-A-XPT的外源基因。
在一些情况下，在包含多于50%为木糖的碳源的培养基中繁殖或培养重组产油微生物。在一些情况下，在包含多于55%、多于60%、多于65%、多于70%、多于75%、多于80%、多于85%、多于90%、多于95%为木糖的碳源的培养基中繁殖或培养所述微生物。在一些情况下，在包含木糖作为唯一碳源的培养基中繁殖或培养所述微生物。在一些情况下，所述微生物在包含多于50%为木糖的碳源的培养基中或者在包含木糖作为唯一碳源的培养基中繁殖或培养时，产生由在包含葡萄糖作为唯一碳源的培养基中进行繁殖或培养并且缺乏一个或多个外源基因的类似微生物细胞所产生的脂类的至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%或至少60%。
除非另外指出，否则上文和本说明书通篇所提及的编码指定蛋白质的外源基因是指可操作以编码指定蛋白质的基因。
本发明的另一个实施方案是通过在木糖存在下繁殖或培养重组产油微生物而产生的微生物脂类组合物。在一个实施方案中，在包含木糖的纤维素材料存在下繁殖和/或培养本文所讨论的重组产油微生物。任选地，所述纤维素材料可进一步包含葡萄糖和蔗糖。所述微生物脂类组合物是通过裂解所述微生物细胞并分离所述油来产生。
发明详述
1.定义
“活性”是指在细胞中具有功能的核酸。例如，用于驱动抗生素抗性基因以赋予微藻抗生素抗性的启动子在微藻中具有活性。
“面积百分比”是指在实验期间产生的色谱峰、光谱峰和其它峰的面积百分比的测定。峰的曲线下面积和特定峰的面积百分比的测定通常由本领域的技术人员来完成。例如在其中将样品中的脂肪酸分子转化成为脂肪酸甲酯(FAME)的FAME GC/FID检测方法中，与其它任何脂肪酸如C14:l相比，对于14个碳原子的饱和脂肪酸(C14:0)观察到单独的峰。每种FAME的峰面积与其在混合 物中的百分含量是成正比的，并且其可以基于样品中存在的所有峰的总和来计算(即[特定峰下面积/所有被测峰的总面积]X 100)。当涉及本发明的油类和细胞的脂类特性时，“C8-C14含量为至少4%”是指细胞中或者提取的甘油脂组合物中总脂肪酸的至少4%具有包括8、10、12或者14个碳原子的链长度。
“生物柴油”是利用生物学方法产生的脂肪酸烷基酯，其适于在柴油发动机中用作燃料。
“生物质”是通过细胞生长和/或繁殖产生的物质。生物质可以包含细胞和/或胞内内含物以及胞外物质，其包括但不限于由细胞分泌的化合物。
“生物反应器”是封闭或者半封闭腔体，细胞培养于其中，任选地以悬浮形式。
“纤维素材料”是纤维材料的消化产物，其通常包括葡萄糖和木糖(例如来自半纤维素)，以及任选地另外的化合物(例如二糖、寡糖、木质素、糠醛和其它化合物)。纤维素材料来源的非限制性实例包括甘蔗渣、甜菜浆、玉米秸杆、木片、锯末和柳枝稷。
“表达载体”或者“表达构建体”或者“质粒”或者“重组DNA构建体”是指通过人为干涉制备的核酸，包括利用使得宿主细胞中特定核酸进行转录和/或翻译的一系列特定核酸元件通过重组方法或者直接的化学合成来制备。表达载体可以是质粒、病毒或者核酸片段的一部分。表达载体通常包含需要转录的核酸，其与启动子可操作地连接。
“外源基因”是编码被引入(“转化”)到细胞中的RNA和/或蛋白质表达的核酸。经转化的细胞可以被称为重组细胞，其中可以引入额外的外源基因。相对于被转化的细胞，外源基因可以来源于不同物种(因而是异源的)，或者来源于相同物种(因而是同源的)。因此，外源基因可以包括相对于基因的内源拷贝在细胞基因组中占据不同位置或者处于不同控制下的同源基因。外源基因可以在细胞中存在多于一个拷贝。外源基因可以通过插入基因组或者作为附加分子存在于细胞中。
“外源提供”是指提供到细胞培养物的培养基中的分子。
“脂肪酸特性”应意指脂肪酸就链长度和/或饱和型态而言在细胞和来源于细胞的油中的分布。在此上下文中，饱和型态可包括饱和酸相对于不饱和酸的指标或者在细胞的各种脂肪酸中的双键位置分布的更详细分析。
“固定碳源”是一种含碳分子，通常是有机分子，其在环境温度和压力下以固体或者液体形式存在于培养基中，可以被培养于培养基中的微生物使用。
“异养培育”和其变体如“异养培养”和“异养发酵”是指在固定碳源存在下对生长的有意促进(细胞大小、细胞含量和/或细胞活性增加)。通常，异养培养在没有光的情况下进行。然而没有光对于异养培养来说不是必须的。在没有光的情况下培养意指在完全没有或者近似完全没有光的情况下培养微生物细胞。
“脂类产率增加”是指微生物培养物产量增加，例如通过增加每升培养物的细胞干重、增加生产脂类的细胞的百分比或者增加每单位时间内每升培养物体积的脂类总量。
“可操作地连接”是两个核酸序列之间的功能性连接，所述核酸序列例如控制序列(通常是启动子)和相连序列(通常是编码蛋白的序列，也被称为编码序列)。如果启动子可以介导外源基因转录，那么启动子与外源基因可操作地连接。
“微藻”是含有叶绿体和或者质体并且任选地能够进行光合作用的真核微生物，或者是能够进行光合作用的原核微生物。微藻包括不能代谢固定碳源作为能量的专性光能自养生物以及完全依靠固定碳源生存的异养生物。微藻包括细胞分裂后即刻与姐妹细胞分离的单细胞生物(例如衣藻(Chlamydomonas))以及例如团藻(Volvox,两种不同细胞类型简单多细胞光合微生物)的微生物。微藻包括例如小球藻、杜氏藻(Dunaliella)和原藻的细胞。微藻还包括显示细胞-细胞粘附的其它光合微生物，例如阿格门氏藻(Agmenellum)、鱼腥藻(Anabaena)和桑椹藻(Pyrobotrys`)。微藻还包括丧失进行光合作用的能力的专性异养微生物，例如某些双鞭甲藻和原藻属中的物种。
“微生物(Microorganism) ”和“微生物(microbe) ”是用显微镜可以看见的单细胞生物体。
“天然油”应主要意指从生物体中获得的甘油三酯油，其中所述油还没有经过与另外的天然油或合成油混合或者没有经过分馏以便大致上改变所述甘油三酯的脂肪酸特性。在此，术语“分馏”意指以相对于由生物体产生的特性(然而已完成)来改变其脂肪酸特性的方式从油中移除物质。天然油包含了从生物体中获得的这种油，其中所述油已经过最低程度的处理，包括精炼、漂白和/或脱胶，这大致上没有改变其甘油三酯特性。天然油还可以为“非酯交换型天然油”，这意指天然油没有经过一个过程，在所述过程中脂肪酸的与甘油的酰基连接已重新分布并且脂肪酸基本上保持与从生物体中回收时相同的结构。
提及两种蛋白质或者基因时的“天然共表达”意指蛋白质或者其基因天然共表达于其来源的组织或者生物体中，例如由于编码这两种蛋白的基因处于共同调控序列的控制下，或者由于其响应于相同刺激物而表达。
“氧化还原酶途径”是能够经由木糖醇和木酮糖中间体将木糖转化成木酮糖5-磷酸的蛋白质和/或编码所述蛋白质的基因，其包括但不限于木糖还原酶(将木糖转化成木糖醇)、木糖醇脱氢酶(将木糖醇转化成木酮糖)以及木酮糖激酶(将木酮糖转化为木酮糖5-磷酸)。说明性氧化还原酶途径基因包括但不限于来自树干毕赤酵母(Pichiastipitis)的 XYL1、XYL2 和 XYL3 基因。
“启动子”是指导核酸转录的核酸控制序列。本文中使用的启动子包括转录起始位点附近的必需核酸序列,在II型聚合酶启动子的情况下如TATA元件。任选地,启动子还包括远端的增强子或者抑制子元件，其可以位于离转录起始位点远至数千碱基对的位置。
“重组”是由于引入外源核酸或者改变天然核酸而被修饰的细胞、核酸、蛋白质或者载体。因此，例如重组细胞表达细胞天然(非重组)形式中没有的基因或者表达与由非重组细胞表达的那些基因不同的天然基因。“重组核酸”是一般通过对核酸进行处理(例如利用聚合酶和核酸内切酶)最初于体外形成的核酸，或者除此之外以通常天然不存在的形式。可以产生重组核酸，例如用以使两种或者更多种核酸可操作地连接。因此，就本发明的目的而言，认为通过使通常天然不会连接的DNA分子相连接而于外体形成的分离的核酸或者表达载体是重组的。重组核酸一经制备并引入到宿主细胞或者生物体中，其可以利用宿主细胞体内的细胞体系进行复制；但是，这些核酸一经重组产生，尽管其随后在胞内进行复制，就本发明的目的而言仍然认为其是重组的。类似地，“重组蛋白”是利用重组技术制备的蛋白质，即通过重组核酸的表达。
“可再生柴油”是烷烃(例如ClO:O、C12:0、C14:0、C16:0和C18:0)的混合物，其通过脂类的加氧作用和脱氧作用产生。
“糖化”是使生物质(通常是纤维素生物质或者木质纤维素生物质)转化成为单糖(例如葡萄糖和木糖)的过程。“糖化的”或者“解聚的”是指通过糖化作用已经转化成为单糖的纤维素材料或者生物质。
“蔗糖利用基因”是当表 达时帮助细胞能够利用蔗糖作为能量(碳)来源的基因。本文中由蔗糖利用基因编码的蛋白被称为“蔗糖利用酶”，并且其包括蔗糖转运体、蔗糖转化酶和己糖激酶(例如葡糖激酶和果糖激酶)。
“木糖异构酶途径”是能够经由木糖中间体将木糖转化成木酮糖-5-磷酸的蛋白质和/或编码蛋白质的基因，其包括但不限于木糖异构酶(将木糖转化成木酮糖)和木酮糖激酶(将木酮糖转化成木酮糖-5-磷酸)。说明性木糖异构酶途径基因包括但不限于梨囊鞭菌属(Piromyces sp)基因XylA和树干毕赤酵母基因XYL3。
“木酮糖-5-磷酸易位体”、“木酮糖-5-磷酸转运体”或者“质体戊糖磷酸易位体”是转运木酮糖-5-磷酸的质体膜蛋白和编码这些蛋白质的家族。木糖易位体的非限制性实例是编码来自拟南芥的木酮糖-5-磷酸易位体的XPT基因。
“木糖转运体”是将木糖从细胞培养基中转运到细胞中的蛋白质和编码这些蛋白质的基因并且其包括但不限于被动转运体和主动转运体和易位体。被动转运体在不消耗能量的情况下帮助沿着浓度梯度(从较高浓度区域到较低浓度区域)转运分子，并且其包括但不限于树干毕赤酵母SUTl、SUT2和SUT3转运体以及酿酒酵母(S.cerevisiae)HXT转运体。主动转运体消耗能量以逆浓度梯度(并因此从较低浓度区域转运到较高浓度区域)地转运分子。主动转运体包括但不限于使用ATP作为能量来源的初级主动转运体(即ATP结合序列盒(ABC)转运体)和使用来自化学渗透梯度的能量的次级主动转运体，并且所述次级主动转运体包括但不限于逆向转运体和同向转运体，即中间假丝酵母(Candida intermedia)的GXSl蛋白、来自拟南芥的H+-同向转运体样蛋白(例如At5g59250n)以及来自里氏木霉(Trichoderma reesei)的 XLTl 蛋白。
“木糖利用基因”是在表达时帮助细胞利用木糖作为碳源(例如用于产生能量和/或合成代谢)的能力的基因。在本文中由木糖利用基因编码的蛋白质被称为“木糖利用酶”并且包括木糖转运体、木糖易位体、氧化还原酶途径蛋白和木糖异构酶途径蛋白。
I1.综述
本发明的说明性实施方案通过将木糖利用途径工程改造到原先缺乏代谢木糖的能力的生物体中而克服了在使用细胞培养物来将木糖转化成高价值的细胞生物质方面长期存在的挑战。在各种方面，本公开内容允许将活性木糖代谢途径工程改造到植物界的生物体中并且尤其是到微生物(在本文中也被称为微生物)中。这些生物体包括微藻。另一方面，本公开内容允许将活性木糖代谢途径工程改造到具有质体和II型脂肪酸生物合成途径二者的生物体中并且尤其是微生物中。
尽管其他人已经在啤酒酵母(Saccharomyce)中使用木糖获得了乙醇生产，但是这些生物体不适用于脂类的商业规模生产。与此相反，微生物如产油酵母和产油微藻可积累按干细胞重量计多于20%的脂类(主要为甘油三酯)。尽管产油酵母适用于生产脂类，但是微藻具有II型脂肪酸生物合成途径，其有助于使用基因工程改造来定制脂类并且尤其是甘油三酯(由细胞产生)的脂肪酸特性。参见PCT公布W02011/151149、W02010/063032和W02011/15040。除生产脂类之外，本文所述的生物体可用于生产蛋白质、维生素、纤维以及其它天然产生的物质或者可用作进一步基因工程改造的结果。
根据本发明的 一个实施方案，外源核酸被引入到具有可操作以产生木酮糖-5-磷酸转运体(例如，木酮糖-5-磷酸易位体)蛋白的质体的细胞中，所述转运体蛋白可操作以引起木酮糖-5-磷酸转运到细胞的质体中。在一个特定的实施方案中，所述细胞用编码可操作地连接有质体靶向序列的木酮糖-5-磷酸转运体的外源DNA转化。所述质体靶向序列可将转运体蛋白引到质体膜(优选内部质体膜)中以便将木酮糖5-磷酸有效地转运到可代谢它并且可能使之代谢成脂肪酸的质体中。例如，所述生物体在代谢木酮糖-5-磷酸的质体中可具有内源性戊糖代谢途径。如以下实施例所示的，已发现这是在细胞生长和/或脂类产生的同时促进木糖利用的有效方法。
任选地或者此外，这些细胞能够从外部环境中摄取木糖并将木糖转化成木酮糖-5-磷酸。可能需要外源基因来产生执行这些功能的活性蛋白。例如且如以下实施例所述，这些细胞可以用可操作以编码用于将木糖从外部培养基中转运到细胞中的活性木糖转运体和用于将木糖转化成木酮糖-5-磷酸的途径的DNA转化。例如，用于将木糖转化成木酮糖-5-磷酸的途径可以是用于将木酮糖转化成木酮糖-5-磷酸的木酮糖激酶与用于将木糖转化成木酮糖的途径的组合。用于将木糖转化成木酮糖的途径可包括木糖异构酶或者木糖还原酶与木糖醇脱氢酶的组合。可选地，木糖转运到细胞中可依赖于天然蛋白(如己糖转运体蛋白)的活性。
任选地，在任何以上实施方案的另一改进中，可以转化这些细胞以表达活性木糖醇脱氢酶。这个修改可用于减小或消除木糖醇对木糖异构酶的抑制。
各种基因可整合到生物体的染色体中或者可以是游离基因。优选地，这些基因稳定的表达并且可以是多个拷贝。在各种实施方案中，这些基因处于可调节启动子或者组成型启动子的控制下。转化之后并且任选地为了维持稳定性，这些细胞可以用可筛选标记转化。
这些细胞在异养生长的条件下能够繁殖和/或积累脂类。任选地，这些细胞可以为专性异养生物的细胞(如微藻原藻属的细胞)。例如这些细胞可以为桑椹形原藻的那些细胞。在以下实施例中，转化原藻细胞以表达活性木糖代谢途径。然而应注意，本发明的实施方案适用于很多其它物种。优选物种包括植物界、绿色植物亚界、绿藻下界或绿藻门、利藻亚门、四胞藻纲或者小球藻目的那些物种。特定实例包括桑椹形原藻(Prototheca moriformis)和原壳小球藻(Chlorella protothecoides)。
在一个优选实施方案中，所获得的重组生物体在使用葡萄糖作为碳源来培养时能够积累按干细胞重量计至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%的甘油三酯。另外，所述生物体在纯木糖上培养时能够积累按干细胞重量计至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%的甘油三酯。例如，微生物在作为碳源的葡萄糖上培养时可以能够积累按干细胞重量计至少50%的甘油三酯并且在纯木糖上培养时能够积累按干细胞重量计至少20%的甘油三酯。在另一个实施方案中，当重组生物体的细胞在氮限制条件下在60%为葡萄糖且40%为木糖的碳源上培养时，如通过同位素示踪所测量，这些细胞产生其中碳原子的至少5%、10%、20%、30%、40%或50%来源于木糖的碳原子的脂类。在另一个实施方案中，所述重组生物体的细胞在少于或等于35天、28天、21天、14天或7天中在具有2.5%木糖作为唯一碳源的培养基中能够消耗至少90%的木糖。
除了引入木糖代谢途径之外，还可以通过引入可操作以改变由微生物产生的脂类的脂肪酸特性的基因来对所述生物体进行基因工程改造。因此，木糖可以转化成具有改变的脂肪酸特性的酰基甘油酯。例如，这些细胞可具有包含编码活性酰基-ACP硫酯酶、酮脂酰-ACP合成酶或者脂肪酸去饱和酶的一个或多个外源基因的重组修饰。可选地或者除此之外，这些细胞可具有可操作以减少或消除酰基-ACP硫酯酶、酮脂酰-ACP合成酶或者脂肪酸去饱和酶的重组修饰。用于执行这些基因操作的方法提供于PCT公布W02011/151149、W02010/063032 和 W02011/15040 中。
在一个优选实施方案中，在含有木糖的培养基中培养这些木糖代谢细胞。因此，产生了生物质。在一个特定实施方案中，木糖`被转化成细胞生物质并且具体地说是甘油三酯。这可以通过同位素示踪来显示，例如使用同位素标记的木糖。为了产生甘油三酯，可以在营养物受限的条件下(例如在氮限制下)培养产油微生物。收获所生成的天然油。收获可包括用于释放油的细胞裂解。然后所述油可用于生产油类化学品、润滑剂、清洁剂、燃料、食品、化妆品成分或其它产品。例如，所述油可用于生产生物柴油(脂肪酸酯)或者可再生柴油(通过裂化由油产生的燃料)。
在一个实施方案中，所述方法包括在包含多于50%为木糖的碳源的培养基中培养这些细胞。例如，所述碳源可以多于55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%为木糖。
因此，本发明的一个特定实施方案包括具有质体和通过引入和表达外源基因而产生的可操作的木糖代谢途径的微生物。这些基因具有将木糖转化成木酮糖-5-磷酸并将木酮糖-5-磷酸转运到质体中以用于进一步代谢的活性。所述微生物任选地具有将木糖从外部环境中转运到细胞中的木糖转运体。作为表达外源基因的结果，所述细胞能够在纯木糖上生长并且在例如21天、14天或7天或更少天数内在具有2.5%木糖作为唯一碳源的培养基中优选可以消耗至少90%的木糖。II1.培养
本发明大体涉及产油微生物的培养,所述微生物包括但不限于微藻、产油酵母、产油真菌以及产油细菌。在一些实施方案中，微藻品种特别是重组小球藻和原藻品种适于生产脂类。为了便于阅读，本章分为几节。第I节描述了原藻物种和品种，以及如何通过基因组DNA的比较来鉴定新的原藻物种和品种以及相关微藻。第2节描述了用于培养的生物反应器。第3节描述了培养基。第4节描述了依照本发明的说明性培养方法生产油类。
1.原藻物种和品种
原藻是用于生产脂类的标志性微生物，因为其可以产生大量脂类，特别是适用于生产燃料的脂类。与由其它微藻生产的脂类相比，由原藻生产的脂类具有更短长度和更高饱和度的碳氢链。此外，原藻脂类一般不含色素(叶绿素和某些类胡萝卜素低至不可检出水平)，而且在任何情况下其色素含量远远少于来源于其它微藻的脂类。此外，相对于由其它微藻生产脂类，本发明中提供的重组原藻细胞基于它们增加的利用木糖作为碳源的能力，其可以以更高产率和效率以及更低成本生产脂类。此外，这种微藻可以异养生长并且可以经过基因工程改造。本发明方法中使用的说明性原藻品种包括魏氏原藻(Protothecawickerhamii)、大型原藻(包括UTEX327)、波多黎各原藻(Prototheca portoricensis)、桑椹形原藻(包括UTEX品种1441，1435)和小型原藻。原藻属的物种是专性异养型。
可以通过扩增基因组的特定靶区域来鉴定本发明中使用的原藻物种。例如，可以通过利用引物和利用基因组任意区域的方法(例如利用Wu等，Bot.Bull.Acad.Sin.(2001)42:115-121Identification of Chlorella spp.1solates using ribosomal DNAsequences中描述的方法)对核和/或绿叶体DNA进行扩增和测序，来鉴定特定的原藻物种或者品种。本领域技术人员使用公认的系统发生学分析方法(例如对核糖体内转录间隔区(ITS1和ITS2rDNA)、23S rRNA、18S rRNA和其它保守的基因组区域进行扩增和测序)，不仅可以鉴定原藻物种，还可以鉴定具有相似脂类特性和生产能力的生产碳氢化合物和脂类的其它生物体。对藻类进行鉴定和分类的方法实例还可以见于例如Genetics, 2005年8月；170(4):1601-10 和 RNA, 2005 年 4 月；11 (4):361-4。
因此，可以利用基因组DNA比较来鉴定本发明中使用的适宜微藻物种。可以从微藻物种中扩增基因组DNA的保守区域(例如但不限于编码23SrRNA的DNA)，并比较共有序列，用以筛选与本发明中使用的优选微藻在分类学上相关的微藻物种。对于原藻属物种的这种DNA序列比较的实例显示于下面。基因组DNA比较还可以用于鉴定品种保藏中错误鉴定的微藻物种。品种保藏通常基于表型特征和形态特征鉴定微藻物种。使用这些特征可能导致对微藻属或者物种进行错误分类。使用基因组DNA比较是基于系统发生学关系对微藻物种进行分类的较好方法。
本发明中使用的微藻通常具有编码与SEQ ID NO: 1-9中列出的至少一个序列具有至少99%、至少95%、至少90%或者至少85%核苷酸同一性的23S rRNA的基因组DNA序列。
对于使用序列比较来确定核苷酸或者氨基酸同一性，通常以一种序列作为参照序列，测试序列与其进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参照序列输入计算机中，指定子序列坐标(如果需要)，并且指定序列算法的程序参数。随后基于指定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
可以例如通过局部同源性算法(Smith&ffaterman, Adv.App1.Math.2:482 (1981))、同源性比对算法(Needleman&ffunsch, J.Mol.Biol.48:443 (1970))、相似性搜索方法(Pearson&Lipman, Proc.Nat，1.Acad.Sc1.USA85:2444 (1988))、计算机实施的这些方法(GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA, Wisconsin Genetics Software Package, GeneticsComputer Group, 575Science Dr., Madison, WI)或者通过目检(一般见于上文Ausubel 等)来进行比较序列的最佳比对。
适于确定序列同一性和序列相似性百分比的另外一种算法实例是BLAST算法，其描述于 Altschul 等，J.Mol.Biol.215:403-410(1990)中。进行 BLAST 分析的软件可以在National Center for Biotechnology Information 上(网址是 www.ncb1.nlm.nih.gov)公开获得。这种算法包括首先通过鉴定查询序列中长度为W的短词来鉴定高分数序列对(HSPs)，所述短词在与数据库序列中具有相同长度的词比对时匹配或满足某些正值的阈值分数T。T是指邻域词分数阈值(上文Altschul等)。这些初始邻域词命中作为种子启动搜索，用以寻找含有它们的较长HSP。接着该词命中沿着每条序列在两个方向延伸，远至能够提高累积比对分数。对于核苷酸序列，利用参数M(—对匹配残基的奖励分数，通常>0)和N(非配对残基的罚分，通常〈O)计算累积分数。对于氨基酸序列，使用分数矩阵计算累积分数。每个方向上词命中的延伸在下列情况时停止:当累积比对分数由其达到的最大值降低数量X ;由于一个或者多个残基比对负值的积累而使累积分数降至0或者以下；或者达到任一序列的末端。对于鉴定核酸或者多肽是否在本发明的范围内，BLAST程序的默认参数是合适的。BLAST程序(对于核苷酸序列)使用的默认值是词长(W)为11，期望值(E)为10，M=5，N=-4和进行两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用的默认值是词长(W)为3，期望值(E)为10和BL0SUM62分数矩阵。TBLATN程序(对于核苷酸序列，利用其蛋白序列)使用的默认值是词长(W)为3，期望值(E)为10和BL0SUM62分数矩阵(参见Henikoff&Henikoff, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:10915(1989))。
除了计算序列同一性百分 比之外，BLAST算法还可以进行两个序列之间相似性的统计学分析(例如参见 Karlin&Altschul, Proc.Nat，1.Acad.Sc1.USA90:5873-5787 (1993))。BLAST算法提供的一种相似性测定是最小总和概率(P (N))，其表示通过两个核苷酸或者核酸序列之间偶然发生配对的概率。例如，如果测试核酸与参照核酸比较的最小总和概率小于约0.1，更优选小于约0.01，最优选小于约0.001，则认为该核酸与参照序列是相似的。
除了生产合适的脂类或者碳氢化合物以生产油类、燃料和油脂化工产品之外，影响对本发明中使用的微生物进行选择的其它考虑因素包括:(I)脂类含量高(以细胞重量计算)；(2)易于生长；(3)易于进行基因工程改造；(4)易于对生物质进行处理。在特定的实施方案中，野生型或者经基因工程改造的微生物生产具有至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%或者至少70%或者更多的脂类。优选生物体是异养生长型(不存在光下生长于糖类中)。
2.生物反应器
以进行遗传学操作和生产碳氢化合物(例如脂类、脂肪酸、醛、醇和烷烃)二者为目的培养微生物。前面一种类型的培养以小规模并且最初至少在起始微生物可以生长的条件下进行。以生产碳氢化合物为目的的培养通常以大规模(例如10，000L.40, 000LU00, 000L或者更大的生物反应器)在生物反应器中进行。通常利用本发明的方法在生物反应器内的含有木糖的液体培养基中对原藻进行培养。在一个实施方案中，在生物反应器中使用分批补料法对微藻(如原藻)进行培养。生物反应器通常不允许光进入，并且在大致上没有光的情况下对所述微生物进行异养培养，以代谢固定碳源。
使用生物反应器或者发酵罐来培养微藻细胞，通过其生理周期的多个阶段。在异养生长和繁殖方法中使用生物反应器提供很多优势。为了生产用于食品中的生物质，优选在液体中(例如在悬浮培养基中)大量发酵微藻。生物反应器(例如不锈钢发酵罐)可以容纳非常大的培养体积(本发明的多个实施方案中使用具有40，000升和更大能力的生物反应器)。生物反应器通常还使得可以控制培养条件，例如温度、PH值、氧压和二氧化碳水平。例如，生物反应器通常是可配置的，例如利用与管道连接的接口，以允许气体组分(例如氧气或者氮气)通过液体培养物起泡。利用生物反应器还可以更容易地对其它培养参数(例如培养基的PH值、微量元素的类型和浓度以及其它培养基组分)进行控制。
生物反应器可以配置成使培养基在微藻复制和数量增加期间流过生物反应器。例如在一些实施方案中，可以在接种后但是在细胞达到期望密度之前将培养基注入生物反应器中。在其它情况下，培养初始时将培养基充满生物反应器，并且在接种培养物后不再注入培养基。换言之，使微藻生物质在液体培养基中培养一段时间，其间微藻复制并且数量增加；但是，在这期间没有大量的液体培养基流过生物反应器。因此在一些实施方案中，接种后没有液体培养基流过生物反应器。
可以利用装配有例如旋转刀和旋桨、振荡器、搅拌棒、用于将气体增压注入的装置等设备的生物反应器使微藻培养物混合。混合可以是连续性的或者周期性的。例如，在一些实施方案中，没有维持气体进入和培养基进入的紊流条件，直至所述微藻数量的增加达到期望水平。
可以使用生物反应器接口引入或者提取气体、固体、半固体和液体至含有微藻的生物反应室中。由于很多生 物反应器具有多于一个接口(例如一个用于培养基进入，另一个用于取样)，仅使一种物质进入或者保留一个接口是没有必要的。例如，可以使用一个接口使培养基流入生物反应器中并且随后用于取样、进气、排气或者其它目的。优选可以重复使用取样口，不会改变妥协培养物的无菌性质。取样口可以配置成具有阀门或者具有使样品停止和开始流动或者提供连续取样装置的其它设备。通常生物反应器具有允许接种培养物的至少一个接口，并且这种接口还可以用于其它目的，例如培养基进入或者气体进入。
生物反应器接口使得可以控制微藻培养物的气体含量。举例而言，生物反应器的部分体积可以是气体而非液体，并且生物反应器的气体入口允许将气体泵入生物反应器中。可以有益地泵入生物反应器中的气体包括空气、空气/CO2混合物、隋性气体(例如氩气)和其它气体。通常生物反应器装配成使得使用者能够控制气体进入生物反应器的速率。如上面提到，可以通过增加流入生物反应器的气体来促进培养物混合。
气体流动增加还影响培养物的浊度。通过在液体培养基层下放置一个进气口以使进入生物反应器的气体在培养物表面起泡，可以产生紊流。一个或者多个排气口使气体可以泄漏，因此防止生物反应器中压力累积。优选排气口通向防止杂质微生物进入生物反应器的止回管道。
3.培养基
微藻培养基通常含有例如固定氮源、固定碳源、微量元素、任选地维持PH值的缓冲液和磷酸类物质(通常以磷酸盐提供)等组分。其它组分可以包括盐(例如氯化钠)，特别是对于海水微藻。氮源包括有机和无机氮源，其例如包括但不限于分子氮、硝酸、硝酸盐、氨(纯氨水或者盐形式，例如(NH4)2S04和NH40H)、蛋白质、大豆粉、玉米浆和酵母提取物。微量元素的实例包括锌、硼、钴、铜、锰和钥，例如分别以ZnCl2,H3BO3^CoCI2.6H20、CuC12.2H20、MnCl2 ? 4H20 和(NH4)6Mo7O24 ? 4H20 的形式提供。
一般可以从多种来源获得固体和液体生长培养基，而且可以适用于多种微生物品种的特定培养基的制备方法可以在 http://www.utex.0rg/(由 Austin, IUniversity StationA6700, Austin, Texas, 78712-0183 处的 University of Texas 维护的站点)中的藻类培养物保藏中心(UTEX)在线找到。例如，多种淡水和盐水培养基包括描述于PCT公布号为2008/151149中的培养基，其以引入方式并入本文。
在一个特定的实施例中，Proteose培养基适用于进行无菌培养，并且可以通过将Ig蛋白胨加入到I升Bristol培养基中来制备IL体积的培养基(pH~6.8)。Bristol培养基包含水溶液中的 2.94mM NaN03、0.17mM CaCl2 ? 2H20、0.3mM MgSO4 ? 7H20、0.43mM、l.29mMKH2PO4和1.43mM NaCl。对于1.5%的琼脂培养基，可以将15g琼脂加入到IL溶液中。将培养基盖好并进行高压灭菌，并且随后在使用前储存于冷藏温度中。另一个实例是原藻分离培养基(P頂)，其包含10g/L苯二甲酸氢钾(KHP)、0.9g/L氢氧化钠、0.lg/L硫酸镁、0.2g/L磷酸氢钾、0.3g/L氯化铵、10g/L葡萄糖、0.00lg/L盐酸硫胺素、20g/L琼脂、0.25g/L5-氟胞嘧啶，pH 值范围是 5.0 至 5.2 (参见 Pore, 1973，App.Microbiology, 26:648-649)。通过咨询上面显示的URL或者通过咨询保藏微生物培养物的其它组织(例如SAG、CCAP或者CCALA)，可以容易地鉴定适用于本发明方法中的其它培养基。SAG是指在University
of Gottingen ( Gottingen, Germany)处的 Culture Collection of Algae, CCAP 是指由Scottish Association for Marine Science (Scotland, United Kingdom)管理的藻类和原生动物培养物保藏中心，并且CCALA是指在Institute of Botany ( Tr ebo n，CzechRepublic)处 的藻类培养物保藏实验室。此外，美国专利号5，900，370描述了适合原藻物种异养发酵的培养基配方和条件。
对于油类生产，选择固定碳源十分重要，因为固定碳源的成本必须足够低，以经济地进行油类生产。在一个实施方案中，固定碳源是木糖。木糖是作为半纤维素的组分发现的五碳单糖。半纤维素是在几乎所有的植物细胞壁(包括约30%的全部植物物质)中发现的复合多糖。除木糖之外，也可包括其它碳源，例如乙酸酯、红藻糖苷、果糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖、鼠李糖、蔗糖和/或木糖时，选择含有这些化合物(特别是木糖)的原料是本发明方法中的一个重要方面。
根据本发明使用的其它适宜原料包括例如黑液、玉米淀粉、解聚的纤维素材料、奶浆、糖蜜、马铃薯、高粱、蔗糖、甜菜、甜菜汁、甘蔗、甘蔗汁、浓甘蔗汁、稻米和小麦。还可以以混合物形式提供碳源，如蔗糖或木糖与解聚的甜菜浆、解聚的纤维素材料等的混合物。可以在一种或多种外源提供的固定碳源的浓度为至少约50 u M、至少约100 u M、至少约250 u M、至少约500 u M、至少约ImM、至少约2.5mM、至少约5mM、至少约10mM、至少约25mM、至少约50mM、至少约100mM、至少约250mM以及至少约500mM的情况下供应所述一种或多种碳源。在一些情况下，可以在外源提供的固定碳源的浓度为至少约100g/L、至少约200g/L、至少约300g/L、至少约400g/L、至少约500g/L、至少约600g/L、至少约700g/L、至少约800g/L或者更大的情况下将作为分批发酵的原料的一种或多种碳源供应到发酵培养物中。对于本发明目的特别优选的碳源包括木糖、解聚的纤维素材料、甘油、葡萄糖、蔗糖和高粱，下面对其中的每一种进行更加详细的讨论。
根据本发明，可以利用解聚的纤维素生物质作为原料来培养微生物。纤维素生物质(例如干草，如玉米干草)是廉价并且易于获得的。微藻可以在经过加工的纤维素材料上生长，并且本发明的微藻被特别设计成高效地利用木糖作为碳源。纤维素材料一般包括约40-60%的纤维素、约20-40%的半纤维素和10-30%的木质素。
适宜的纤维素材料包括来源于草本和木本能源作物以及农作物的剩余物(不是从主要的食物或者纤维产品田地中取下的)，即植物器官、初生茎和初生叶。实例包括农业废弃物(例如甘蔗渣、稻米壳、玉米纤维(包括茎、叶、壳和棒)、小麦秸杆、稻米秸杆、甜菜浆、柑橘浆、柑橘皮)、林业废弃物(例如硬木和软木间伐材以及木材处理时的硬木和软木剩余物)、木材废弃物(例如锯木厂废弃物(木片、锯末)和纸浆厂废弃物)、城市废弃物(例如城市固体废弃物的纸质部分、城市木质废弃物和城市绿色废弃物(例如城市剪草))和木材建筑废弃物。其它纤维素材料包括专门的纤维素作物，例如柳枝稷、杂交白杨木和芒草、纤维甘蔗和纤维高粱。从这些材料中生产的五碳糖包括木糖。
可以对纤维素材料进行处理，以增加微生物利用这些物质中所含糖类的效率。如上面所讨论，木质纤维素生物质由多种组分组成，包括纤维素(3-1，4连接的葡萄糖(一种六碳糖)的一种晶体多聚物)、半纤维素(较松散连接的多聚物，主要由木糖(一种五碳糖)组成并且含有少量的甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖)、木质素(一种复杂的芳香族多聚物，由芥子醇和其衍生物组成)和果胶(a -1，4连接的直链多聚半乳糖醛酸)。由于纤维素和半纤维素具有多聚结构，其中所含糖类(例如单糖葡萄糖和木糖)的形式不能被很多微生物有效利用。对于这些微生物，对纤维素生物质进行进一步加工以产生构成多聚物的单糖有助于保证纤维素材料作为原料(碳源)能够被有效利用。
纤维素或纤维素生物质可以经受被称为“汽爆”的过程，其中在高温和高压下用稀硫酸(或者其它)处理生物质。该过程使得生物质中的纤维素和半纤维素组分能够被有效地酶促水解成为葡萄糖和木糖单体。所得到的单`糖被称为纤维素糖。随后纤维素糖被微生物利用，产生大量代谢物(例如脂类)。酸汽爆步骤使得半纤维素组分部分水解成为组成其的单糖。进一步处理后，这些糖类可以完全从生物质中释放出来。在一些实施方案中，进一步处理是热水处理，其包括用热水对经汽爆的材料进行清洗，去除杂质(例如盐)。该步骤对于纤维素乙醇发酵来说是不必要的，因为该过程中使用较高稀释度的糖浓度。在其它实施方案中，进一步处理是额外的酸处理。在其它实施方案中，进一步处理是对经汽爆的材料进行酶促水解。这些处理还可以结合使用。处理类型可以影响释放的糖类型(例如五碳糖对六碳糖)和处理过程中糖类释放的阶段。因此，可以产生不同的糖流，无论其主要是五碳糖或者六碳糖。这些经富集的五碳糖或者六碳糖流因而可以针对具有不同碳利用能力的特定微生物。在本发明的方法的某些实施方案中，优选富含五碳木糖的物流。在其它实施方案中，可以组合已糖化的含有五碳糖、六碳糖或者五碳糖/六碳糖的组合的不同糖流，以用于在微生物发酵中生产高细胞密度的产生脂类的微生物生物质。
涉及脂类生产的本发明的实施方案可包括发酵以产生高于乙醇发酵中所达到的细胞密度的细胞密度。由于用于异养纤维素油类生产的培养物密度较高，优选固定碳源(例如纤维素来源的糖流)呈浓缩形式。例如，在培养步骤之前在原料中解聚的纤维素材料中的葡萄糖浓度、或木糖浓度或者葡萄糖和木糖的总浓度可以是至少约100g/升、至少约200g/升、至少约300g/升、至少约400g/升、至少约500g/升、至少约600g/升、至少约700g/升、至少约800g/升或者更多的葡萄糖或者木糖或者葡萄糖与木糖的组合，所述培养步骤任选地是分批补料式培养，其中随着细胞生长和积累脂类的时间将材料供给到细胞中。这些糖化方法的各种方法和用于加工纤维素材料以在微生物发酵中使用的其它方法描述在美国专利申请公布20100151112中。
纤维素物质的汽爆处理过程利用大量的硫酸、热和压力，因而释放碳水化合物的副产物，称为糠醛和羟甲基糠醛。糠醛和羟甲基糠醛在半纤维素水解过程期间通过木糖降解成为糠醛和水而产生。然而在本发明的方法的很多实施方案中这种木糖损失是不希望的，这样使得在使用它们时采用非汽爆过程抑或使糠醛和羟甲基糠醛的产生减至最少，在引入生物反应器之前，可以从糖化的木质纤维素材料中去除这些副产物(例如糠醛和羟甲基糠醛)，并且通过美国专利申请公布20100151112中描述的方法可以减小由汽爆过程引起的纤维素材料的导电性。
在其它实施方案中，对汽爆过程自身进行改变，以避免产生出乎意料地高水平的盐。例如，纤维素生物质的硫酸(或者其它酸)汽爆的适宜替代步骤是机械浆化，以使纤维素生物质能够进行酶促水解(糖化)。在其它实施方案中，使用能够抵抗高水平盐的微生物天然品种或者能够抵抗高水平盐的基因工程改造的品种。处理纤维素糖以使得其适合用作本发明的浓缩原料的方法的一个非限制性实例描述在美国专利申请公布20100151538中，所述申请以引用的方式并入本文。在一个实施方案中，糖化的木质纤维素糖经过处理以减少毒素(例如，糠醛和羟甲基糠醛)和盐二者的水平并且然后将其浓缩至浓缩糖流或者固定碳源原料中至少600g/L或更多糖单体的浓度。在其它实施方案中，这些浓缩的糖化木质纤维素糖具有小于700mM钠等同物的盐水平。在其它实施方案中，这些浓缩的糖化木质纤维素糖具有小于IOOmM钠等同物、小于200mM钠等同物、小于300mM钠等同物、小于400mM钠等同物、小于500mM钠等同物、小于600mM钠等同物、小于700mM钠等同物或者小于1000mM钠等同物的盐水平。在其它实施方案中，这种浓缩的糖化木质纤维素糖原料具有小于20，000 u S/cm、小于 15，000 u S/cm、小于 10，000 u S/cm、小于 7，500 u S/cm、小于 5，000 u S/cm、小于1000ii S/cm、小于500 y S/cm、小于300 y S/cm或者小于200 y S/cm的导电率的导电性。在其它实施方案中，这种浓缩糖化的木质纤维素糖原料富含五碳糖单体或者六碳糖单体或者五碳与六碳糖单体的组合。
在本发明方法的另一个实施方案中，碳源包括甘油，例如由生物柴油转酯基作用产生的酸化和未酸化的甘油副产物。在一个实施方案中，碳源包括甘油和木糖。在一些情况下，在发酵开始时将所有的甘油和木糖提供给微生物。在一些情况下，将甘油和木糖以预定比率同时提供给微生物。在一些情况下，在发酵过程中将甘油和木糖以预定比率供给微生物。
一些微藻在甘油存在下比在另一种碳源如葡萄糖存在下的细胞分裂更快(参见PCT公布号2008/151149)。在这对于甘油和木糖确实如此的情况下，两阶段生长方法(其中首先将甘油供给细胞以使其细胞密度快速增长，并且随后将木糖供给细胞，以积累脂类)可以提高脂类生产的效率。利用转酯基方法的甘油副产物当投回到生产过程中时具有显著的经济优势。还提供了其它供给方法，例如将甘油和木糖混合。供给这种混合物也具有相同的经济益处。因此，本发明提供了以替代糖类(如木糖与甘油的各种组合)供给微藻的方法。
在本发明的方法的各种实施方案中，碳源是木糖，包括含有木糖的复合原料，如来源于纤维素的材料。在一个实施方案中，培养基进一步包含至少一种木糖利用酶。使用含有木糖的复合原料可以显著节省碳氢化合物和其它油类生产的成本。
4.油类生产
对于根据本发明的方法进行油类生产，优选在黑暗中(或者在大致上没有光的情况下)培养细胞，例如当使用不允许光照射培养物的极大(40，OOO升或者更大)发酵罐时就是如此。专性异养生物物种如原藻物种在含有固定碳源的培养基中且在没有光的情况下生长和繁殖，以生产油类；已知这种生长是异养生长。
作为实例，将产脂微藻细胞的接种物引入培养基中；细胞开始繁殖前存在延迟期(延迟相)。延迟期后，繁殖速率稳定增加，进入对数期或者指数期。指数期后，由于营养物质(例如氮)减少、毒性物质增加以及群体感应机制，繁殖减慢。减慢后，繁殖停止，依赖于向细胞提供的特定环境，细胞进入静止期或者平稳生长状态。为了获得脂类富集的生物质，通常在指数期结束之后收集培养基，可以通过使氮或者另一种关键营养物质(除了碳之外)耗尽从而迫使细胞将过量存在的碳源转化成为脂类，使指数期较早终止。可以控制培养条件参数，以使总体油类生产、所产生的脂类组合物和/或特定油类的生产达到最佳。
如上面所讨论，使用生物反应器或者发酵罐，以使细胞进入其生长循环的多个时期。作为实例，将产脂细胞的接种物引入培养基中，随后在细胞开始生长前进入延迟时期(延迟期)。延迟期后，繁殖速率平稳增加，进入对数期或者指数期。指数期后，由于营养物质减少和/或毒性物质增加，生长减慢。减慢后，生长停止，依赖于向细胞提供的特定环境，细胞进入静止期或者平稳状态。本文公开的细胞的脂类生产可以发生于对数期过程中或者其后，包括静止期，其中提供或者仍然可获得营养成分，以使细胞在不分裂的情况下能够持续生产脂类。
优选地，利用本文中描述且本领域已知的条件生长的微生物包含至少约20%重量的脂类、至少约40%重量、至少约50%重量、至少约60%重量以及至少约70%重量。可以调整工艺条件，以增加适合特定用途的脂类的产率和/或减少生产成本。例如，在某些实施方案中，在具有限制性浓度的一种或者多种营养物质(例如氮、磷或者硫)存在下培养微藻，同时提供过量的固定碳能(例如葡萄糖)。与在过量提供氮的培养物中微生物的脂类产率相比，限制氮倾向于使微生物的脂类产率增加。在特定的实施方案中，脂类产率增加为至少约:大于氮充满条件下获得的产率的10%、50%、100%、200%或者500%。可以在总培养期的一部分或者整个时期中在限制量的营养物质存在下培养微生物。在特定的实施方案中，在总培养期期间，营养物质的浓度在限制性浓度和非限制性浓度之间至少循环2次。可以通过在延长的时期内持续加入培养基同时提供过量碳但是提供限制性氮或者不提供氮，使细胞的脂类含量增加。
在另一个实施方案中，通过在脂类途径酶(例如脂肪酸合成酶)的一种或者多种辅助因子存在下培养产脂微生物(例如微藻)，使脂类产率增加。一般来讲，辅助因子的浓度足以使微生物脂类(例如脂肪酸)产率与不存在辅助因子时的微生物脂类产率相比增加。在特定的实施方案中，通过将含有编码辅助因子的外源基因的微生物(例如微藻)加入到培养基中，向培养基提供辅助因子。任选地，可以通过加入含有编码参与辅助因子合成的蛋白的外源基因的微生物(例如微藻)向培养基提供辅助因子。在某些实施方案中，合适的辅助因子包括脂类途径酶所需的任何维生素，例如:生物素、泛酸盐。编码适用于本发明中的辅助因子的基因或者参与这些辅助因子合成的基因是已知的，并且可以利用例如上面描述的质粒和技术引入到微生物(例如微藻)中。
可以以任何合适的方式将本文中描述的生物反应器、培养条件以及异养生长和繁殖方法的特定实例进行组合，以促进微生物生长以及提高脂类和/或蛋白生产的效率。
利用本领域已知的(参见PCT公布号2008/151149)的不同培养方法已经产生了具有按干重计的高比率油类/脂类积累的微藻生物质。利用本文中描述的培养方法产生并且根据本发明使用的微藻生物质包含按干重计至少10%的微藻油。在一些实施方案中,微藻生物质包含按干重计至少25%、至少50%、至少55%、至少60%的微藻油、或者至少70%的微藻油。在一些实施方案中，微藻生物质含有按干重计10-90%的微藻油、25-75%的微藻油、45-75%的微藻油或者50-70%的微藻油。
用于本发明的方法和组合物中的本文中描述的生物质的微藻油或者从生物质中提取的微藻油可以包含具有一个或者多个不同脂肪酸酯支链的甘油脂。甘油脂由与一个、两个或者三个脂肪酸分子发生酯化的甘油分子组成，所述脂肪酸分子可以具有不同的长度和不同的饱和度。通过如下面第V章更加详细描述的培养条件或者脂类途径工程，可以控制脂肪酸分子(和微藻油)的长度和饱和度性质，以对本发明微藻油中的脂肪酸分子的特性或者比例进行修饰。因此，可以通过将来源于两个或者多个微藻物种的生物质或者藻油混合，在单个微藻物种内制备特定的藻油混合物，或者通过将本发明的藻油与其它来源的油类混合来制备特定的藻油混合物，所述其它来源例如大豆、油菜籽、加拿大油菜、棕榈叶、棕仁、椰子、玉米、废植物、乌桕油、橄榄、向日葵、棉花籽、鸡脂肪、牛脂、微藻、大型藻类、微生物、萼距花、亚麻、花生、精选白色动物油脂、猪油、亚麻芥油、芥菜籽、腰果、燕麦、羽扇豆、洋麻、金盏花、大麻、咖啡豆、亚麻仁(亚麻籽)、榛子、大戟属、南瓜籽、香菜、山茶、芝麻、红花、稻米、油桐树、可 可、干椰子肉、阿片罂粟、蓖麻籽、碧根果、加州希蒙得木、夏威夷果、巴西坚果、鳄梨、石油或者上述油类中任意一种的馏分。
还可以通过将来源于至少两种不同的微藻物种的生物质或者油类混合，来控制油类组成，即甘油脂中脂肪酸成分的性质和比例。在一些实施方案中，至少两种不同的微藻物种具有不同的甘油脂谱。如本文中所描述，优选在异养条件下对不同的微藻物种进行共同培养或者分离培养，以产生各自的油类。不同微藻物种细胞的甘油脂中可以含有不同比例的不同脂肪酸成分。
一般来讲，野生型原藻品种几乎没有或者没有链长度为C8-C14的脂肪酸。例如桑椹形原藻(UTEX1435)、克鲁格尼原藻(UTEX329)、大型原藻(UTEX1442)和小型原藻(UTEX1438)不含(或者不可检出量的)C8脂肪酸，含有0-0.01%之间的ClO脂肪酸、0.03-2.1%之间的C12脂肪酸和1.0-1.7%之间的C14脂肪酸。
微藻油还可以包括由微藻产生的或者培养基中与微藻油混合的其它成分。这些其它成分可以以不同量存在，这取决于培养微藻时使用的培养条件、微藻物种、从生物质中回收微藻油时使用的提取方法和可能影响微藻油组合物的其它因素。这些成分的非限制性实例包括以0.1-0.4微克/ml存在的类胡萝卜素、以0-0.02毫克/千克油存在的叶绿素、以
0.4-0.6毫克/100克油存在的Y-生育酚和以0.2-0.5毫克/克油存在的总生育三烯酚。其它成分可以包括但不限于磷脂、生育酚、生育三烯酚、类胡萝卜素(例如a-胡萝卜素、(6-胡萝卜素、番茄红素等)、叶黄素(例如叶黄素、玉米黄质、a-隐黄质和(6-隐黄质)和多种有机或者无机化合物。
在一些情况下，从原藻物种中提取的油类包含不多于0.02mg/kg的叶绿素。在一些情况下，从原藻物种中提取的油类包含不多于0.4mg/ml的类胡萝卜素。在一些情况下，每100克原藻油中包含0.40-0.60毫克之间的Y-生育酚。在其它情况下，每克原藻油中包含0.2-0.5晕克之间的总生育三烯酹。
IV.基因工程改造方法和材料
本发明的实施方案提供了用于对适用于本发明方法中的细胞和重组宿主细胞进行基因修饰的方法和材料，所述重组宿主细胞包括但不限于重组产油微生物、微藻、和产油微藻，如桑椹形原藻、小型原藻、克鲁格尼原藻和大型原藻宿主细胞。为了便于阅读，对这些方法和材料的描述分为几节。在第I节中描述了转化方法。在第2节中描述了同源重组方法。在第3节中描述了表达载体和载体组分。
1.转化方法
可以通过任何合适的技术转化细胞，所述技术包括例如基因枪法、电穿孔(参见Maruyama 等，(2004), Biotechnology Techniques8:821-826)、玻璃珠转化法和碳化娃晶须转化法。可以使用的另一种方法涉及形成原生质体以及利用CaC12和聚乙二醇(PEG)将重组DNA引入微藻细胞中(参见Kim等，(2002), Mar.Biotechnol.4:63-73，其报道利用这种方法转化Chorella ellipsoidea)。可以通过共转化微藻将两种不同的载体分子同时引入细胞中(参见例如 Protist2004Dec; 155 (4): 381-93)。
还可以使用基因枪法(参见例如Sanford, Trends In Biotech.(1988) 6:299302，美国专利号 4，945，050)、电穿孔(Fromm 等，Proc.Nat’1.Acad.Sc1.(USA) (1985)82:58245828)、使用激光束、显微注射或者能够将DNA引入微藻中的任何其它方法转化原藻细胞。
2.同源重组方法
同源重组是指宿主细胞中的互补DNA序列对准并交换同源区域的能力。将含有与被靶向的基因组序列(“模板”)同源的序列的转基因DNA( “供体”)引入到宿主细胞中，并接着在相应的基因组同源序列位点重组到基因组中。在大多数情况下，该过程的机械步骤包括:(I)使同源DNA片段配对；(2)使供体DNA分子发生双链断裂；(3)使供体DNA的游离末端插入到模板DNA分子中，随后进行DNA合成；和(4)发生双链断裂修复事件，其产生最终的重组产物。
在宿主生物体中进行同源重组的能力具有许多实践意义，其可以在分子遗传学水平进行并且可以用于制备能够生产特制油的产油微生物。同源重组本质上是精确的基因靶向事件；因此，由相同的靶向序列制备的大多数转基因株在表型上是基本一致的，需要筛选极少的转化事件。同源重组还将基因插入到宿主染色体中，产生极好的基因稳定性，甚至在不存在基因选择的情况下。由于不同的染色体座位可影响基因表达，甚至是异源启动子/UTRs介导的基因表达，因此同源重组可以是在未知基因组环境中查找座位和评估这些环境对基因表达的影响的方法。
利用同源重组的特别有用的基因工程应用是选择特异的宿主调控元件(例如启动子/UTRs)以高度特异的方式驱动异源基因的表达。例如，预期用异源C12:0特异性FATB(硫酯酶)基因盒和合适的筛选标记去除内源性硬脂酰基ACP去饱和酶基因能够显著地降低C18:1脂肪酸的内源水平，同时使C12:0脂肪酸的水平增加。参见美国专利公布20100151112。
由于同源重组是精确的基因靶向事件，所以其可以用于对目的基因或者目的区域内的任意核苷酸进行精确修饰，只要已经鉴定出足够的侧翼区域。因此，可以利用同源重组方法对影响RNA和/或蛋白表达的调控序列进行修饰。在对酶活性(例如底物特异性、亲和性和Km)进行修饰的尝试中，其还可以用于修饰蛋白编码区域，因而使宿主细胞的代谢发生期望变化。同源重组提供了控制宿主基因组的强效方法，其导致发生基因靶向、基因转换、基因缺失、基因复制、基因倒置和基因表达调控元件(如启动子、增强子和3’ UTR)的交换。
可以通过利用含有内源序列片段的靶向质粒靶向宿主细胞内源基因组内部的目的基因或者目的区域来达成同源重组。这种靶向序列可以位于目的基因或者目的区域的5’端、目的基因/区域的3’端或者可以位于目的基因/区域的侧翼。这种靶向质粒可以以具有额外的载体骨架的超螺旋质粒DNA形式或者无载体骨架的PCR产物形式或者线性分子形式转化到宿主细胞中。在一些情况下，首先利用限制性酶使转基因DNA(供体DNA)内部的同源序列暴露是有利的。该步骤可以增加重组效率并且减少不期望有的事件的发生。增加重组效率的其它方法包括利用PCR产生转化转基因DNA，所述DNA含有与被靶向的基因组序列同源的线性末端。
3.载体和载体组分
根据本文中公开的内容，可以通过本领域技术人员熟悉的已知技术制备本发明中用于转化微生物的载体。载体通常含有一个或者多个基因，其中每个基因编码期望产物(基因产物)的表达，并且可操作地连接至(或含有)调控基因表达或者使基因产物靶向重组细胞内部特定位点的一个或多个控制序列。为了有助于阅读，该节分为几个小节。A小节描述了载体中通常含有的控制序列以及特别用于在微藻如原藻中使用的控制序列。B小节描述了载体中通常含有的基因以及特别用于在微藻如原藻中使用的密码子优化方法和利用其制备的基因。` A.控制序列
控制序列是调控编码序列的表达或者指导基因产物至细胞内部或者外部特定位点的核酸。调控基因的控制序列包括例如调控编码序列转录的启动子和使编码序列转录终止的终止子。另一个控制序列是位于编码多聚腺苷酸尾链信号的编码序列末端的3’非翻译序列。指导基因产物至特定位点的控制序列包括编码信号肽的序列，其指导与其连接的蛋白至细胞内部或者外部的特定位点。
因此，设计用于在微藻中表达外源基因的示例性载体含有期望基因产物(例如可筛选标记、脂途径修饰酶或者木糖利用酶)的编码序列，其与在微藻中具有活性的启动子可操作地连接。任选地，如果载体不含与目的编码序列可操作地连接的启动子，可以将编码序列转化到细胞中，以使其在载体整合点处与内源性启动子可操作地连接。
许多启动子在微藻中具有活性，包括被转化的微藻的内源性启动子以及被转化的藻类的非内源性启动子(即其它藻类的启动子、闻等植物的启动子和植物病毒或者藻类病毒的启动子)。在微藻中具有活性的说明性外源和/或内源启动子(以及在微藻中具有功能的抗生素抗性基因)描述于PCT公布号2008/151149和其中引用的参考文献中。也参见美国专利申请公布20100151112。
用于表达外源基因的启动子可以是与该基因天然连接的启动子或者可以是异源启动子。一些启动子在多于一种微藻物种中具有活性。其它启动子是物种特异性的。说明性启动子包括例如下面实施例中使用的莱茵衣藻(6-微管蛋白的启动子和病毒启动子，例如已经表明在多个微藻物种中具有活性的花椰菜花叶病毒(CMV)启动子和小球藻病毒启动子(参见例如 Plant Cell Rep.2005Mar; 23 (10-11): 727-35; J Microbiol.2005Aug; 43 (4):361-5; Mar Biotechnol (NY).2002Jan; 4 (I):63-73)。适用于在原藻中表达外源基因的另一个启动子是耐热性小球藻(Chlorella sorokiniana)谷氨酸脱氢酶启动子/5’ UTR(SEQID NO: 10)。任选地，使用这些序列中含有启动子的至少10、20、30、40、50或者60个或者更多核苷酸。用于在原藻中表达外源基因的说明性启动子列于本申请的序列表中，例如小球藻HUPl基因的启动子(SEQ ID NO: 11)和椭圆形小球藻(Chlorella ellipsoidea)硝酸还原酶启动子(SEQ ID N0:12)。还可以利用小球藻病毒启动子在原藻中表达基因，例如美国专利号6，395，965中的SEQ ID NO: 1-7?还可以在例如Biochem Biophys ResCommun.19940ctl4;204(I):187-94、Plant Mol Biol.19940ct;26(I):85-93;Virology.2004Augl5 ;326(1):150-9 和 Virology.2004Jan5; 318 (I):214-23 中发现在原藻中具有活性的额外的启动子。
启动子一般可以表征为组成型或者诱导型。组成型启动子一般在所有时间(或者在细胞生命周期的某些时间)均具有相同水平的驱动表达的活性或者功能。相反，诱导型启动子仅响应于刺激物而具有活性(或使其失活)，或者显著上调或下调。这两种类型的启动子均可以用于本发明的方法中。用于本发明中的诱导型启动子包括响应于刺激物而介导可操作地连接的基因转录的启动子，所述刺激物例如外源提供的小分子(例如SEQ ID NO: 11中的葡萄糖)、温度(热或者冷)、培养基中缺少氮等。合适的启动子可以激活基本沉默的基因的转录，或者优选大 幅度上调低水平转录的可操作地连接基因的转录。
任选含有终止区控制序列，如果使用该序列，那么首先选择便利的序列，因为终止区相对可以交叉使用。终止区可以与转录起始区(启动子)同源、可以与目标DNA序列同源或者可以从其它来源获得。参见例如Chen和Orozco, Nucleic Acids Res.(1988) 16:8411。
本发明还提供了控制序列和重组基因以及含有二者并且使目的基因分隔表达的载体。被靶向的细胞器是叶绿体、质体、线粒体和内质网。此外，本发明提供了控制序列和重组基因以及含有二者并且使蛋白分泌到细胞外的载体。
可以利用质体靶向信号使原藻核基因组中表达的蛋白靶向质体。小球藻内源性质体靶向序列是已知的，例如小球藻核基因组中编码靶向质粒的蛋白的基因，参见例如GenBank保藏编号AY646197和AF499684。在一个实施方案中，本发明的载体中使用这种控制序列，以使表达蛋白靶向原藻质体。
已经描述了使用藻类质体靶向序列使异源蛋白靶向宿主细胞中的正确代谢区。参见美国专利申请公布20100151112的实施例11和12。在一个实施方案中，使用异源蛋白的天然质体靶向序列来将异源蛋白运输到质体/叶绿体中。在一些实施方案中，将天然质体靶向序列置换为异源质体靶向序列以便增加重组蛋白或异源蛋白到质体/叶绿体中的运输。在一些实施方案中，将天然质体靶向序列置换为微藻蛋白的质体靶向序列。对序列进行BLAST比对，并分析与运输至质体/叶绿体中的已知蛋白质的同源性。对编码这些蛋白质的cDNA进行克隆，并且从这些cDNA中分离质体靶向序列。这些藻类质体靶向序列可用于适用于本发明的细胞和方法中的表达载体。
在本发明的另一个实施方案中，使原藻中表达的多肽靶向内质网。表达载体中含有合适的滞留或者分选信号确保蛋白滞留于内质网(ER)中，不进入下游的高尔基体。例如，Wageningen UR-Plant Research International 的载体 IMPACTVECT0R1.3 包含熟知的 KDEL滞留或者分选信号。利用该载体使滞留于ER中具有实践优势，因为已报道其可以使表达水平提高5倍或者更多。主要原因似乎是与细胞质相比，ER中含有较低浓度和/或不同的负责已表达蛋白翻译后降解的蛋白酶。在绿微藻中具有功能的ER滞留信号是已知的。例如参见 Proc Natl Acad Sci U S A.2005Apr26; 102 (17): 6225-30。
在本发明的另一个实施方案中，使多肽靶向分泌到细胞外至培养基中。参见例如Hawkins 等,Current Microbiology Vol.38 (1999), pp.335-341 中在小球藻中具有活性的分泌信号，根据本发明的方法，其可以在原藻中使用。
B.基因和密码子优化
通常基因包含启动子、编码序列和终止控制序列。当通过重组DNA技术组装时，基因被称为表达盒，其侧面具有限制性位点，以便于插入到用于将重组基因引入宿主细胞中的载体中。表达盒侧翼可以具有帮助表达盒通过同源重组稳定融入到基因组中的基因组DNA序列或者其它核酸。任选地，载体和其表达盒可以保持未整合状态，在这种情况下，载体通常含有能够使异源载体DNA进行复制的复制起点。
载体中存在的共有基因是编码一种蛋白的基因，所述蛋白的表达使得能够将含有该蛋白的重组细胞与没有表达该蛋白的细胞区别开来。这种基因和其相应的基因产物称为可筛选标记。用于转化原藻的转基因质粒中可以使用可筛选标记。合适的可筛选标记的实例包括G418抗性基因、硝酸还原酶基因(参见Dawson等，(1997)，CurrentMicrobiology35:356-362 )、潮霉素磷酸转移酶基因(HPT ;参见 Kim 等(2002)，Mar.Biotechnol.4:63-73)、新霉素磷酸转移酶基因和赋予脉霉素抗性的ble基因(Huang等(2007)，Appl.Microbiol.Biotechnol.72:197-205)。测定微藻对抗生素的敏感性的方法是已知的。例如，Mol Gen Genet.19960ctl6; 252 (5): 572-9。
出于本发明的目的，用于制备本发明的实施方案的重组宿主细胞的表达载体可包含至少2个、并且通常是3个基因，如果其中一个基因是可筛选标记的话。例如，可以通过用本发明中的载体进行转化来制备本发明中经过基因工程改造的原藻，所述载体除了可筛选标记外还包含一个或多个外源基因，例如像木糖利用基因或者木糖利用基因和酰基ACP硫酯酶基因。可以利用诱导型启动子使一个或者两个基因表达，所述启动子允许控制这些基因表达的相对时机，以提高脂类产率和促进其转化成为脂肪酸酯。两个或更多个外源基因的表达可以处于同一诱导型启动子的控制下，或者处于不同诱导型(或者组成型)启动子的控制下。在后者情况下，可以诱导第一外源基因表达持续第一时间段(其间第二外源基因可以被诱导或者不被诱导)并且可以诱导第二外源基因表达持续第二时间段(其间第一外源基因可以被诱导或者不被诱导)。
在其它实施方案中，两个或更多个外源基因(除了任意可筛选标记之外)是木糖利用基因、脂肪酰基-ACP硫酯酶、酮脂酰-ACP合成酶、硬脂酰-ACP去饱和酶、脂肪酸去饱和酶和脂肪酰基-CoA/醛还原酶，它们的组合作用能够产生醇类产物。进一步提供了外源基因的其它组合，除木糖利用酶之外，还包括但不限于脂肪酰基-ACP硫酯酶和脂肪酰基-Cok还原酶，以产生醛类。在一个实施方案中，载体除木糖利用基因之外还提供脂肪酰基-ACP硫酯酶、脂肪酰基-CoA还原酶和脂肪醛脱羰基酶的组合，以产生烷烃。在这些实施方案中的每个中，可以利用诱导型启动子来表达一个或多个外源基因。
表达两个或更多个外源基因的其它说明性载体包括同时编码木糖利用酶和可筛选标记的载体。用本发明的载体转化的重组原藻由于具有经过工程改造的利用木糖作为碳源的能力，因而可以用于以较低的制造成本生产脂类。插入如上文所述的外源基因可以与通过定向和/或随机诱变来破坏多糖生物合成相结合，这使得引导甚至更大的碳流进行脂类生产。个别地和组合地利用营养型转变、改变脂类生产的工程改造和用外源酶进行处理，使得由微生物生产的脂类组合物发生改变。这种改变可以是所生产的脂类的量、所生产的一种或者多种碳氢化合物的量(相对于其它脂类)和/或微生物中生产的脂类类型的变化。例如，可以对微藻进行工程改造，以生产较高量和/或百分比的TAG。 为了使重组蛋白最佳表达，使用具有被转化宿主细胞优先使用的密码子的产生mRNA的编码序列是有益的。因此，转基因的适当表达需要转基因的密码子使用与转基因表达的生物体中的特异性密码子偏倚性相符。这种作用精确的潜在机制有许多，包括可用的氨基酰tRNA库与细胞中合成的蛋白之间的适当平衡，以及需要时使转基因信使RNA (mRNA)更加有效地翻译。当转基因中的密码子使用未经优化时，可用的tRNA库不足以使异源mRNA有效翻译，导致核糖体中止和终止以及转基因mRNA可能不稳定。
本发明提供了经密码子优化的核酸，其使得原藻中的重组蛋白成功表达。通过研究从桑椹形原藻分离的cDNA序列，对原藻物种中的密码子使用进行分析。该分析对超过24，000密码子进行查询，其结果显示于下面表1中。
表1.原藻品种中的优选密码子使用
【权利要求】
1.一种植物界(kingdom Plantae)的微生物,所述微生物包含可操作以产生活性木糖代谢途径酶的重组核酸。
2.如权利要求1所述的微生物，其中所述微生物在基本上由木糖组成的碳源上培养时能够增加细胞数量或者产生脂类。
3.根据权利要求1或2所述的微生物，其中所述微生物将木糖转化成甘油三酯。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的微生物，其中所述微生物在使用葡萄糖作为碳源来培养时能够积累按干细胞重量计10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%的甘油三酯。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的微生物，其中所述微生物在纯木糖上培养时能够积累按干细胞重量计至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%的甘油三酯。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述微生物在作为碳源的葡萄糖上培养时能够积累按干细胞重量计至少50%的甘油三酯并且在纯木糖上培养时能够积累按干细胞重量计至少20%的甘 油三酯。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中当所述微生物在氮限制条件下在60%为葡萄糖且40%为木糖的碳源上培养时，如通过同位素示踪所测量，这些细胞产生其中碳原子的至少5%、10%、20%、30%、40%或50%来源于木糖的碳原子的脂类。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述微生物在少于或等于21天、14天或7天中在具有2.5%木糖作为唯一碳源的培养基中能够消耗至少90%的所述木糖。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的微生物，其中所述重组核酸可操作以编码以下一种或多种:活性木糖转运体、木酮糖-5-磷酸转运体、木糖异构酶、木酮糖激酶、木糖醇脱氢酶或木糖还原酶。
10.根据权利要求9所述的微生物，其中所述重组核酸编码可操作地连接有质体靶向信号序列的活性木酮糖-5-磷酸转运体并且其中所述木酮糖-5-磷酸转运体可操作以将木酮糖-5-磷酸转运到质体中。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的微生物，其中所述重组核酸可操作以编码(a)具有质体靶向信号序列以便使木酮糖-5-磷酸转运到质体中的木酮糖-5-磷酸转运体蛋白、(b)木酮糖激酶以及(C)木糖异构酶抑或木糖醇脱氢酶与木糖还原酶二者。
12.如以上权利要求中任一项所述的微生物，其中所述微生物属于绿色植物亚界(subkingdom Viridiplantae)。
13.如以上权利要求中任一项所述的微生物，其中所述微生物属于绿藻下界(infrakingdom Chlorophyta)或绿藻门(phyla Chlorophytae)、属于利藻亚门(subphylum Tetraphytina)、四胞藻纲(class Trebouxiophyceae)或者小球藻目(orderChlorellale)。
14.如以上权利要求中任一项所述的微生物,其中所述微生物属于小球藻属(genusChlorella)或原藻属(genus Prototheca)。
15.如以上权利要求中任一项所述的微生物，其中所述微生物属于桑椹形原藻(Prototheca moriformis)或原壳小球藻(Chlorella protothecoide)种。
16.如以上权利要求中任一项所述的微生物，其进一步包含可操作以改变由所述微生物产生的脂类的脂肪酸特性的重组修饰。
17.如权利要求16所述的微生物，其中所述重组修饰包括编码活性酰基-ACP硫酯酶、酮脂酰-ACP合成酶或脂肪酸去饱和酶或者可操作以减少或消除酰基-ACP硫酯酶、酮脂酰-ACP合成酶或脂肪酸去饱和酶的外源基因。
18.一种用于生产微生物生物质或者生产由所述生物质生产的产品的方法，所述方法包括在包含木糖的培养基中异养地培养如权利要求1至17中任一项所述的重组微生物以便使木糖转化成所述微生物生物质。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述微生物生物质包括微生物脂类。
20.如权利要求18或19所述的方法，其中所述脂类用于制备选自由以下组成的组的产品:化学品、润滑剂、清洁剂、燃料、食用油以及化妆品成分。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述产品是选自生物柴油或可再生柴油的燃料。
22.如权利要求18至20中任一项所述的方法，其中所述培养基包含多于50%木糖的碳源。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述碳源的高于55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%为木糖。
24.—种利用权利要求1至17所述的微生物或权利要求18至23所述的方法中的任一项生产的天然油。
25.一种由权利要求24所述的天然油生产的油类化学品、食用油、燃料或其它产品。
26.—种重组产油微生物，其包含可操作以编码木糖易位体蛋白的外源基因。
27.如权利要求26所述的微生物，其选自由以下组成的组:微藻、产油酵母、产油真菌以及产油细菌。
28.如权利要求27所述的微生物,其为微藻。
29.如权利要求28所述的微藻，其为原藻属的物种。
30.如权利要求29所述的微藻，其为桑椹形原藻。
31.如权利要求26至30中任一项所述的微生物，其中已对所述外源基因进行了密码子优化以用于在所述重组产油微生物中表达。
32.如权利要求26所述的微生物，其中所述木糖易位体的天然质体靶向序列已置换为来自微藻的质体祀向序列。
33.如权利要求26至32中任一项所述的微生物，其中所述木糖易位体包含来自拟南芥属(genus Arabidopsis)的XPT蛋白质的氨基酸序列。
34.一种重组产油微生物，其包含一个或多个外源基因，其中所述一个或多个外源基因可操作以编码以下一种或多种:氧化还原酶途径蛋白、木糖异构酶途径蛋白或者木糖转运体蛋白。
35.如权利要求34所述的微生物，其中所述微生物进一步包含至少一个另外的外源基因，其中所述另外的外源基因可操作以编码选自由以下组成的组的蛋白质:蔗糖转化酶、月旨肪酰基-ACP硫酯酶、脂肪酰基-CoA/醛还原酶、脂肪酰基-CoA还原酶、脂肪醛还原酶、脂肪醛脱羧酶、酰基载体蛋白、去饱和酶、多糖降解酶以及赋予抗生素抗性的蛋白质。
36.如权利要求34或35所述的微生物，其中所述微生物选自由以下组成的组:微藻、产油酵母、产油真菌以及产油细菌。
37.如权利要求36所述的微生物,其为微藻。
38.如权利要求37所述的微藻，其为原藻属的物种。
39.如权利要求38所述的微藻，其为桑椹形原藻。
40.如权利要求34至39中任一项所述的微生物，其中所述一个或多个外源基因可操作以编码选自由以下组成的组的氧化还原酶途径蛋白:木糖还原酶、木糖醇脱氢酶以及木酮糖激酶。
41.如权利要求40所述的微生物，其中所述一个或多个外源基因可操作以编码木酮糖激酶。
42.如权利要求41所述的微生物,其中所述木酮糖激酶包含来自毕赤酵母属(genusPichia)的XYL3蛋白质的氨基酸序列。
43.如权利要求40所述的微生物，其中所述一个或多个外源基团可操作以编码木糖醇脱氢酶。
44.如权利要求43所述的微生物，其中所述木糖醇脱氢酶包含来自所述毕赤酵母属的XYL2蛋白质的氨基酸序列。
45.如权利要求40所述的微生物，其中所述一个或多个外源基团可操作以编码木糖还原酶。
46.如权利要求45所述的微生物，其中所述木糖还原酶包含来自所述毕赤酵母属的XYLl蛋白质的氨基酸序列。
47.如权利要求34至39中任一项所述的微生物，其中所述一个或多个外源基因可操作以编码选自由木糖异构 酶和木酮糖激酶组成的组的木糖异构酶途径蛋白。
48.如权利要求47所述的微生物，其中所述木糖异构酶途径蛋白是木糖异构酶。
49.如权利要求48所述的微生物,其中所述木糖异构酶包含来梨囊鞭菌属(genusPiromyces)的XYLA蛋白质的氨基酸序列。
50.如权利要求47所述的微生物，其中所述木糖异构酶途径蛋白是木酮糖激酶。
51.如权利要求50所述的微生物，其中所述木酮糖激酶包含来自所述毕赤酵母属的所述XYL3蛋白质的所述氨基酸序列。
52.如权利要求34至39中任一项所述的微生物，其中所述一个或多个外源基因可操作以编码选自由XYLA、XYL2、XYL3和XPT组成的组的蛋白质。
53.如权利要求52所述的微生物，其中所述木糖易位体的天然质体靶向序列已置换为来自微藻的质体祀向序列。
54.如权利要求53所述的微生物，其中所述木糖转运体包含来自所述拟南芥属的所述XPT蛋白质的所述氨基酸序列。
55.如权利要求34至39中任一项所述的微生物，其中所述一个或多个外源基因可操作以编码木糖转运体。
56.如权利要求55所述的微生物，其中所述木糖转运体包含来自木霉属(genusTrichoderma)的XLTl蛋白质的氨基酸序列。
57.一种重组产油微生物，其包含编码选自GPT-A-XPT (SEQ ID NO:45) ,GPT-F-XPT (SEQID N0:47)或S106SAD-XPT(SEQ ID N0:49)的一种或多种木糖易位体蛋白的第一外源基因、编码选自 SUTl (SEQ ID NO:37)、GXS1(SEQ ID NO:39)、XLTl (SEQ ID NO:43)或同向转运体(SEQ ID N0:41)的一种或多种木糖转运体蛋白的第二外源基因、编码选自XylA(SEQ IDNO: 15)或XYL3(SEQ ID NO: 51)的一种或多种氧化还原酶途径蛋白的第三外源基因以及编码选自 XYLl (SEQ ID NO:35), XYL2 (SEQ ID NO:50)或 XYL3 (SEQ ID NO:51)的一种或多种木糖异构酶途径蛋白的第四外源基因。
58.如权利要求57所述的微生物，其包含可操作以编码XylA、XYL3、SUTl和GPT-F-XPT的外源基因。
59.如权利要求57所述的微生物，其包含可操作以编码XylA、XYL2、XYL3、XLTl和S106SAD-XPT的外源基因。
60.如权利要求57所述的微生物，其包含可操作以编码XylA、XYLUXYL3、XLTl和S106SAD-XPT的外源基因。
61.如权利要求57所述的微生物，其包含可操作以编码XylA、XYLUXYL3、GXSl和GPT-A-XPT的外源基因。
62.如权利要求57所述的微生物，其包含可操作以编码XYL1、XYL2、XYL3、同向转运体和GPT-F-XPT的外源基因。
63.如权利要求57所述的微生物，其包含可操作以编码XYL1、XYL2、XYL3、GXSl和GPT-F-XPT的外源基因。
64.如权利要求57所述的微生物，其包含可操作以编码XYL2、XYL3、同向转运体和S106SAD-XPT的外源基因。
65.如权利要求57所述的微生物，其包含可操作以编码XYL2、XYL3、XLTl和S106SAD-XPT的外源基因。
66.如权利要求57所述的微生物，其包含可操作以编码XYL2、XYL3、GXS1和GPT-A-XPT的外源基因。
67.如权利要求26至66中任一项所述的微生物,所述微生物在包含多于50%为木糖的碳源的培养基中能够生长或产生脂类。
68.如权利要求67所述的微生物，其中所述微生物在包含多于55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%为木糖的碳源的培养基中能够生长或产生脂类。
69.如权利要求68所述的微生物，其中所述微生物在包含木糖作为唯一碳源的培养基中能够生长或产生脂类。
70.如权利要求69所述的微生物，所述微生物能够产生由在包含葡萄糖作为唯一碳源的培养基中进行培养并且缺乏所述一个或多个外源基因的类似微生物细胞所产生的脂类的至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%或至少60%。
71.—种微生物脂类组合物，其是通过繁殖或培养如权利要求26至66中任一项所述的微生物而产生，包括以下步骤: (a)在包含木糖的培养基中繁殖或培养所述微生物；以及 (b)裂解所述微生物并分离所述微生物脂类组合物。
72.如权利要求71所述的微生物脂类组合物，其中所述培养基进一步包含葡萄糖。
73.如权利要求71所述的微生物脂类组合物，其中所述培养基包含多于50%为木糖的碳源。
74.如权利要求73所述的微生物脂类组合物，其中所述碳源的多于55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90% 或 95% 为木糖。
75.如权利要求74所述的微生物脂类组合物，其中所述培养基包含木糖作为唯一碳源。
76.一种微生物脂类组合物，其是通过繁殖或培养如权利要求26至66中任一项所述的微生物而产生，包括以下步骤: (a)在培养基中提供所述微生物； (b)将解聚的纤维素材料添加到所述培养基中，其中所述纤维素材料包含木糖； (c)繁殖或培养所述微生物直到所述微生物积累其干重的至少约20%作为脂类；以及 (d)裂解所述微生物并分离所述微生物脂类组合物。
77.如权利要求76所述的微生物脂类组合物，其中所述解聚的纤维素材料的木糖浓度为至少约100g/L。
78.如权利要求77所述的微生物脂类组合物，其中所述解聚的纤维素材料的木糖浓度为至少约400g/L。
79.如权利要求77所述的微生物脂类组合物，其中所述解聚的纤维素材料进一步包含葡萄糖。
80.如权利要求79所述的微生物脂类组合物，其中所述解聚的纤维素材料的葡萄糖浓度为至少约100g/L。
81.如权利要求79所述的微生物脂类组合物，其中所述解聚的纤维素材料的葡萄糖浓度为至少约400g/L。
82.如权利要求81所述的微生物脂类组合物，其中所述解聚的纤维素材料的木糖和葡萄糖的总浓度为至少约100g/L。
83.如权利要求76所述的微生物脂类组合物，其中所述解聚的纤维素材料的木糖和葡萄糖的总浓度为至少约400g/L。
84.如权利要求76所述的微生物脂类组合物，其中所述解聚的纤维素材料的木糖和葡萄糖的总浓度为至少约600g/L。
85.如权利要求76所述的微生物脂类组合物，其中所述解聚的纤维素材料的木糖和葡萄糖的总浓度为至少约800g/L。
86.—种生产微生物脂类组合物的方法，其包括繁殖或培养如权利要求26至66中任一项所述的微生物，包括以下步骤: (a)在包含木糖的培养基中繁殖或培养所述微生物；以及 (b)裂解所述微生物并分离所述微生物脂类组合物。
87.如权利要求86所述的方法，其中所述培养基包含多于50%为木糖的碳源。
88.如权利要求87所述的方法，其中所述碳源的多于55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%为木糖。
89.如权利要求88所述的方法，其中所述培养基包含木糖作为唯一碳源。
90.如权利要求89所述的方法，其中所述微生物产生由在包含葡萄糖作为唯一碳源的培养基中进行繁殖或培养并且缺乏所述一个或多个外源基因的类似微生物细胞所产生的脂类的至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%或至少60%。
【文档编号】C12N1/13GK103608450SQ201280022031
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2012年5月4日 优先权日:2011年5月6日
【发明者】P·蔡, A·索曼奇 申请人:索拉兹米公司