调控基因dasR对红色糖多孢菌次级代谢产物合成方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，主要涉及dasR基因对红霉素生产菌红色糖多孢 菌在影响次级代谢产物合成方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 红色糖多孢菌（Saccharopolyspora erythraea)是一种革兰氏阳性丝状细菌，它 最初被认为属于链霉菌属，曾一度被称为"红色链霉菌"（Streptomyces erythraeus)，但是 后来进一步研究发现它其实是属于糖多孢菌属。
[0003] 红色糖多孢菌是红霉素主要生产菌，而红霉素主要用于杀死革兰氏阳性致病菌。 这种大环内酯类的广谱抗生素自J. M. McGurie最初发现至今已逾六十年历史。然而红霉素 因其高效的治疗效果和使用的安全性至今仍然在医药界广泛应用。此后，人们对红霉素A 的分子结构进行改造并由此演变出丰富多样更加有效的衍生物。这些半合成的第二代衍生 物比如克拉霉素（Clarithromycin)和阿奇霉素（Azithromycin)和第三代衍生物酮内酯类 抗菌药（ABT-773和HMR-3647)不仅具有更好的疗效作用，也增加了红霉素A作为初始原料 的使用需求，从而推动了整个红霉素在医药市场的发展。
[0004] 在早期，由于技术落后导致基因组序列信息的匮乏，使人们对于一些产抗生素放 线菌的改造主要基于对野生菌的多轮的随机诱变，进而大量筛选得到高产的突变菌株，这 种近乎暗箱操作的菌株优化方法不仅耗时耗力且往往效率低下。随着测序技术的进步， 2007年剑桥大学的研究者们完成了对红色糖多孢菌野生株（S. erythraea NRRL23338)全 基因组的测序工作，从而使人们对这个重要的工业放线菌的分子改造变得更加有的放矢。
[0005] 通过基因工程改造红色糖多孢菌以提高红霉素产量有两个策略：一是在对 红霉素合成生化途径的了解的基础上，通过理性改造红霉素合成前体甲基丙二酰辅酶 A(Methylmal〇nyl-C〇A)的代谢流，二是在体内高表达调控红霉素合成基因簇的调控基因。 而后者直接提出了对于抗生素合成调控相关基因的研究的紧迫性，这也是目前对于放线菌 领域研究的重要部分。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种通过缺失红色糖多孢菌dasR基因影响次级代谢物产量 的方法及其应用。
[0007] 本发明是通过以下技术方案实现的： 一种调控基因dasR对红色糖多孢菌次级代谢产物合成方法，包括如下步骤：敲除红色 糖多孢菌基因组中的dasR基因，得到突变工程菌； 所述dasR基因的核苷酸序列为序列表中的序列。
[0008] 上述方法中，所述敲除红色糖多孢菌基因组中的dasR基因是通过双交换同源重 组基因敲除的方法，包括如下步骤： 1) 在敲除质粒pUC18-tsr的抗性基因tsr上下游接入预敲除基因dasR的上下约 1500bp的同源臂序列，得到dasR基因缺失的pUC18_dasR质粒； 2) 将dasR基因缺失的质粒通过原生质体转化方法导入到预先制备的红色糖多孢菌野 生株原生质体中，得到dasR基因缺失的突变工程菌； 3) 在含硫链丝菌肽抗性平板上筛选突变工程菌，并通过PCR和测序的方法验证突变 菌。
[0009] 所述红色糖多孢菌为红色糖多孢菌野生株NRRL23338。
[0010] 本发明还提出了一种敲除dasR基因的得到的突变株或上述的突变株在影响次级 代谢物产量中的应用。
[0011] 所述次级代谢物具体为红霉素和红棕色色素。
[0012] 所述dasR基因在调控抗生素产量中的应用；所述dasR基因的核苷酸序列为序列 表中的序列。
[0013] 上述dasR调控次级代谢物产量为降低次级代谢物产量。
[0014] 本发明的实验证明，本发明利用双交换同源重组基因敲除技术构建了 dasR基因 敲除工程菌株，检测其与次级代谢产物的关系，结果为与未敲除的野生型菌株相比，dasR基 因敲除工程菌株产生红霉素和色素的量减少。说明该基因与次级代谢物的产生正相关。
【附图说明】
[0015] 图1为dasR基因敲除工程菌构建技术图及PCR和测序验证图。
[0016] 图2为dasR基因敲除工程菌与野生菌的生长和红霉素合成效果图。
[0017] 图3为dasR基因敲除工程菌与野生菌色素合成的效果图。
[0018]
【具体实施方式】
[0019] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0020] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0021] 下述实施例中培养基配方如下： LB培养基：胰蛋白胨（Tryptone)10g/L，酵母提取物（Yeast extract) 5g/L，氯化钠 10g/L，将pH调节至7. 0,121°C高温高压灭菌20分钟，烘箱干燥后置于常温备用。
[0022] TSB液体培养基：称取商品化的TSB培养基干粉30g溶于800ml去离子水定容至 1L，分装所需小玻璃摇瓶（对于所有放线菌的培养需加入一定量的玻璃珠），于115°C高压 灭菌，烘箱干燥后置于常温备用。
[0023] R2YE固体培养基：蔗糖103g，硫酸钾0? 25g，氯化镁10. 12g，葡萄糖10g，酪蛋白氨 基酸水解物（Casamino acids) 0. lg，用双蒸水800ml溶解后，分装80ml/瓶，并加入2. 2g 细菌学琼脂，121°C高压灭菌。在使用前再在每瓶中加入0. 5 %磷酸二氢钾溶液lml，3. 68% 氯化钙溶液8ml，20 % L-脯氨酸1. 5ml，5. 73 % pH 7. 2TES缓冲液10ml，微量元素混合液 0. 2ml，1N氢氧化钠0. 5ml，10 %酵母提取物溶液5ml。
[0024] 微量元素混合液（Trace element solution):氯化锌40mg，氯化铁200mg，氯化铜 l〇mg，氯化猛10mg，硼酸钠10mg，钼酸铵10mg，溶解到1L去离子水。
[0025] 实施例1 利用双交换同源重组基因敲除技术构建dasR基因敲除工程菌 1. 1 dasR基因敲除质粒的构建 pUC18-tsr质粒是在pUC18质粒的BamH I和Sma I酶切位点之间插入1. 36kb的硫链 丝菌肽抗性基因（tsr)。为了敲除红色糖多孢菌基因组中的dasR基因，分别用dasR-up-fw/ rev和dasR-dw-fw/rev为引物，以红色糖多孢菌基因组为模板，PCR扩增dasR基因的上下 游各约1. 5kb的同源臂DNA片段。
[0026] 扩增上同源臂DNA片段所用引物为： dasR-up-fw:5' -AACTGCAGGTCTCGGCCAGCTTCAGGG-3r dasR-up-rev:5'-GCGGGATCCCGTTCCTCCTACCACCGCAA-3' 扩增下同源臂DNA片段所用引物为： dasR-dw-fw:5'-TATGGTACCTACAAGTTCGTCGCCCGC-3' dasR-dw-rev:5'-CCGGAATTCCACCGACCTCAGCGTTTACG-3' 分别将上述上游/下游两个同源臂片段DNA连接到pUC18-tsr质粒的tsr抗性基因两 侦牝构建完成敲除质粒pUC18-dasR。
[0027] 1. 2红色糖多孢菌原生质体制备方法： 1) 按1 %接种红色糖多孢菌野生株于50ml TSB (含0. 4g甘氨酸）液体培养基，30°C摇 床振荡培养至生长对数期，镜检观察菌体是否有杂菌污染； 2) 3000rpm离心10min收集菌体，用事先灭菌的20ml蔗糖溶液（10. 3% )吹打洗涤一 次，再用l〇ml改P缓冲液洗涤两次； 3) 用10ml改P缓冲