用于生物合成白藜芦醇的融合基因、表达载体及制备方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种用于生物合成白藜芦醇的融合基因、蛋白、表达载体及应用，具体 属于基因工程领域。
【背景技术】
[0002] 白藜芦醇是植物在受到外界逆境刺激时产生的一种植物保护素，常见的植物生长 逆境有紫外线辐射、真菌感染以及机械损伤等，而白藜芦醇是少数几种高等植物受到真菌 感染、损伤及紫外线辐射时产生的一种植保素，是一种非常重要的次级代谢产物。作为红葡 萄酒的有效成分，它可预防多种疾病，如抗凝血、抗氧化、抗炎免疫、抗癌、心血管保护和神 经保护等作用。因此，白藜芦醇被誉为继紫杉醇之后又一新的绿色抗癌药物。然而，一般植 物中白藜芦醇的含量都比较低，难以满足市场的需求。生物合成白藜芦醇是目前的研究热 点，该法不仅可以克服植提法所面临的生态破坏与资源匮乏问题，也可以解决化学合成法 所带来的环境污染问题。
[0003] 融合基因技术是将两个或多个表达不同功能蛋白的基因通过分子生物学的手段 连接起来，从而能够编码出具有多个功能的复合蛋白。在每个蛋白之间都需要一个起过渡 连接作用的柔性氨基酸链（1 inker)，这样使得最终得到的融合蛋白不仅具有所有蛋白酶的 活性，而且还能够增加总酶促反应速率。研究表明，在构建融合基因时，首先应该删除上游 基因的终止密码子与下游基因的起始密码子，这样才能实现两个基因的融合表达。基因融 合技术在微生物合成白藜芦醇的过程中，对于提高产率具有较好的指导意义。
[0004] 近10年来，生物合成白藜芦醇一直是科学界的研究热点，该方法不仅可以克服植 提法所面临的生态破坏与资源匮乏等问题，也可以解决化学合成法所带来的环境污染问 题。目前，国内很多研究学者对白藜芦醇合酶基因（RS)研究的比较深入，但是他们研究主 要局限在将该基因转化到目标植物，对于将该基因转化到微生物中仍然面临着微生物表达 不稳定以及目标产物得率比较低等问题。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种用于生物合成白藜芦醇的融合基因、蛋白、表达载体。
[0006] 另一目的是提供一种用于生物合成白藜芦醇的融合基因的制备及表达方法。
[0007]另一目的是提供一种利用重组菌株发酵制备白藜芦醇的方法。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明采用技术方案如下：
[0009] -种用于生物合成白藜芦醇的融合基因，它是由拟南芥的对香豆酰辅酶A连接酶 基因与花生的白藜芦醇合酶基因融合得到的4CL: :RS融合基因，是SEQ ID NO. 1所示的 核苷酸序列。测序结果表明，4CL : :RS融合基因全长为2895bp，包括去除终止密码子的4CL 基因片段（1693bp)、去除起始密码子的RS基因片段（1167bp)以及柔性linker的45个核 苷酸，与原设计一致。DNAMAN软件分析构建的4CL : :RS融合基因的核苷酸序列及其编码的 氨基酸序，加框的ATG为4CL : :RS融合基因的起始密码子，中间45个加框序列为linker 的核苷酸序列，下划线序列CCATGG，GGATCC，GAATTC分别代表着Nco I、BamH I和EcoR I酶 切位点。
[0010] 用于生物合成白藜芦醇的融合基因编码的蛋白质，它是SEQ ID No. 2所示的氨基 酸序列。分析表明4CL::RS融合基因共编码964个氨基酸，分子量（Mr)为104. 7kDa，pi 为 5. 63。
[0011] 含有上述融合基因的表达载体pET-30a/4CL: :RS。
[0012] 前述融合基因的制备及表达方法，具体为：首先在大肠杆菌中克隆拟南芥4CL基 因与花生RS基因，通过基因融合技术将4CL基因与花生RS基因融合起来，选择大肠杆菌作 为宿主菌株，实现4CL : :RS融合基因在原核中的表达；所述的基因融合技术采用的是长度 为15个氨基酸的柔性Linker，其氨基酸序列为（GGGGS) 3，并将其对应的核苷酸序列设计为 ggt gga ggc RRa tcc ggc gga ggt ggc tct ggc ggt ggc gga tcg，戶斤述划线序列为BamH I酶切位点，通过多步PCR反应、BamH I单酶切反应以及连接反应，构建融合基因4CL:: RS，随后，通过Nco I与EcoR I酶切位点构建原核表达载体pET-30a/4CL : :RS，在28°C诱 导表达8h，分别通过Proteinlso? Ni-NTA Resin纯化及Western blot分析验证所构建的 原核表达载体pET-30a/4CL : :RS能够表达目的融合基因4CL : :RS，即所得到的重组菌株 BL21 (DE3)携带重组质粒 pET-30a/4CL::RS。
[0013] 所采用的引物分成两条设计，4CL: :RS-FJP4CL: AS-Ri为第一个基因4CL的 上、下游引物，4CL: :RS-F#引入了 Nco I酶切位点CCA TGG，4CL: AS-Ri在引入BamH I 酶切位点的同时又将4CL基因的终止密码子TAG敲除；4CL : :RS-F21、4CL : :RS-F22、4CL :: RS-R2为第二个基因（RS)的上、下游引物引物，4CL : : RS-F 22在引入BamH I酶切位点的同 时又将RS基因的起始密码子ATG敲除，在下游引物4CL : :RS-R2*引入酶切位点EcoR I。
[0014] 利用前述重组菌株发酵制备白藜芦醇的方法，包括以下步骤：
[0015](一）重组菌株的活化
[0016] (1)将-80°c保存的重组菌株的甘油菌放置在38°C~40°C水浴中，不断摇动直至 全部融化成液状；
[0017] (2)无菌条件下，用接种环将少量融化的菌种划线在含有硫酸卡钠霉素的平板 上；
[0018] (3)将划线后的平板密封后，37°C条件下静置15min，最后将其在37°C的恒温培养 箱中倒置培养12h后观察菌落；
[0019](4)无菌条件下，挑取平板上的单菌落至lmL的LB体培养基，在37°C，200rpm条件 下过夜培养；
[0020] (二）发酵转化及其产物的提取
[0021] (1)无菌条件下，将500 y L活化后的重组菌液按1 : 50的接种比例接种至50mL 新鲜且预热的LB培养基；
[0022] (2) 37°C，200rpm的恒温培养箱中培养2h，培养基中发酵菌液的0D6。。值为0. 2 ;
[0023] (3)在200 y L DMS0中溶解0? 00821g的对香豆酸，摇匀充分溶解；
[0024] (4)在无菌条件下，将上述配置的对香豆酸溶液全部加入到发酵菌液中，此时对香 豆酸的终浓度为ImM ;
[0025](5) 28 °C，200rpm的恒温培养箱中发酵培养48h;
[0026] (6)充分摇匀发酵液，无菌条件下取lmL发酵液放置于1.5mL的离心管中， 13000rpm 离心 3min;
[0027] (7)将上清液转至新的离心管中并添加50 y L的0. lmol/1的HC1，-20°C冷冻过 夜；
[0028] (8)室温条件下，将冷冻离心管缓慢解冻并加入lmL的乙酸乙酯萃取，重复3次；
[0029] (9)萃取结束后，将乙酸乙酯相合并并用氮吹仪将其吹干；
[0030] (10)最后将所得残留成分溶解于lmL的色谱甲醇中，进样前置于-20°C保存。
[0031] (三）产物检测
[0032] 将步骤（二）得到的产物经过高效液相色谱检测及紫外吸收检测，与白藜芦醇标 品的色谱图和紫外吸收图进行比较，洗脱时间为13min左右时有一个明显的色谱峰，该色 谱峰的洗脱时间和对应的紫外吸收波长通过与白藜芦醇的标准品相对比，证实了发酵产物 中含有白藜芦醇。
[0033] 本发明的有益效果是：
[0034] (1)根据引物设计原则，若将linker核酸序列中BamH I酶切位点后的序列都设计 到第二个基因（RS)的上游引物中，会使得此条引物的长度高达63bp，这样会大大降低引物 特异性，因此本发明将此条引物分成两条设计：4CL : :RS-FJP 4CL : :RS-R i为第一个基因 (4CL)的上、下游引物，4CL: :RS-F#引入了 Nco I 酶切位点（CCA TGG)，4CL: :RS-R^ 引入BamH I酶切位点的同时又将4CL基因的终止密码子TAG敲除；4CL : :RS-F21、4CL :: RS-F22、4CL: :RS-R2为第二个基因（RS)的上、下游引物引物，4CL: :RS-F22在引入BamH I 酶切位点的同时又将RS基因的起始密码子ATG敲除，在下游引物4CL : :RS-R2中引入酶切 位点EcoR I(GAA TTC)，这样大大降低了引物的特异性。
[0035] (2)本发明成功构建了重组菌，并且对发酵工艺条件如培养及种类、添加底物浓 度、发酵温度、发酵时间以及诱导剂浓度等方面进行进一步优化，使得目标产物白藜芦醇的 产量和摩尔转化率都较高。
【附图说明】
[0036] 图1是本发明拟南芥4CL基因扩增程序不意图。
[0037] 图2是本发明菌液PCR反应程序示意图。
[0038] 图3是本发明4CL::RS基因片段I的PCR扩增程序示意图。
[0039] 图4是本发明4CL::RS基因片段II的PCR扩增程序示意图。
[0040] 图5是本发明4CL: :RS基因PCR扩增程序示意图。
[0041] 图6是本发明基因片段I、基因片段II与4CL: :RS的电泳图。
[0042]其中，M :BM5000Marker ;1-2:基因片段 I ;3-4:基因片段 II ;5-6 :4CL::RS
[0043] 图7是本发明pET_30a/4CL::RS的菌液PCR鉴定电泳图。
[0044] 其中，M :BM5000Marker;1-6:阳性菌扩增片段；7:阴性对照；8:阳性对照
[0045] 图8是本发明pET_30a/4CL: :RS的酶切鉴定电泳图。
[0046] 其中，M:蛋白分子量Marker ;1:未纯化蛋白；2 :Ni_NTA纯化蛋白
[0047] 图9是本发明4CL: :RS融合蛋白SDS-PAGE电泳图。
[0048]其中，M:蛋白分子量Marker ;1:未纯化蛋白；2 :Ni_NTA纯化蛋白
[0049] 图10是本发明融合蛋白4CL::RS的Western blot分析图。
[0050]其中，1 :5yL样品；2 :10yL样品；3 :15yL样品；4 :20yL样品
[0051]图11是本发明白藜芦醇标准曲线。
[0052]图12a为本发明白藜芦醇标品的色谱图。
[0053] 图12b为本发明重组菌发酵产物色谱图。
[0054]图13a为本发明白藜芦醇标品紫外吸收图。
[0055]图13b为本发明发酵产物的紫外吸收图。
【具体实施方式】
[0056] 如果没有特别说明，本发明所采用的各种药品、试剂等均能从市场上获得，对于不 能够直接购买的菌株或质粒，都能够按照现有技术给出的方法制备而得。
[0057] 实施例1 4CL :