专利名称：爬山虎属及近缘属中白藜芦醇芪合酶基因及其应用方法
技术领域：
本发明克隆了川鄂爬山虎(Parthenocissus henryana)、五叶爬山虎(Parthenocissus quinquefolia L.Planch)及菱叶粉藤(Cissus rhombifoliaPlanch)的三个长度均为1.2kb的白藜芦醇芪合酶基因(STS)全序列。三个基因的同源性甚高，达97.8％。该基因编码产物芪合酶(Stilbene synthase)催化底物丙二酰-CoA和苯丙酰-CoA合成白藜芦醇。白藜芦醇具有很多的医疗保健作用，如防止血小板凝聚、防止人体低密度脂蛋白氧化、清除自由基、消炎、抗过敏、抗肿瘤等，因此在各国引起高度重视。由于白藜芦醇的这些保健功能，它的含量高低已经成为葡糖酒质量好坏评价的一个重要指标。已经发现白藜芦醇在葡萄属及另外的一些物种中存在。实验证明可以通过转基因的途径使一些不含白藜芦醇的物种也具备合成白藜芦醇的能力，从而提高这些物种的营养保健功能。也可以通过控制植物次生代谢途径的生物反应器来生产白藜芦醇。上述三个克隆的基因，经在GenBank上检索，证实为新的基因序列。
本发明的主要创新之点在于(1)首次从爬山虎属及近缘白粉藤属中克隆白藜芦醇芪合酶基因；(2)构建了白藜芦醇芪合酶基因的植物表达载体，通过转基因的途径使一些不含白藜芦醇的物种也具备合成白藜芦醇的能力，从而提高这些物种的营养保健功能；(3)可通过强启动子的使用，提高芪合酶的表达量，促进白藜芦醇的生物合成。
白藜芦醇是植物的次生代谢产物，由芪合酶催化底物合成。天然含有芪合酶基因的植物只有在遭受环境压或病原菌攻击时，才能激发该基因的转录并转译为芪合酶，进而瞬时合成白藜芦醇。遗憾的是，绝大多数植物缺少STS基因，却含有芪合酶作用的底物。同时，白藜芦醇仅存在于少数可食食物中，且含量甚低。因此，可以通过基因工程的方法构建含STS基因的植物表达载体，再把此基因转入到不含STS的植物，或者含STS但表达量不高的植物当中去，将有可能在这些植物中获得含量较高的白藜芦醇。
本项发明的技术要点之一是从爬山虎属及近缘白粉藤属中克隆白藜芦醇芪合酶基因。从已发表的Vitis vinifera，Vitis labrusca以及Vitis ripuria的芪和酶(STS)基因序列的比较中可以看出，STS基因主要由两个外显子和一个内含子组成。这三个序列在转录开始位点和终止位点附近的的碱基序列相对较为保守，同时三个序列外显子的同源性极高。根据STS基因转录起始和终止位点附近碱基很高的保守性，我们设计了两条引物(P1、P2)，将STS全长序列从爬山虎属及近缘白粉藤属cDNA文库中克隆出来。
本项发明的要点之二是白藜芦醇芪合酶基因的植物表达载体pM3T1ΩBM3的构建。将2a12启动子置于STS基因上游，得到中间载体p7Z-T1-2a12。然后将增强型启动子35SΩ置换掉2a12启动子，得到中间载体p7Z-T1Ω。将35SΩ-T1通过ApaI+SacI双酶切放入植物表达载体p3300T1M3中，然后在插入MAR3元件，构建成植物表达载体pM3T1ΩBM3。
在本发明的一个实施方案中，我们设计了两条引物(P1、P2)，将STS全长序列从爬山虎属及近缘白粉藤属cDNA文库中克隆出来。引物序列如下P15’-CGG GAT CCG CCA TGG CTT CAG TTG AGG AAT TTA G-3’P25’-GTG AGC TCG AAG GGT AAA CCA TTC TCT TTT AT-3’在本发明的一个实施方案中，STS基因置于改造的组成型表达启动子CaMV35SΩ启动子的调控之下，得到中间载体p7Z-T1Ω。将35SΩ-T1通过ApaI+SacI双酶切放入植物表达载体p3300T1M3中，然后在插入MAR3元件，构建成植物表达载体pM3T1ΩBM3(见图一、爬山虎属及近缘白粉藤属中白藜芦醇芪合酶基因植物表达载体pM3T1ΩBM3的构建流程图)。
此专利涉及的菌种已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，单位地址中国北京中关村，该微生物分类名称为大肠埃希氏菌(Ecoli.)，保藏代号为pM3T1ΩBM3，保藏编号为CGMCC NO.0722，保藏日期为2002年3月8日。
序列表一、川鄂爬山虎STS基因序列1 CGGGATCCGC CATGGCTTCA GTTGAGGAAT TTAGAAACGC TCAACGTGCC AAGGGTCCGG61 CCACCATCCT AGCCATTGGC ACAGCTACTC CCGACCAGTG TGTCTACCAG TCTGATTATG121 CTGATTACTA TTTTAGGGTC ACTAAGAGCG AGCACATGAC TGAGTTGAAG AAGAAGTTCA181 ATCGCATATG TGAAAAATCA ATGATCAAGA AGCGTTATAT TCATTTGACT GAAAAGATGC241 TTGAGGAGCA CCCAAACATT GGTGCTTATA TGGCTCCATC TCTTAACATA CGCCAAGAGA301 TTATCACTGC CGAGGTACCC AAGCTTGGTA AAGAAGCAGC ATTGAAGGCT CTTAAAGAGT361 GGGGTCAACC CAAATCCAAG ATTACCCATC TTGTATTTTG TACCACCTCT GGTGTAGAAA421 TGCCTGGTGC CGACTATAAA CTCGCTAATC TCTTAGGCCT CGAAACATCT GTTAGAAGAG481 TGATGTTGTA TCATCAAGGT TGCTATGCAG GTGGAACTGT CCTTCGAACT GCTAAGGATC541 TTGCAGAGAA TAATGCAGGA GCACGAGTTC TTGTGGTGTG CTCTGAGATC ACTGTTGTCA601 CATTCCGTGG ACCTTCCGAA ACTGCTTTGG ACTCTTTAGT TGGCCAAGCC CTTTTTGGTG661 ATGGGTCTGC AGCTGTGATC GTTGGATCAG ATCCAGATAT CTCGATTGAA CAACCACTTT721 TTCAACTCGT CTCAGCAGCC CAAACATTTA TTCCTAATTC AGCAGGTGCC ATTGCCGGGA781 ACTTACGTGA GGTGGGACTC ACATTTCATT TGTGGCCCAA TGTGCCAACT TTAATTTCTG841 AGAACATAGA GAAATGCTTG ACTCAGGCTT TTGACCCACT TGGTATTAGC GATTGGAACT901 CGTTATTTTG GATTGCTCAC CCAGGTGGCC CTGCAATTCT TGATGCGGTT GAAGCAAAAC961 TCAATTTAGA CAAAAAGAAA CTTGAAGCAA CGAGGCATGT GTTAAGTGAG TATGGCAACA1021TGTCAAGTGC ATGTGTGTTG TTTATTTTGG ATGAGATGAG AAAGAAATCA CTTAAGGGGG1081AGAAGGCCAC CACAGGTGAA GGATTGGATT GGGGAGTATT ATTTGGCTTT GGATCAGGCT1141TGACTATTGA GACTGTTGTG TTGCATAGCA TTCCTATGGT TACAAATTAA ATAAAAGAGA1201ATGGTTTACC CTTCGAGCTC ACAATCAC二、菱叶粉藤STS基因序列1 CGGGATCCGC CATGGCTTCA GTTGAGGAAT TTAGAAACGC TCAACGTGCC AAGGGTCCAG61 CTACCATCCT AGCCATTGGC ACAGCTACTC CCGATCAGTG TGTCTACCAG TCTGATTATG121 CTGATTACTA TTTCCGGGTC ACTAAGAGCG AGCACATGAC TGAGTTGAAG AAGAAGTTCA181 ATCGCATATG TGAGAAATCA ATGATCAAGA AGCGTTACAG TCATTTGACC GAAGAAATGC241 TCGAGGAGCA CCCAAACATT GGTGCTTATA TGGCTCCATC TCTTAACATA CGCCAAGAGA301 TTATCACTGC TGAGGTACCT AAGCTTGGTA AGGAAGCAGC ATTGAAGGCT CTAAAAGAGT361 GGGGCCAGCC AAAGTCCAAG ATCACCCATC TTGTATTTTG TACAACCTCC GGTGTAGAAA421 TGCCTGGTGC AGATTACAAA CTCGCTAATC TCTTAGGGCT TGAAACATCG GTCAGAAGAG481 TGATGTTGTA CCATCAAGGG TGCTATGCAG GTGGAACTGT CCTCCGAACT GCTAAGGATC541 TTGCAGAGAA TAATGCAGGA GCACGAGTTC TTGTGGTGTG CTCTGAAATC ACTGTTGTTA601 CATTCCGTGG GCCTTCTGAA ACCGCTTTGG ACTCTTTAGT TGGTCAAGCC CTTTTTGGTG661 ATGGGTCTGC AGCTGTGATC GTTGGATCAG ATCCAGATAT CTTGATTGAA CGACCGCTCT721 TCCAACTCGT CTCAGCAGCC CAAACATTTA TTCCTAATTC AGCAGGTGCC ATTGCCGGGA781 ACTTACGTGA GGTGGGACTC ACCTTCCATT TGTGGCCCAA TGTGCCTACT TTAATTTCTG841 AGAACATAGA GAAATGCTTG ACTCAGGCTT TTGACCCACT TGGTATTAGC GATTGGAACT901 CGTTATTTTG GATTGCTCAC CCAGGTGGTC CAGCTATTCT TGACGCGGTT GAAGCAAAAC961 TCAGTTTAGA TAAACAAAAA CTCGAAGCAA CGAGGCATGT GCTAAGTGAG TATGGCAACA1021TGTCAAGTGC ATGTGTGTTG TTTATTTTGG ATGAGATGAG AAAAAAATCC CTTAAGGGGG1081AGAAGGCCAC CACAGGTGAA GGATTGGATT GGGGAGTATT ATTCGGTTTT GGCCCAGGTT1141TGACTATTGA GACTGTTGTG TTGCATAGCA TTCCTATGGT TACAAATTAA GTGAAATAAA1201AGAGAATGGT TTACCCTTCG AGCTCACAAT CAC三、五叶爬山虎STS基因序列1 TGGGATCCGC CATGGCTTCA GTTGAGGAAT TTAGAAACGC TCAACGTGCA AAGGGTCCAG61 CCACCATCCT AGCCATTGGC ACAGCTACTC CCGACAACTG TGTCTATCAG TCAGATTATG121 CTGATTTCTA CTTCAGGGTC ACTAAGAGCG AGCACATGAC TGAGTTGAAG AAGAAGTTCA181 ATCGCATATG TGAGAAATCA ATGATCAAGA AGCGTTACAG TCATTTGACC GAAGAAATGC241 TCGAGGAGCA CCCAAACATT GGTGCTTATA TGGCTCCATC TCTTAACATA CGCCAAGAGA301 TTATCACTGC TGAGGTACCT AAGCTTGGTA AGGAAGCAGC ATTGAAGGCT CTAAAAGAGT361 GGGGCCAGCC AAAGTCCAAG ATCACCCATC TTGTATTTTG TACAACCTCC GGTGTAGAAA421 TGCCTGGTGC AGATTACAAA CTCGCTAATC TCTTAGGGCT TGAAACATCG GTCAGAAGAG481 TGATGTTGTA CCATCAAGGG TGCTATGCAG GTGGAACTGT CCTCCGAACT GCTAAGGATC541 TTGCAGAGAA TAATGCAGGA GCACGAGTTC TTGTGGTGTG CTCTGTAATC ACTGTTGTTA601 CATTCCGTGG GCCTTCTGAA ACCGCTTTGG ACTCTTTAGT TGGTCAAGCC CTTTTTGGTG661 ATGGGTCTGC AGCTGTGATC GTTGGATCAG ATCCAGATAT CTTGATTGAA CGACCGCTCT721 TCCAACTCGT CTCAGCAGCC CAAACATTTA TTCCTAATTC AGCAGGTGCC ATTGCCGGGA781 ACTTACGTGA GGTGGGACTC ACCTTCCATT TGTGGCCCAA TGTGCCTACT TTAATTTCTG841 AGAACGTAGA GAAATGCTTG ACTCAGGCTT TTGACCCACT TGGTATTAGC GATTGGAACT901 CGTTATTTTG GATTGCTCAC CCAGGTGGTC CAGCTATTCT TGACGCGGTT GAAGCAAAAC961 TCAGTTTAGA TAAACAAAAA CTCGAAGCAA CGAGGCATGT GCTAAGTGAG TATGGCAACA1021TGTCAAGTGC ATGTGTGTTG TTTATTTTGG ATGAGATGAG AAAAAAATCC CTTAAGGGGG1081AGAAGGCCAC CACAGGTGAA GGATTGGATA GGGGAGTATT ATTCGGTTTT GGCCCAGGTT1141TGACTATTGA GACTGTTGTG TTGCATAGCA TTCCTATGGT TACAAATTAA GTGAAATAAA1201AGAGAATGGT TTACCCTTCG AGCTCACAAT CAC
权利要求
1.川鄂爬山虎(Parthenocissus henryana)1.2kb的白藜芦醇芪合酶基因(STS)全序列。包括该基因的全部序列及部分序列均在权利要求之内。
2.五叶爬山虎(Parthenocissus quinquefolia L.Planch)1.2kb的白藜芦醇芪合酶基因(STS)全序列。包括该基因的全部序列及部分序列均在权利要求之内。
3.菱叶粉藤(Cissus rhombifolia Planch)1.2kb的白藜芦醇芪合酶基因(STS)全序列。包括该基因的全部序列及部分序列均在权利要求之内。
4.爬山虎属及近缘白粉藤属中白藜芦醇芪合酶基因(STS)的应用。包括利用此基因构建植物表达载体，使植物产生白藜芦醇或增强白藜芦醇的含量，也包括利用此基因构建原核表达载体表达该编码蛋白及其应用，包括利用此基因构建的各种融合基因及其应用。
5.根据权利要求1。将STS基因作适当改造之后的序列构建植物表达载体，以产生白藜芦醇，亦在本专利权要求之内。
6.根据权利要求4。STS基因所用的启动子除了CaMV 35SΩ外，利用其它启动子驱动STS基因表达在本专利权要求之内。
全文摘要
本发明克隆了川鄂爬山虎(Parthenocissushenryana)、五叶爬山虎(Parthenocissus quinquefolia L.Planch)及菱叶粉藤(Cissus rhombifolia Planch)的三个长度均为1.2kb的白藜芦醇芪合酶同源基因(STS)全序列。该基因编码产物芪合酶(Stilbene synthase)催化底物丙二酰－CoA和苯丙酰－CoA合成白藜芦醇。天然产物白藜芦醇有很多的医疗保健作用,如防止血小板凝聚、防止人体低密度脂蛋白氧化、清除自由基、消炎、抗过敏、抗肿瘤等。实验证明可以通过转基因的途径使一些不含白藜芦醇的物种也具备合成白藜芦醇的能力,从而提高这些物种的营养保健功能。也可以通过增强芪合酶表达的植物生物反应器来生产白藜芦醇。
文档编号C07H21/00GK1382693SQ0210417
公开日2002年12月4日 申请日期2002年3月15日 优先权日2002年3月15日
发明者林忠平, 钟瑾, 倪挺, 胡鸢雷, 高音 申请人:林忠平