甲醇混合配成浓度分别为lmg/L，5mg/L， 10mg/L，50mg/L，100mg/L，200mg/L的标准品溶液。经过高效液相色谱测定，测定方法见 5.2. 1，每个浓度做3个重复，记录白藜芦醇浓度与峰面积的数据。最后，根据实验结果建立 了白藜芦醇标品的色谱峰面积与其浓度的线性回归方程（图11)，这为后续发酵试验定量 分析白藜芦醇的浓度提供了理论依据。
[0312]2、重组菌发酵合成白藜芦醇
[0313] 2.1重组菌种的活化
[0314] 重组菌的活化就是将低温保存的甘油重组菌重新接种于新鲜且预热的培养基 (含相应抗生素）中扩大培养，通过多次扩培筛选后得到生长良好、菌种单一与状态稳定的 目的重组菌。活化后的重组菌可以通过菌液PCR、酶切反应以及测序来鉴定所得到的重组菌 是否发生变异。具体活化操作如下：
[0315] (1)将_80°C保存的甘油菌立即放置在38°C -40°C水浴中，不断摇动直至全部融化 成液状；
[0316] (2)无菌条件下，用接种环将少量融化的菌种划线在含有硫酸卡钠霉素的平板 上；
[0317] (3)将划线后的平板密封后（可用封口膜），37°C条件下静置15min(吸收菌液），
[0318] 最后将其在37°C的恒温培养箱中倒置培养12h后观察菌落；
[0319](4)无菌条件下，挑取平板上的单菌落至lmL的LB体培养基（Kan+，30mg/L)，在 37°C，200rpm条件下过夜培养。
[0320] 活化后的重组菌液应该放置在4°C冰箱中保存，为后续的发酵实验做准备。若重组 菌液保存时间超过一周，需重新扩培活化与鉴定。
[0321] 2. 2发酵转化及其产物的提取
[0322] 通过第四章的研究，我们已经得到了能够表达目的融合蛋白4CL : :RS的重组菌 株。然而，对于表达的融合蛋白4CL : :RS是否具有对香豆酰辅酶辅酶A以及白藜芦醇合酶 的双重催化活性，我们需通过底物的转化或发酵产物的生成来检测。本实验中添加的底物 为对香豆酸（终浓度为ImM)，通过酶促转化以后可以形成白藜芦醇。利用HPLC检测产物 中是否有白藜芦醇的生成以及生成的含量。最后，通过白藜芦醇的产量计算出对香豆酸的 转化率。Watts等?研究发现，在重组大肠杆菌中构建苯丙烷代谢途径时，经过发酵转化 以后，仅有不超过5%的代谢产物存在于微生物细胞中，其余大部分都存在于发酵液中。因 此，本研究在分析白藜芦醇的产量时，首先将适量的重组菌发酵液离心，然后对其上清液的 成分进行分析。发酵实验过程具体如下：
[0323] (1)无菌条件下，将500 y L活化后的重组菌液按1 : 50的接种比例接种至50mL 新鲜且预热的LB培养基（Kan+，30mg/L);
[0324](2) 37°C，200rpm的恒温培养箱中培养2h (0D6。。值约为0? 2);
[0325] (3)在200 y L DMS0中溶解0? 00821g的对香豆酸，摇匀充分溶解；
[0326] (4)在无菌条件下，将上述配置的对香豆酸溶液全部加入到发酵菌液中，此时对香 豆酸的终浓度为ImM ;
[0327](5) 28°C，200rpm的恒温培养箱中发酵培养48h ;
[0328] (6)充分摇匀发酵液，无菌条件下取lmL发酵液放置于1. 5mL的离心管中， 13000rpm 离心 3min ;
[0329] (7)小心将上清液转至新的离心管中并添加50 y L的HC1 (1M)，-20°C冷冻过夜；
[0330] (8)室温条件下，将冷冻离心管缓慢解冻并加入lmL的乙酸乙酯萃取，重复3次；
[0331] (9)萃取结束后，将乙酸乙酯相合并并用氮吹仪小心地将其吹干；
[0332] (10)最后将所得残留成分溶解于lmL的色谱甲醇中，进样前置于-20°C保存。
[0333] 3结果及分析
[0334] 3. 1高效液相色谱检测及紫外吸收
[0335] 图12a为白藜芦醇标品的色谱图，在保留时间为13min左右时有一明显的色谱峰， 对应的紫外吸收波长为305. 7nm(图13a)〇
[0336]图12b为重组菌发酵产物色谱图，保留时间为8min时有一明显的色谱峰，其对应 的紫外吸收波长为310. 4nm(图13b)，与对香豆酸标准品的色谱图及紫外吸收图对比，表明 此峰代表的是对香豆酸，即未转化的底物。在色谱图12b中，洗脱时间约为13min时还有一 个明显的色谱峰，该色谱峰的洗脱时间和对应的紫外吸收波长通过与白藜芦醇的标准品相 对比，证实了发酵产物中含有白藜芦醇。
[0337] 实验结果表明，本研究构建的重组菌株所表达的融合蛋白4CL : :RS具有很好的催 化活性，能够催化底物对香豆酸转化为白藜芦醇。
[0338] 3. 2白藜芦醇的产量及其转化率
[0339] 3. 2. 1白藜芦醇的产量
[0340] 通过对发酵产物的色谱图及紫外吸收图进行分析，我们已经证实了重组菌的发酵 液中含有白藜芦醇。至于发酵产物中白藜芦醇的含量可以根据色谱峰的峰面积并结合建立 的白藜芦醇标准曲线求得。对重组菌发酵产物的色谱峰进行手动积分三次，所得平均峰面 积为2005281，由白藜芦醇的标准曲线可以得到产物的进样浓度为80. 524mg/L。根据样品 提取时每步所对应的稀释倍数，推算出原发酵液中白藜芦醇的浓度为80. 524mg/L，即摩尔 浓度为〇. 3528mM。
[0341] 5. 3. 2. 2白藜芦醇的摩尔转化率
[0342] 利用重组微生物将底物生物转化为目标产物时，为了衡量重组菌的生物转化能力 需要对底物的利用率做出计算。白藜芦醇的摩尔转化率是指在白藜芦醇的生物合成过程 中，单位摩尔的对香豆酸经过重组菌发酵转化以后生成白藜芦醇的摩尔数。本研究中，所使 用的底物浓度为ImM，而发酵液中白藜芦醇的摩尔浓度为0. 3528mM。根据此定义，可以计算 出本研究的白藜芦醇的摩尔转化率为35. 28%。
【主权项】
1. 一种用于生物合成白藜芦醇的融合基因，其特征在于，它是由拟南芥的对香豆酰辅 酶A连接酶基因与花生的白藜芦醇合酶基因融合得到的4CL ::RS融合基因，是SEQ ID NO. 1 所示的核苷酸序列。2. 权利要求1所述的用于生物合成白藜芦醇的融合基因编码的蛋白质，其特征在于， 它是SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。3. -种含有权利要求1所述融合基因的表达载体pET-30a/4CL : :RS。4. 如权利要求1~3任一项所述的融合基因的制备及表达方法，其特征在于，首先在大 肠杆菌中克隆拟南芥4CL基因与花生RS基因，通过基因融合技术将4CL基因与花生RS基 因融合起来，选择大肠杆菌作为宿主菌株，实现4CL : :RS融合基因在原核中的表达；所述 的基因融合技术采用的是长度为15个氨基酸的柔性Linker，其氨基酸序列为（GGGGS) 3，并 将其对应的核苷酸序列设计为ggt gga ggc RRa tcc ggc gga ggt ggc tct ggc ggt ggc gga tcg，所述划线序列为BamH I酶切位点，通过多步PCR反应、BamH I单酶切反应以及 连接反应，构建融合基因4CL: :RS，随后，通过Nco I与EcoR I酶切位点构建原核表达载 体 pET-30a/4CL : :RS，在 28°C诱导表达 8h，分别通过 Proteinlso? Ni-NTA Resin 纯化及 Western blot分析验证所构建的原核表达载体pET-30a/4CL : :RS能够表达目的融合基因 4CL : :RS，即所得到的重组菌株BL21 (DE3)携带重组质粒pET-30a/4CL : :RS ; 所采用的引物分成两条设计，4CL : :RS-FJP 4CL : :RS-R i为第一个基因4CL的上、下 游引物，4CL: =RS-F1*引入了 Nco I酶切位点CCA TGG，4CL: =RS-R1在引入BamH I酶切 位点的同时又将4CL基因的终止密码子TAG敲除；4CL : :RS-F21、4CL : :RS-F22、4CL : :RS-R2 为第二个基因（RS)的上、下游引物引物，4CL: :RS-F22在引入BamH I酶切位点的同时又将 RS基因的起始密码子ATG敲除，在下游引物4CL: =RS-R2*引入酶切位点EcoR I。5. 利用权利要求4所述的重组菌株发酵制备白藜芦醇的方法，其特征在于，包括以下 步骤： (一） 重组菌株的活化 (1) 将-80°C保存的重组菌株的甘油菌放置在38°C~40°C水浴中，不断摇动直至全部 融化成液状； (2) 无菌条件下，用接种环将少量融化的菌种划线在含有硫酸卡钠霉素的平板上； (3) 将划线后的平板密封后，37°C条件下静置15min，最后将其在37°C的恒温培养箱中 倒置培养12h后观察菌落； (4) 无菌条件下，挑取平板上的单菌落至ImL的LB体培养基，在37°C，200rpm条件下过 夜培养； (二） 发酵转化及其产物的提取 (1) 无菌条件下，将500 y L活化后的重组菌液按1 : 50的接种比例接种至50mL新鲜 且预热的LB培养基； (2) 37°C，200rpm的恒温培养箱中培养2h，培养基中发酵菌液的0D_值为0. 2 ; (3) 在200 y L DMSO中溶解0. 00821g的对香豆酸，摇匀充分溶解； (4) 在无菌条件下，将上述配置的对香豆酸溶液全部加入到发酵菌液中，此时对香豆酸 的终浓度为ImM ; (5) 28 °C，200rpm的恒温培养箱中发酵培养48h ; (6) 充分摇勾发酵液，无菌条件下取ImL发酵液放置于I. 5mL的离心管中，13000rpm离 心 3min ; (7) 将上清液转至新的离心管中并添加50 y L的0. lmol/1的HC1，-20°C冷冻过夜； (8) 室温条件下，将冷冻离心管缓慢解冻并加入ImL的乙酸乙酯萃取，重复3次； (9) 萃取结束后，将乙酸乙酯相合并并用氮吹仪将其吹干； (10) 最后将所得残留成分溶解于ImL的色谱甲醇中，进样前置于-20°C保存； (三）产物检测 将步骤（二）得到的产物经过高效液相色谱检测及紫外吸收检测，与白藜芦醇标品的 色谱图和紫外吸收图进行比较，洗脱时间为13min左右时有一个明显的色谱峰，该色谱峰 的洗脱时间和对应的紫外吸收波长通过与白藜芦醇的标准品相对比，证实了发酵产物中含 有白藜芦醇。
【专利摘要】本发明公开了用于生物合成白藜芦醇的融合基因、表达载体及制备方法，采取合适的引物对4CL和RS基因进行连接，能够使得4CL和RS酶蛋白各自保留活性，同时又能提高总酶促反应效率。并且还对生物合成白藜芦醇的发酵工艺条件如培养及种类、添加底物浓度、发酵温度、发酵时间以及诱导剂浓度等方面进行进一步优化，使得目标产物白藜芦醇的产量和摩尔转化率都较高。
【IPC分类】C12P7/22, C12N15/62, C07K19/00, C12R1/19, C12N15/70
【公开号】CN105039370
【申请号】CN201510396741
【发明人】郭雪峰, 张二浩, 王进, 孙嘏, 姚曦, 荀航
【申请人】国际竹藤中心
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年7月9日