一种红曲色素的发酵制备方法与流程

本发明属于生物发酵制备领域，具体涉及一种高色价兼具高生物安全的红曲色素发酵制备方法。

背景技术：

红曲色素是由红曲霉属的丝状真菌经发酵产生的次级代谢产物，其因性质稳定、着色性好、无毒等优点常被选作高质的天然食用色素。但传统红曲色素的生产时间长，效率较低，且生产过程中常伴随着桔霉素的生成。而桔霉素具有强烈的肾毒性，国家标准（GB/T 5009.222-2008）中对红曲液态、固态样品中桔霉素含量的限定分别为：液态＜50μg/L；固态＜1mg/kg。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对传统技术的不足，提供一种高色价兼具高生物安全的红曲色素发酵制备方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种红曲色素的发酵制备方法，包括以下步骤：

1）红曲霉种子液的制备：将两块直径为6 mm的红曲霉菌饼接种于50mL PD液体培养基中，于30-32℃、120-150r/min条件下恒温振荡培养2-3d，得红曲霉种子液；

2）红曲色素的发酵：按液态发酵培养基体积的10%接入步骤1）所得红曲霉种子液，32℃、180r/min条件下培养12d；

3）发酵液中桔霉素的去除：培养结束后，将所得发酵液与体积浓度为70-75%的乙醇溶液按体积比1:7-1:10混合摇匀，室温下避光静置20-40min，取出后4000 r/min离心5-10 min，所得上清液于旋转蒸发器中55℃-60℃条件下蒸干，再加入少量体积浓度为70-75%的乙醇溶液溶解，得浓缩液；取所得浓缩液采用硅胶柱层析进行分离，并根据硅胶柱上不同颜色的区间带分别进行收集，将红色区间带收集得到的洗脱液于旋转蒸发器中55℃-60℃蒸干，即得去除桔霉素的红曲色素。

所用红曲霉菌为紫色红曲霉183-3。

所述PD液体培养基的制备方法为：将200g马铃薯去皮、切块，于1000 mL水中煮沸半小时，然后用纱布过滤，滤液中添加20g葡萄糖，待其充分溶解后加水补足至1000 mL，再于121℃灭菌30 min，即得。

所述液态发酵培养基中含12wt%可溶性淀粉、1wt%蛋白胨、0.02wt% ZnSO₄、0.02wt% MnSO₄、0.005% FeSO₄，其初始pH值为4.5-5.0。

所述硅胶柱层析分离采用湿法上柱；所用柱子的径高比为1:10-1:15；所用硅胶为80-120目，其重量为上样浓缩液体积的20-25倍；所用洗脱剂为乙酸乙酯，其流速为1-2滴/s。

本发明的显著优点在于：

（1）本发明在液态发酵培养基中以可溶性淀粉作为碳源，并添加硫酸盐发酵红曲霉，可大大提高红曲色素的产量，其产量可达350.8U/mL，与现有发酵工艺相比（红色价为138.3U/mL）相比，红曲色素产量提高了1.54倍。

（2）本发明在液态发酵的基础上结合硅胶柱层析法进行制备，可有效去除桔霉素，经HPLC检测，所得红曲色素中桔霉素含量为17.2μg/L，达国标要求。

（3）本发明在大幅度提高红曲色素产量的同时可有效去除桔霉素，其方法操作简单，实用性强，为红曲色素在食品方面得到更广泛的应用打下了基础。

附图说明

图1为发酵后所得发酵液的高效液相色谱图。

图2为柱层析分离后所得样品溶液的高效液相色谱图。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

所用紫色红曲霉183-3为申请人自行选育获得，其选育方法参见“高产红色素及糖化酶红曲菌株的诱变选育”（徐美爱 等，《中国食品学报》，2015，15(2)：74-82）。

实施例1 液态发酵

（1）取紫色红曲霉183-3菌株斜面，用灼烧灭菌后的接种环挑取孢子于PDA平板上划线，30℃培养3-4d，挑取生长快、菌落大的进行传代培养，获得生长力旺盛的红曲霉菌株；

（2）用打孔器在红曲霉平板上打出2个菌饼（6mm），接种到PD液体培养基中（培养基分装于250mL锥形瓶中，装液量为50mL/瓶），置于往复式摇床中，于32℃、120r/min条件下恒温振荡培养3d，得红曲霉种子液；

（3）将液态发酵培养基分装于250mL锥形瓶中，装液量为50mL/瓶，然后接入5mL红曲霉种子液，于32℃、180r/min条件下培养12d，得发酵液。

所用PD液体培养基的制备方法为：将200g马铃薯去皮、切块，于1000 mL水中煮沸半小时，然后用纱布过滤，滤液中添加20g葡萄糖，待其充分溶解后加水补足至1000 mL，再于121℃灭菌30 min，即得。

所用液态发酵培养基中含12wt%可溶性淀粉、1wt%蛋白胨、0.02wt% ZnSO₄、0.02wt% MnSO₄、0.005% FeSO₄，其初始pH值为5.0。

实施例2 桔霉素的去除

（1）取发酵液10mL，加入90mL体积浓度为75%的乙醇溶液，震荡混匀，室温下避光放置20min，取出后4000r/min离心8min，所得上清液于旋转蒸发器中55℃蒸干，再加入5mL体积浓度为75%乙醇溶液溶解，得浓缩液；

（2）将10g、80-120目的柱层析用硅胶用乙酸乙酯浸泡后湿法装柱，柱子的直径为10mm，装柱高度为10cm；取0.5mL浓缩液上样，以乙酸乙酯为洗脱剂进行洗脱，洗脱剂流速控制在1-2滴/秒，根据硅胶柱上不同颜色的区间带分别进行收集；

（3）将红色区间带收集得到的洗脱液于旋转蒸发器中55℃蒸干，加入3mL体积浓度为75%的乙醇溶液溶解，得样品溶液。

实施例3 HPLC检测方法

采用配有荧光检测器的高效液相色谱系统

色谱柱：HITACHI LaChromUltra C18 (150mm×4.6mm，粒度5µm)；

流动相：乙腈：超纯水（用磷酸调pH至2.5）=35：65；

检测器：荧光检测器，激发波长331nm，发射波长500nm；

进样量：20µL；

流速：1 mL/min；

柱温：28℃。

实验结果：图1、2分别为所检测发酵液与样品溶液的高效液相色谱图。从图中可以看出，发酵液中桔霉素（t=12.989）含量较高，而经硅胶柱层析后的样品溶液中几乎不含有桔霉素。

经计算，发酵液中桔霉素含量为39.09mg/L，而经硅胶柱层析分离后样品溶液中桔霉素含量为17.2μg/L，符合国家标准要求（液态＜50μg/L），且红曲色素收率为66.98%。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。