一种红曲属新菌株及其发酵制备的中药红曲的制作方法

专利名称：一种红曲属新菌株及其发酵制备的中药红曲的制作方法
技术领域：
本发明涉及红曲属新菌株及其发酵制备的中药降脂红曲，具体地说涉及一种经筛选驯化的红曲菌株发酵的中药降脂红曲，属于生物技术领域。
背景技术：
随着人们生活水平的提高和人口老龄化，高脂血症(主要表现为血清胆固醇TC、甘油三酯TG升高，高密度脂蛋白胆固醇HDL-C降低、低密度脂蛋白(LDL)升高的一种全身脂代谢异常)的发病率逐年上升，因脂质代谢紊乱引起的高脂血症，已成为脂肪肝、冠心病和动脉粥样硬化等常见病的重要发病因素。
目前临床上常用降血脂的药物主要分为以下几类3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A，HMG-CoA)还原酶抑制剂(他汀类、statin)、胆汁酸螯合剂(bile acid sequestrants)、烟酸(nicotinic acid，niacin)及其衍生物、苯氧芳酸类或称贝特类(fibrates)、鱼油制剂(多不饱和脂肪酸)等。理想的降脂药是两种作用机理不同的药物联合用药。目前他汀类药物已成为治疗高胆固醇血症最常用的处方药物。现已上市他汀类药物有洛伐他汀(lovastatin)、辛伐他汀(simvastatin)、普伐他汀(pravastatin)，阿托伐他汀(atovastatin)等。目前，为了使降脂作用更全面，往往需要服用两种不同作用机理的降脂药物。如他汀类药物降低甘油三酯、升高高密度脂蛋白胆固醇的药物疗效不够理想，需联合贝特类治疗，增加了治疗成本和副作用(横纹肌溶解)。
红曲是我国传统的中药材之一，是以红曲霉与粳米为原料经发酵制成，具有健脾和胃消食，活血化瘀止痛之效，在我国有悠久的药用和食用的历史。1979年，Endo等发现某种特殊红曲霉的红曲中含有莫纳可林(Monacolin)系列物质，有抑制人体胆固醇生物合成过程中羟甲戊二酰辅酶A还原酶(HMG-CoA还原酶)的作用，这种红曲被称为降脂红曲，也称为功能性红曲。其中Monacolin K(洛伐他汀，lovastatin)抑制胆固醇合成作用效果最强，目前发现约有十余种Monacolin K结构类似物，他汀类物质开环结构是Monacolin类调脂药物的活性形式。Monacolin K开环结构只存在于少数发酵的红曲米中，它能与HMG-CoA还原酶直接结合而抑制胆固醇在体内的合成，而不需要体内羟基酸脂酶参与水解，不增加肝脏负担，即能发生降脂作用，是红曲主要的有效成分之一。人体产生羟基酸脂酶的能力存在较大的个体差异，有的人甚至完全没有，因此闭环的降脂作用在不同病人身上差异悬殊。
日本学者研究表明，红曲霉培养物主要含有的脂肪酸是软脂酸、油酸、亚油酸。宋洪涛采用气相色谱分析，结果表明不饱和脂肪酸含量达64％-77％，多烯不饱和脂肪酸含量达16％-27％。多不饱和脂肪酸是一类含有两个或两个以上双键，碳原子数为16-22的直链脂肪酸，人体三种必须脂肪酸为亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸。近几年的研究显示多不饱和脂肪酸具有降血脂、降低胆固醇、抑制脂肪的合成、预防类风湿关节炎、预防肿瘤和糖尿病、及机体免疫等许多方面有广泛的作用，日常食品中三种人体必须脂肪酸的含量很低，不足以满足人体所需。亚油酸在人体内在6-脱氢酶的作用下转化为亚麻酸。Juzlova等在研究红曲霉的代谢产物时发现红曲霉能产生脂肪酸，其中有二十二种饱和脂肪酸，十四种单烯酸，两种二烯酸和亚油酸，其中亚油酸占整个脂肪酸的80％。
Kuroda等通过体外四十多种脂肪酸对胆固醇合成的影响实验发现很多脂肪酸都能抑制胆固醇的合成，具有双键的不饱和脂肪酸比饱和脂肪酸对胆固醇合成的抑制活性强，双键越多，活性越强。油酸、亚油酸和花生油烯酸等不饱和脂肪酸可促进胆固醇在血液中的运行，以减少沉积在血管壁上的可能性，达到防治动脉硬化的目的。目前已有很多有效成分为多不饱和脂肪酸的中药作为降胆固醇药物而应用于临床，如红花油、γ-月见草籽油、沙棘油等。
1995年，法国学者Blanc等人发现了红曲液态发酵、固态发酵中的桔霉素(Citrinin)。桔霉素属于真菌毒素，具有肾毒性、毒性居中等偏剧毒性，同时还具有致畸性。据国内外的报道，紫色红曲霉和红色红曲霉菌种被认为是产生桔霉素的菌种。
专利CN1059463公开了新菌株紫红曲菌、红曲菌及其制备方法，含洛伐他汀8mg/g；CN1061537C公开了新菌株紫红曲菌、红曲菌制的红曲药物制剂，该制剂即降低血脂，又降低胆固醇，副作用低，含有开环的洛伐他汀；CN1065432C公开了十九个红曲菌菌种，以及其发酵制备的降脂红曲；CN1373208公开了高产洛伐他汀菌株，红曲粉中，含洛伐他汀15-20mg/g；CN1448503公开了一种无桔霉素高色价功能红曲粉的制备，含洛伐他汀4-12mg/g，开环洛伐他汀70-90％；CN1448503筛选出了不产桔霉素或桔霉素产量极其微量的菌株，红曲粉中洛伐他汀3-16mg/g，紫红曲菌红曲粉中洛伐他汀9-12.5mg/g；CN1580272公开了高产洛伐他汀的降脂红曲粉中洛伐他汀12mg/g；CN1513451公开以洛伐他汀盐为主要成分的中药红曲及其制剂。
综上所述，还没有同时具备洛伐他汀含量高、开环比例高、多不饱和脂肪酸含量高，几乎不含桔霉素的红曲霉发酵生产中药降脂红曲报道。

发明内容
本发明的技术方案是提供一种红曲属菌株发酵的中药降脂红曲，本发明所要解决的技术方案是提供一种经筛选驯化紫色红曲霉菌株，本发明还提供了该中药降脂红曲的制备方法和用途。
本发明提供的红曲霉新菌株为紫色红曲霉(Monascus Purpureus Went)，其发酵产物中的不饱和脂肪酸为3-6mg/g，桔霉素含量小于等于100ppb，洛伐他汀15-30mg/g，其中开环结构的洛伐他汀占总洛伐他汀的百分比为10-90％。
本发明提供的的红曲属紫色红曲霉新菌株，是由中国典型培养物保藏中心CCTCC保藏的保藏号为CCTCC M 205073的菌株。紫色红曲霉属于真菌界(Fungi)、子囊菌门(Ascomycetes)、不整囊菌纲(Plectomycetes)、散囊菌目(Eurotiales)、红曲科(Monascaceae)、红曲属(Monascus)。
本发明的红曲霉菌株是从土壤分离得到，以四川大学生物工程系微生物分类室保藏的紫色红曲菌株(Monascus Purpureus Went)为参考菌株，鉴定结果如下形态特征(一)、将鉴定菌株和参考菌株(即标准菌株)，分别点接于麦芽汁琼脂平板上(各接5皿)，于25℃-28℃培养12天进行比较观察，其结果如下(1)菌落ф2.8-3.2cm，中部紫红争，边绿桔黄色，有绒毛状气生菌丝，有的皮膜状，出现皱褶、背面呈褐红色。
(2)菌丝有隔、多核、菌丝与分生孢子梗或囊梗连按处有明显的足细胞(3)闭囊壳球形、具柄、柄长短不一闭闭囊壳球ф8-15cm，幼时红色，成熟后呈桔黄色。
(4)子囊球形，内含8个子囊孢子，子囊在闭囊成熟时消失，不易观察。
(5)子囊孢子椭圆形，校分生孢子小，色浅，单单层壁。
(6)分生孢子梨形。具双层壁，较子囊孢子大，单生或2-3个成串。
(7)生长温度范围15℃-42℃，14℃以下和43℃以上不生长，最适温25℃-32℃。
本发明菌株在形态、颜色、质地、菌丝结构、闭囊壳的形状、大小、着生方式，子囊和子囊孢子的形状大小、数目、纹饰以及分生孢子的大小、形态、纹饰和着生方式都与参考菌株相似。
生理生化特征(对基质的利用)与标准菌株相符，鉴定菌株在麦芽汁、番茄汁、黄豆培养基上生长良好；在玉米粉、PDA、麦皮培养基上生长一般；在高氏培养基上能生长，有局限；在蔡氏培养基上不生长。
根据实验结果分析认为被鉴定菌株应为紫色红曲霉(Monascus Purpureus Went)，与参考菌株比较，无明显变异状态。
使用本发明菌株发酵制备中药红曲时，发酵产物中含有不饱和脂肪酸3-6mg/g，还含有洛伐他汀20-40mg/g，其中开环结构的洛伐他汀占总洛伐他汀的百分比为10-90％，并且桔霉素小于等于100ppb，与现有报道的中药红曲的发酵菌株均不相同，因此是一株新的红曲霉菌株。
本发明还提供了一种中药红曲，其特征是含有不饱和脂肪酸3-6mg/g，洛伐他汀15-30mg/g，其中开环结构的洛伐他汀占总洛伐他汀的百分比为10-90％。
所述中药红曲含有如下主要有效成分洛伐他汀15-30mg/g，不饱和脂肪酸3-6mg/g，其中开环结构的洛伐他汀占总洛伐他汀的百分比为10-90％。
进一步地，不饱和脂肪酸中多不饱和脂肪酸2-5mg/g。所述不饱和脂肪酸主要为油酸和亚油酸。中药红曲含桔霉素小于等于100ppb。
所述的中药红曲由红曲霉发酵制备。制备方法包括如下步骤a、种子液制备紫色红曲霉(Monascus Purpureus Went)，由中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏的保藏编号为CCTCC M 205073的菌株，作为生产用种子，于30～40℃，180～220rpm，PDA培养基中培养8～24h作为一级种子或发酵罐种子液；b、发酵采用液态发酵或固态发酵，干燥，得本发明红曲粉。
其中，步骤b所述的液态发酵的培养基配方为(g/L)碳源(蔗糖)10～40，氮源(蛋白胨)10～45，牛肉膏0.5～3，CaCl20.05～1，pH6.5±1.0，121℃灭菌20min，其中，碳源可以用葡萄糖、甘油、可溶性淀粉、糖蜜等代替，氮源可以用玉米浆、酵母膏、牛肉膏、植物或动物蛋白胨；发酵方法为将制备好的种子液按照5％～20％的接种量接入发酵培养基中。发酵培养基于30～40℃，180～220rpm培养5d～7d，在离培养结束24h，加入开环稳定液，离心除去上清，菌丝体破碎，填加辅料，干燥得到本发明红曲粉。
所述的固态发酵的营养液的组分为(g/L)甘油50～300，蛋白胨50～300，牛肉膏50～100，Na2HPO4·12H2O 5～20，NaH2PO4·2H2O 5～20，CaCl20.5～10，MgSO4·7H2O 0.5～10，Na2CO30.5～10。
固态发酵方法是将梗米灭菌后喷洒营养液，重量配比为每1000g米喷洒营养液20～120ml，于100℃蒸煮得到培养基，冷却后将制备好的种子液按照5％～20％的接种量接入混有营养液的培养基中；培养基于30～45℃，湿度≥80％，分别在培养后8d和12d按5％(液固比)加入固态发酵的营养液，于发酵后14天结束，干燥得到本发明的红曲。
本发明还提供了一种药物组合物，它是所述的红曲为活性成分，将红曲粉碎至80-200目，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的药剂。
所述的药剂是片剂、胶囊剂、分散剂、微粉化制剂、微丸。
本发明还提供了上述药物组合物在制备治疗和预防高脂血症及其相关疾病的药物中的用途和在制备治疗脂肪肝的药物中的用途。
综上所述，本发明提供红曲霉菌发酵的中药降脂红曲粉同时具有洛伐他汀含量高、开环比例高、多不饱和脂肪酸含量高，不含桔霉素。该中药降脂红曲与单纯的洛伐他汀相比，多种活性成分具有协同作用，克服了现有药物需联合用药、药价高、副作用大的缺点。本发明还通过对紫色红曲霉菌株的筛选驯化，筛选驯化出了具有稳定的高洛伐他汀产率、高产多不饱和脂肪酸、不产和极低产桔霉素的菌株。以及周期短，效率高，成本低的生产发酵方法。本发明不使用溶剂提取、而采用直接干燥的的后处理技术，保证后处理中洛伐他汀损失小、并使产品中开环、闭环比例稳定。
总之，本发明的紫色红曲霉发酵的中药降脂红曲与同剂量的洛伐他汀相比具有疗效好、安全性更高、价格低廉等优势。
具体实施例方式
实施例1 本发明中药降脂红曲的制备(编号A)本发明使用的菌种是从土壤分离得到，由四川大学生物工程研究所鉴定为鉴定为紫色红曲霉(Monascus Purpureus Went)菌，中国典型培养物保藏中心(CCTCC)予以保藏，保藏编号为CCTCC M 205073。
工作种子批菌种启开后，PDA琼脂培养基平板培养，保存于PDA试管斜面，经过形态、纯度、生产能力检查合格后，[即在培养好的PDA试管斜面上勾取少量培养物涂片，革兰氏染色后显微镜下观察，凡镜下形态一致，无杂菌污染的种子为合格种子。生产能力检查是通过实验室水平的发酵来检测菌株的生产能力(即每毫升发酵液的开环含量)，凡生产能力大于1ug/ml即为合格种子]。作为生产用种子，种子于30～40℃，180～220rpm，PDA培养基中培养24h作为一级种子，也可作为发酵罐种子液。
固态发酵营养液组分(g/L)甘油50，蛋白胨50，牛肉膏50，Na2HPO4·12H2O 5，NaH2PO4·2H2O 5，CaCl20.5，MgSO4·7H2O 0.5，Na2CO30.5。
梗米灭菌后喷洒营养液(重量配比为每1000g米喷洒营养液120ml)，于100℃蒸煮得到培养基，冷却后将制备好的种子液按照20％的接种量接入混有营养液的培养基中。培养基于30～45℃，湿度≥80％；发酵5天后每天翻动2次，以保持发酵均匀；分别在培养后8d和12d按5％(液固比)加入固态发酵的营养液，于发酵后14天结束，置70℃温度干燥5小时，既得到本发明的开环结构含量高的天然降脂红曲粉。
实施例2 本发明中药降脂红曲的制备本发明使用的菌种是从土壤分离得到，由四川大学生物工程研究所鉴定为鉴定为紫色红曲霉(Monascus Purpureus Went)菌，中国典型培养物保藏中心(CCTCC)予以保藏，保藏编号为CCTCC M 205073。
工作种子批菌种启开后，PDA琼脂培养基平板培养，保存于PDA试管斜面，经过形态、纯度、生产能力检查合格后，[即在培养好的PDA试管斜面上勾取少量培养物涂片，革兰氏染色后显微镜下观察，凡镜下形态一致，无杂菌污染的种子为合格种子。生产能力检查是通过实验室水平的发酵来检测菌株的生产能力(即每毫升发酵液的开环含量)，凡生产能力大于1ug/ml即为合格种子]。作为生产用种子，种子于30～40℃，180～220rpm，PDA培养基中培养24h作为一级种子，也可作为发酵罐种子液。
固态发酵营养液组分(g/L)甘油300，蛋白胨300，牛肉膏100，Na2HPO4·12H2O20，NaH2PO4·2H2O 20，CaCl210，MgSO4·7H2O 10，Na2CO310。
梗米灭菌后喷洒营养液(重量配比为每1000g米喷洒营养液20ml)，于100℃蒸煮得到培养基，冷却后将制备好的种子液按照5％的接种量接入混有营养液的培养基中。培养基于30～45℃，湿度≥80％；发酵5天后每天翻动2次，以保持发酵均匀；分别在培养后8d和12d按5％(液固比)加入固态发酵的营养液，于发酵后14天结束，置70℃温度干燥5小时，既得到本发明的开环结构含量高的天然降脂红曲粉。
实施例3 本发明中药降脂红曲的制备工作种子批菌种启开后，PDA琼脂培养基平板培养，保存于PDA试管斜面，经过形态、纯度、生产能力检查合格后，[即在培养好的PDA试管斜面上勾取少量培养物涂片，革兰氏染色后显微镜下观察，凡镜下形态一致，无杂菌污染的种子为合格种子。生产能力检查是通过实验室水平的发酵来检测菌株的生产能力(即每毫升发酵液的开环含量)，凡生产能力大于1ug/ml即为合格种子]。作为生产用种子，种子于30～40℃，180～220rpm，PDA培养基中培养8～24h作为一级种子，也可作为发酵罐种子液。
固态发酵营养液组分(g/L)甘油150，蛋白胨150，牛肉膏80，Na2HPO4·12H2O12，NaH2PO4·2H2O 15，CaCl27，MgSO4·7H2O 6，Na2CO38。
梗米灭菌后喷洒营养液(重量配比为每1000g米喷洒营养液100ml)，于100℃蒸煮得到培养基，冷却后将制备好的种子液按照10％的接种量接入混有营养液的培养基中。培养基于30～45℃，湿度≥80％；发酵5天后每天翻动2次，以保持发酵均匀；分别在培养后8d和12d按5％(液固比)加入固态发酵的营养液，于发酵后14天结束，置70℃温度干燥5小时，既得到本发明的开环结构含量高的天然降脂红曲粉。
实施例4 本发明中药降脂红曲的制备(编号B)(1)生产用菌种扩增培养①种子培养基的制备马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，加水100ml，煮沸30分钟，分装，置1.0Kg/cm2灭菌20分钟，即得。
②扩种在无菌条件下，将生产用菌种Monascus parpureus Went中国典型培养物保藏中心(CCTCC)予以保藏，保藏编号为CCTCC M 205073，接种在马铃薯葡糖糖琼脂的培养基础上，相对湿度控制在40-60％，于32-34℃扩增培养5-7天，得到生产种子。
(2)发酵、干燥①营养液的制备蛋白胨50g，酵母膏20g，磷酸二氢钾2g，加水至1000ml，即得。
②发酵选用大米应为新鲜、无霉变的四川大米，发酵前先进行净洗、淘洗，按每1Kg大米加入1000ml营养液，混匀，置于121℃(1.0Kg/cm2/)蒸气灭菌25分钟，备用。发酵接种应先将生产种子溶于无菌水中，再接种在已灭菌的大米中，混匀。发酵温度控制在32-34℃，室内相对湿度控制在40-60％，发酵时间15天，发酵5天后每天翻动2次，以保持发酵均匀。
③干燥将发酵红曲置浅盘(厚度5cm以下)，置80℃温度干燥4小时，既得到本发明的开环结构含量10-30％的天然降脂红曲粉。
实施例5 本发明中药降脂红曲中洛伐他汀成分的含量测定称取上述中药降脂红曲100g，500ml甲醇萃取三次，减压浓缩后，萃取物上C18反相硅胶柱层析，甲醇∶水梯度洗脱得2个组分，浓缩、静置、结晶。称重I为0.42g，II为0.38g。
HPLC紫外检测238nm，紫外光谱溶剂为甲醇红外光谱KBr压片，1H-NMRTMS为内标，CDCl3为溶剂，质谱电离源70eV，加速电压6000V。
波谱分析得到的结果和文献所报道的Monacolin K的开、闭环结构化合物的波谱数据进行对照，确定I为Monacolin K的开环结构，II为Monacolin K的闭环结构。
上述中药降脂红曲样品，研钵研磨，过80目筛。精密称取2g(精确到0.001g)，用甲醇定容至10ml容量瓶中，超声振荡提取20min，6000rpm离心10min，吸取上清进样。
采用反相HPLC色谱法进行，色谱条件为色谱柱为Shim-pack VP-ODS C(4.6×150mm×5um)，流动相为甲醇∶18mM磷酸溶液77∶23(v/v)，流速0.6ml/min，检测波长238nm，柱温30℃，进样体积为20μl。
对照品溶液的制备精密称取洛伐他汀开、闭环结构的对照品适量，加75％乙醇制成每1ml中含0.1mg的溶液，即得。
分别精密吸取上述对照品与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪测定，根据色谱图峰面积计算中药降脂红曲中洛伐他汀开、闭环结构含量。
洛伐他汀开环结构式

洛伐他汀开结构化学学名为1，2，6，7，8，8α-6氢δ-，β-双羟基-2，双甲基-8-[2-甲基]-苯-丁酰氧基]-1-萘-3，5-乙羟基-庚酸。
检测实施例1、实施例4各5批次发酵中药降脂红曲中洛伐他汀含量，开、闭环结构含量。结果见表1。
表1中药降脂红曲中洛伐他汀含量

实施例6本发明中药降脂红曲中脂肪酸成分的研究1、中药降脂红曲中脂肪酸的提取将索氏提取器的接受瓶洗净，于105℃下烘2小时，取出置干燥器中冷却至室温，称重，于滤纸筒内精密称取中药降脂红曲中粉末2-5g，滤纸筒口、筒底用脱脂棉包裹；将滤纸筒放入提取管内，向已称重的接受瓶内倒入1/3-1/2的乙醚，连接索氏提取器各部分，于水浴上加热，水浴温度为70-80℃，控制乙醚从冷凝器滴入滤纸筒的速度的150滴/分钟为宜，使乙醚不断回流提取；提取5小时，至从抽提器流出的溶剂蒸发后无油滴为止，抽提完毕后停止加热，冷却，将接受瓶倾斜，乙醚流至接受瓶中，最后将接受瓶与普通冷凝管相连，蒸去乙醚；将接受瓶于烘箱中干燥，再置于80℃干燥器中冷却至室温，称至恒重。
2、采用硫酸-甲醇法将脂肪酸衍生为相应的脂肪酸甲酯将各脂肪酸标样称取适量，混合，置于磨口瓶中，加入10倍量的硫酸-甲醇溶液[取1ml浓硫酸(比重为1.84)滴加到98ml无水甲醇中]，振摇均匀，装上带有氯化钙干燥管的冷凝器，60-80℃加热回流2h，蒸去甲醇，加蒸馏水适量，振摇后倒入分液漏斗中，加入石油醚振摇，分出醚液，用蒸馏水反复洗涤醚液，至洗液呈中性，用无水硫酸钠干燥过夜，过滤，蒸去石油醚，再用少量石油醚定容，得脂肪酸甲酯混合标准溶液。
3、用气相色谱-质谱仪检测脂肪酸色谱条件仪器HP6890/5973GC/MS色谱-质谱联用系统。
色谱柱HP-530m×0.3mm×0.25um柱温 载气He，0.9ml/min；进样口温度260℃；分流比20∶1；进样量1μl；质谱条件离子源温度280℃；电离方式电子轰击(EI)；电子能量70ev；四极杆温度280℃；质量范围30-400u测定气质联机测定样品经气相色谱得各组分的质谱图，经计算机检索得各组分结果。
4.气相色谱检测色谱条件气相色谱柱为PE-225毛细管交联石英柱(30m×0.25m i.d)，液膜厚度为0.25μm，用N2作载气，carrier/5.0psi，oven208℃，进样口温度250℃，FID温度300℃，分流比20∶1，H245ml/min，空气450ml/min。
测定分别吸取对照品溶液和供试品溶液1μl，注入气相色谱仪，按上述气相条件测定，以外标法定量。
检测实施例1、实施例4各5批次发酵中药降脂红曲，其脂肪酸的含量为4.36±1.01mg/g，其不饱和脂肪酸占87.79％，饱和脂肪酸占12.21％，饱和脂肪酸/不饱和脂肪酸＝0.139。具体组成见下表2。
表2中药降脂红曲中的脂肪酸组成表

脂肪酸分析实验结果表明，中药降脂红曲样品中共有21个脂肪酸甲酯色谱峰，其十六烷酸(棕榈酸)、十八烷酸(硬脂酸)、9-十八碳烯酸(油酸)、9，12-十八碳二烯酸(亚油酸)、十八碳三烯酸(亚麻酸)、二十四碳烷酸(掬焦油酸)的峰面积较大，这些脂肪酸占总脂肪酸含量的97％以上。多不饱和脂肪酸含量占40％。
实施例7本发明中药降脂红曲中桔霉素的测定1、红曲发酵样品中桔霉素提取方式为准确称取红曲0.2g，用pH为2的盐酸水溶液0.5ml酸化10min，再加入甲苯、乙酸乙酯混和提取剂2ml，采用超声振荡进行提取，时间15min，离心(6000rpm，10min)，吸取溶剂层置另一离心管中，45℃水浴上通空气挥干，残渣用甲醇100μl溶解，离心(6000rpm，10min)，取上清备用。
2、桔霉素HPLC检测条件为色谱柱Irrogulour-H C18柱(250×4.6mm，10μm)；预柱Phenomenex C18；流动相乙腈-水(15∶85)(磷酸调pH至2.8)；检测波长紫外检测器，λ＝254nm；荧光检测器λex＝331nm，λem＝500nm；流速1ml/min；柱温25℃标准贮备液的配制精密称取桔霉素对照品14.64mg，甲醇溶解并定容10.0ml，浓度为1.464mg/ml，作为对照品贮备液。
对照品溶液的配制精密吸取贮备液一定量，用甲醇稀释定容，按试验需求配制成不同浓度的标准溶液。
高效液相色谱法参照中国药典2000版二部(附录VI D)高效液相色谱法测定。
标准曲线精密吸取桔霉素贮备液一定量，用流动相配置成浓度为7.32μg/ml，21.96μg/ml，65.88μg/ml，144.94μg/ml，219.6μg/ml的标准溶液；均以10μl进样，以峰面积对标准品浓度进行线性回归，回归方程为Y＝1078+4098X，r＝0.99989。即进样量在7.00-220ng范围内线性关系良好。
红曲样品中桔霉素的测定采用已建立的桔霉素检测方法对实施例1、实施例3各5批样品进行了检测，结果如下(表3)表3中药降脂红曲中不饱和脂肪酸、桔霉素的含量

“-”未检出从桔青霉(Penicillium citrinium)的蔡氏培养液中分离的桔霉素为柠檬-黄色针状棱形结晶，酸性。熔点172.12℃，分解点为172.49℃；比旋度[α]235461-41.7，-43.7；桔霉素难溶于水，溶于氯仿、丙酮、乙酸乙酯、乙醇，微溶于乙醚，桔霉素的钠盐易溶于水；元素分析C 62.31％；H 5.56％；O 32.17％；分子式C13H14O5；相对分子质量为251；其分子结构式如下

(3R，4S)-4，6-二氢-8-羟基-3，4，5-三甲基6-氧-3H-2-苯吡-7-羧酸桔霉素的结构图本发明降脂红曲制剂的生产菌株经过驯化具有不产和极低产桔霉素的能力，检测10批中药降脂红曲中的桔霉素含量远低于日本的规定；同时我们也检测了从环境中分离的20株红曲霉，其含量较高，达到100-500μg/g，同样的培养条件，不同菌株产桔霉素能力有如此的差别，主要是菌株本身性质所决定的。发酵过程中对氧气的需求量极大，因此需要充分供养(提高通气量、加快搅拌速度)。其中通氧量、温度及培养基组分是关键，过低和过高都会严重影响他汀及脂肪酸产量。
实施例8本发明降脂红曲片剂的制备方法取药材红曲273.0g，干燥，粉碎，过60-100目筛，加入微晶纤微素37.45g微粉硅胶10.50g、硬脂酸17.5g、乳糖10.50g，搅拌混合均匀挤压过14目筛，制粒，置60℃干燥，凉冷，颗粒过16目筛整粒，合格颗粒加入硬脂酸镁1.05g，混匀，压制成1000片，制片，即得。
实施例9本发明降脂红曲胶囊的制备方法红曲273g微粉硅胶7g制成1000粒取药材红曲，干燥，粉碎，过60-200目筛，加入微粉，将药物与粉末混合均匀，装入空心胶囊制成1000粒，即得。
实施例10本发明降脂红曲软胶囊的制备方法红曲 273g大豆油320g蜂蜡 7g制成 1000粒取红曲，干燥，粉碎过80目筛，加入大豆油及蜂蜡，混匀，制成软胶囊，共制成1000粒，即得。
实施例11本发明降脂红曲微丸的制备方法取中药降脂红曲546g，干燥，粉碎，过60-100目筛，加入辅料254g淀粉粉末混匀，加入70％的乙醇为润湿剂，制成软材，软材用微丸机制丸，湿料挤压过0.8mm筛孔，条状湿粒切断滚圆，干燥成型，过16～20目筛选丸。服用量为一次0.8g，一日2次。
以下通过药效学试验、毒理学试验证明本发明的有益效果。
试验例1本发明中药降脂红曲制剂对大鼠食物性高脂血症的影响发明人通过对该降脂红曲制剂与单味洛伐他汀的药理试验对比研究证实，该降脂红曲制剂用于高脂血症的治疗具有更加显著的药理活性。
取50只雄性SD大鼠按空腹血清胆固醇和体重随机分为正常对照组(10只)和造模组(共50只)。造模组按以下配方5％猪油、2％胆固醇、1％胆盐、92％基础饲料喂饲5周，第28晚禁食，次日晨剪尾取血，测定空腹血清TC，和喂饲普通饲料大鼠TC比较，差异有显著意义即确定造模成功(TC＞6.00mmol/l)，共选出40只。然后按血清胆固醇和体重随机的原则分为4组(每组10只)，即对照组、高脂模型组、洛伐他汀组(2mg/kg)、中药降脂红曲A03组(0.1g/kg)；给药方式为灌胃，1ml/100g，1次/日；在给药期间，除正常对照组外，其余三组仍予高脂饲料。(药物用0.5％CMC悬浮溶解配成8mg/ml浓度冻存备用，临用前加0.5％CMC稀释，配成0.2mg/ml浓度)。
表4对高脂血症大鼠血清血脂TC、LDL-C、HDL-C、TG、的影响

与对照组相比*p＜0.05；**p＜0.01本发明降脂红曲对高脂血症大鼠血清血脂TC、LDL-C、TG降低活性、HDL-C升高活性明显优于相同剂量的洛伐他汀。
试验例2本发明中药降脂红曲制剂与洛伐他汀治疗高脂血症的比较凡符合高脂血症诊断标准的患者，保持平常饮食，二周类采血两次，如检测两次血清胆固醇≥6.5mmol/L或血清甘油三酯≥1.8mmol/L或高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)值男性≤1.04mmol/L，女性≤1.17mmol/L，中医辨证属脾气兼挟痰浊、血瘀证者，均为入选对象。排除以下情况(1)半年内曾患急性心肌梗塞、脑血管意外，严重创伤或重大手术，孕妇及哺乳期妇女。(2)肾病综合症、甲状腺机能减退，急性惠慢性肝胆疾病患者及糖尿病患者。(3)由药物(如吩噻嗪类、β-阻滞剂、肾上腺皮质类固醇及某些避孕药等)引起的高脂血症及纯合子型高胆固醇血症患者。(4)在使用肝素、甲状腺治疗药和其他影响血脂代谢药物的患者及近二周类曾采用其他降脂措施的患者。符合入选标准的150例，分成两组，对照组1(洛伐他汀组20mg/天，每日一片，连续四周)、治疗组1(本发明降脂红曲，总洛伐他汀含量小于12mg/天，分两次服，连续4周)。治疗组2(本发明降脂红曲，总洛伐他汀含量为20mg/天，分两次服，连续4周)疗效判定标准(1)显效达以下任何1项者，TC下降≥20％；TG下降≥40％；HDL-ch上升≥0.26mmol/L；AI下降≥20％。(2)有效TC下降≥10-19％；TG下降≥20-39％；HDL-ch上升＞0.104mmol/L-0.25mmol/L；AI下降≥10-19％。(3)无效未达到有效标准。结果如下表5本发明中药降脂红曲制剂与洛伐他汀治疗高脂血症的总有效率

以上临床研究表明治疗组1(每日服用量中洛伐他汀量小于12mg)疗效约相当于每日服用洛伐他汀片20mg，治疗组2TG总有效率明显优于对照组。红曲中多不饱和脂肪酸含量远远小于有效剂量(约为有效剂量的千分之一)，本发明降脂红曲的降脂活性明显优于相同剂量的洛伐他汀，说明本发明降脂红曲中多种活性成分具有协同增效作用。尤其克服了他汀类药物降甘油三酯的作用不够理想，需联合用药的缺点。
临床试验说明，本发明药物组合物具有治疗脂肪肝的作用。
试验例3本发明降脂红曲片剂对脂肪肝的影响收集35例脂肪肝患者(诊断标准B超检查诊断脂肪肝，参照《实用消化病学》；实验室检查参照《中药新药临床指导原则》，甘油三酯(TG)＞1.7mmmol/L，胆固醇(TC)＞5.7mmol/L，血清谷丙转氨酶(ALT)＞60IU/L)，服用实施例1的胶囊剂，用法为每次3粒，一日两次，4周为一疗程，连续治疗6个疗程。
疗效判定标准参照《中药新药临床指导原则》、《实用消化病学》及相关文献制定标准痊愈自觉症状消失、TC≤5.7mmol/L、TG≤1.7mmol/L/L，ALT≤60IU/L，B超显示肝脏征象肝脏光点、其后场回声恢复正常。显效症状明显好转、TC下降＞20％，TG下降＞40％，ALT下降≥50％或正常，B超肝脏光点密度明显好转，其后回声衰减明显减轻。有效症状有好转、TC下降10％-20％，TG下降20％-40％，ALT下降＜50％或正常，B超肝脏征象较前好转。无效或恶化自觉症状仍存在或加重，TC和(或)TG和(或)ALT和(或)B超声检查无变化或加重。
治疗结果治疗35例，痊愈5例，显效12例，有效11例，无效7例，总有效率80％。结果血脂得到理想控制，ALT、AST及胆碱脂酶指标恢复正常，B超图像60％的患者基本恢复正常。
临床试验说明，本发明的具有治疗脂肪肝的作用。
试验例4本发明降脂红曲片剂的急性毒性试验取ICR19-21g小鼠(由成都军区医药集团第一研究室药理研究室提供，动物级别一级。合格证号码川实动管质第-1号)30只，雌雄各半，8小时内连续给药两次，每次灌胃给药0.8ml(本发明外观红棕色的降脂红曲片剂，用0.7％CMC-Na配成0.3g/ml药液备用)相当于临床剂量400倍，给药后连续观察一周，看动物有无死亡。
由以上试验可见，动物一天给药0.48g-20g(相当于临床剂量400倍)连续观察一周无一死亡，无明显的其他毒性反应，动物状况良好，且我们不能再增大给药体积和浓度，故认为本发明的中药红曲是一种毒性小，安全的药物。
通过上述药效学试验和毒理试验，充分说明本发明中药红曲各组分间相互协同增效，明显优于洛伐他汀，对所属领域的技术人员，本发明中药红曲的药效并非显而易见。本发明工艺科学合理，采用本发明药物组合物的制备方法所得的药物使用剂量小，原料成本低，临床疗效显著，毒副作用小，使用方便，质量稳定，可控，其效价比符合国情。
本发明提供的的红曲属紫色红曲霉新菌株，是由“中国.武汉.武汉大学”，中国典型培养物保藏中心CCTCC保藏的，保藏日期2005年7月16日，保藏号为CCTCC M 205073，分类命名为Monascus Purpureus Went Diao 5.029的菌株。
权利要求
1.一种红曲属新菌株，其特征是所述红曲属新菌株为紫色红曲霉(MonascusPurpureus Went)，其发酵产物中含开、闭环结构的洛伐他汀15-30mg/g，不饱和脂肪酸为3-6mg/g，其中开环结构的洛伐他汀占总洛伐他汀的百分比为10-90％。
2.根据权利要求1所述的红曲属新菌株，其特征是所述菌株发酵产物中的桔霉素含量小于等于100ppb。
3.根据权利要求1所述的红曲属新菌株，其特征是由中国典型培养物保藏中心CCTCC保藏的保藏号为CCTCC M 205073的菌株。
4.一种中药红曲，它是由权利要求1、2或3所述的红曲霉发酵制备。
5.根据权利要求4所述的中药红曲，其特征是含有不饱和脂肪酸3-6mg/g，洛伐他汀15-30mg/g，其中开环结构的洛伐他汀占总洛伐他汀的百分比为10-90％。
6.根据权利要求5所述的中药红曲，其特征在于含有如下主要有效成分不饱和脂肪酸3-6mg/g，洛伐他汀20-30mg/g，其中开环结构的洛伐他汀占总洛伐他汀的百分比为10-90％。
7.根据权利要求6所述的中药红曲，其特征在于含有如下主要有效成分不饱和脂肪酸3-6mg/g，洛伐他汀20-25mg/g，其中开环结构的洛伐他汀占总洛伐他汀的百分比为50-90％。
8.根据权利要求4～7任一项所述的中药红曲，其特征在于所述不饱和脂肪酸中多不饱和脂肪酸的量为2-5mg/g。
9.根据权利要求8所述的中药红曲，其特征在于所述不饱和脂肪酸主要为油酸和亚油酸。
10.根据权利要求4～9任一项所述的中药红曲，其特征在于中药红曲含桔霉素小于等于100ppb。
11.一种制备权利要求4所述的中药红曲的方法，它包括如下步骤a、种子液制备紫色红曲霉(Monascus Purpureus Went)，由中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏的保藏编号为CCTCC M 205073的菌株，作为生产用种子，于30～40℃，180～220rpm，PDA培养基中培养8～24h作为一级种子或发酵罐种子液；b、发酵采用液态发酵或固态发酵，干燥，得本发明红曲。
12.根据权利要求11所述的中药红曲的制备方法，其特征在于步骤b所述的液态发酵的培养基配方为(g/L)碳源(蔗糖)10～40，氮源(蛋白胨)10～45，牛肉膏0.5～3，CaCl20.05～1，pH6.5±1.0，121℃灭菌20min，其中，C源可以用葡萄糖、甘油、可溶性淀粉、糖蜜等代替，N源可以用玉米浆、酵母膏、牛肉膏、植物或动物蛋白胨；发酵方法为将制备好的种子液按照5％～20％的接种量接入发酵培养基中。发酵培养基于30～40℃，180～220rpm培养5d～7d，在离培养结束24h，加入开环稳定液，离心除去上清，菌丝体破碎，填加辅料，干燥得到本发明红曲粉。
13.根据权利要求11所述的中药降脂红曲的制备方法，其特征在于步骤b所述的固态发酵的营养液的组分为(g/L)甘油50～300，蛋白胨50～300，牛肉膏50～100，Na2HPO4·12H2O 5～20，NaH2PO4·2H2O 5～20，CaCl20.5～10，MgSO4·7H2O 0.5～10，Na2CO30.5～10。其发酵方法是将梗米灭菌后喷洒营养液，重量配比为每1000g米喷洒营养液20～120ml，于100℃蒸煮得到培养基，冷却后将制备好的种子液按照5％～20％的接种量接入混有营养液的培养基中；培养基于30～45℃，湿度≥80％，分别在培养后8d和12d按液固比5％加入固态发酵的营养液，于发酵后14天结束，高温灭菌，干燥得到本发明的红曲。
14.一种药物组合物，它是由权利要求4-10任一项所述的红曲为活性成分，将红曲粉碎至80-200目，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的药剂。
15.根据权利要求14所述的药物组合物，其特征在于所述的药剂是片剂、胶囊剂、分散剂、微粉化制剂或微丸。
16.权利要求14所述的药物组合物在制备治疗或预防高脂血症的药物中的用途。
17.权利要求14所述的药物组合物在制备治疗脂肪肝的药物中的用途。
全文摘要
本发明提供一种红曲属紫色红曲霉(Monascus Purpureus Went)新菌株，及其发酵制备的中药降脂红曲；所述中药降脂红曲主要有效成分含有开、闭环结构的洛伐他汀15－30mg/g，不饱和脂肪酸3－6mg/g，该产品桔霉素含量小于等于100ppb，其中开环结构的洛伐他汀占15－90％。本发明提供的新菌株具有高洛伐他汀产率、含有开环结构，多不饱和脂肪酸含量高，不产、极低产桔霉素的特点；本发明提供的中药降脂红曲与单纯的洛伐他汀相比，多种活性成分具有协同作用，克服了现有药物需联合用药、药价高、副作用大的缺点。该天然降脂红曲原料可制成片剂、胶囊、分散剂、微粉化制剂、微丸。该红曲药物原料可用于制备各种药物或保健食品。
文档编号C12P1/02GK1908156SQ20051002139
公开日2007年2月7日 申请日期2005年8月2日 优先权日2005年8月2日
发明者及元乔, 刘忠荣, 陈军, 赵海, 王若竹, 黄瑜, 李伯刚 申请人:成都地奥九泓制药厂