专利名称：改进微生物中产物生产的方法和组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物学、分子生物学和生物技术领域。更具体地，本发明涉及改进微生物中产物如乙醇和氢的生产的方法和组合物。
背景技术：
开发从可再生和可持续生物质资源生产可用能源的方法和组合物是有利的。碳水化合物形式的能源可以在废弃生物质和专用能源作物例如，谷物如玉米或小麦，或草如柳枝稷中找到。目前的挑战是开发将碳水化合物转化成可用能源形式的可行的和经济的策略。从碳水化合物得到有用能源的策略包括生产乙醇和其它醇，将碳水化合物转化成氢，和通过燃料电池将碳水化合物直接转化成电能。得到乙醇形式生物质的策略的例子由DiPardo， Journal of Outlook for Biomass Ethanol Production and Demand(EIA Forecasts), 2002 ；Sheehan, Biotechnology Progress,15 :8179,1999 ；Martin, Enzyme Microbes Technology,31 :274,2002 ；Greer, BioCycle,61-65, April 2005 ；Lynd, Microbiology and Molecular Biology Reviews，66 :3，506—577，2002 ；禾口 Lynd 等在"Consolidated Bioprocessing of Cellulosic Biomass :An Update, " Current Opinion in Biotechnology, 16 :577-583, 2005 中描述。
发明内容
本申请特别基于Clostridium phytofermentans基因的鉴定，所述基因编码预测涉及在产物产量有用的培养基上生长的产物，所述产物如燃料，例如乙醇和氢。本文中所鉴定的基因可以在其它微生物中异源表达以提供新的或增强的功能。同样，这些基因可以在 C. phytofermentans中，例如由外源引进的核酸表达，以提供增强的功能。一些实施方式包括含有编码至少一种在C. phytofermentans中鉴定的水解酶的分离核酸的多核苷酸。在这样的实施方式中，所述分离核酸可以从表6中选择。在具体的实施方式中，所述水解酶选自 Cphy3367、Cphy3368、Cphy0430、Cphy3854、Cphy0857、 Cphy0694和Cphyl^9组成的组。名称Cphy3367代表JGI号码，其指的是Genbank记载的 C. phytofermentans的美国国家生物技术信息中心(NCBI)基因座标签。在更多实施方式中，所述多核甘酸可以包含可操作地连接至编码所述水解酶的分离核酸的调控序列。一些实施方式包括含有编码至少一种在C. phytofermentans中鉴定的ATP结合盒 (ABC)转运子的分离核酸的多核苷酸。在这些实施方式中，所述分离核酸可以从表7中选择。在具体实施方式
中，所述ABC转运子选自Cphy3854、Cphy3855、Cphy3857、Cphy3858、 Cphy3859、Cphy3860、Cphy3861和Cphy3862组成的组。在更多实施方式中，所述多核苷酸可以包含可操作地连接至编码ABC转运子的分离核酸的调控序列。一些实施方式包括含有编码至少一种在C. phytofermentans中鉴定的转录调节因子的分离核酸的多核苷酸。在这些实施方式中，所述分离核酸可以从表8中选择。在更多实施方式中，所述多核苷酸可以包含可操作地连接至编码转录调节因子的分离核酸的调控序列。一些实施方式包括含有编码本文描述的水解酶、ABC转运子和转录调节因子的核酸的任何组合的多核苷酸盒。在一种实施方式中，多核苷酸盒可以包含编码至少一种水解酶的分离核酸和编码至少一种ABC转运子的分离核酸。在另一种实施方式中，多核苷酸盒可以包含编码至少一种水解酶的分离核酸和编码至少一种转录调节因子的分离核酸。在另一种实施方式中，多核苷酸盒可以包含编码至少一种ABC转运子的分离核酸和编码至少一种转录调节因子的分离核酸。在另一种实施方式中，多核苷酸盒可以包含编码至少一种水解酶的分离核酸和编码至少一种ABC转运子的分离核酸和编码至少一种转录调节因子的分离核酸。一些实施方式包括含有本文描述的任何多核苷酸的表达盒和可操作地连接至所述多核苷酸盒的调控序列。一些实施方式包括含有任何本文描述的多核苷酸、多核苷酸盒和/或表达盒的重组微生物。在具体实施方式
中，所述重组微生物可以选自Clostridium eellulovorans> Clostridium eellulolyticum、Clostridium thermoce1lum、 Clostridium josui、 Clostridium papyrosolvens、 Clostridium eellobioparum、 Clostridium hungatei、 Clostridium eellulosi、 Clostridium stercorarium、 Clostridium termitidis、Clostridium thermocopriae、Clostridium celerecrescens、 Clostridium polysaccharolyticum> Clostridium populeti> Clostridium lentocellum、 Clostridium chartatabidum、Clostridium aldrichii、Clostridium herbivorans、 Acetivibrio cellulolyticus、Bacteroides cellulosolvens、Caldicellulosiruptor saccharolyticum、Ruminococcus albus、Ruminococcus flavefaciens> Fibrobacter succinogenes、Eubacterium cellulosolvens、Butyrivibrio fibrisolvens、 Anaerocellum thermophilum、Halocella eellulolytica、Thermoanaerobacterium thermosaccharoIyticum 禾口 Thermoanaerobacterium saccharolyticum 的^1。一些实施方式包括编码在C. phytofermentans中鉴定的水解酶的分离蛋白。在一些实施方式中，提供生产乙醇的方法。这些方法包括培养微生物、提供培养基和提供本文描述的任何分离蛋白。一些实施方式包括分离的多核苷酸盒，所述分离的多核苷酸盒包括一个或多个、两个或多个、或全部三个编码Clostridium phytofermentans水解酶的序列、编码 C. phytofermentans ATP 结合盒(ABC)转运子的序列禾口编码 C. phytofermentans 转录调节因子的序列。在一些实施方式中，所述水解酶选自Cphy3368、Cphy3367、Cphy 1799, Cphyl800、Cphy2105、Cphyl071、Cphy0430、Cphyll63、Cphy3854、Cphyl929、Cphy2108、 Cphy3158、Cphy3207、Cphy3009、Cphy3010、Cphy2632、Cphy3586、Cphy0218、Cphy0220、Cphyl720、Cphy3160、Cphy2276、Cphyl714、Cphy0694、Cphy3202、Cphy3862、Cphy0858、 Cphyl510、Cphy2128、Cphyll69、Cphyl888、Cphy2919 和 Cphyl612 组成的组。在一些实施方式中，所述 ABC 转运子选自 Cphyl529、Cphyl530、Cphyl531、Cphy3858、Cphy3859、Cphy3860、 Cphy2569、Cphy2570、Cphy2571、Cphy2654、Cphy2655、Cphy2656、Cphy3588、Cphy3589、 Cphy3590、Cphy3210、Cphy3209、Cphy3208、Cphy2274、Cphy2273、Cphy2272、Cphy2268、 Cphy2267、Cphy2266、Cphy2265、Cphy2012、Cphy201U Cphy2010、Cphy2009、Cphyl717、 Cphyl716、Cphyl715Cphyl45U Cphyl450、Cphyl449、Cphyl448、Cphyl 134, Cphy 1133 和 Cphyl 132组成的组。一些实施方式包括重组微生物，所述重组微生物包括本文公开的核酸，如一个或多个、两个或多个、或全部三个编码Clostridium phytofermentans水解酶的外源核酸、 编码C. phytofermentans ATP结合盒(ABC)转运子的外源核酸和编码C. phytofermentans 转录调节因子的外源核酸。在一些实施方式中，所述水解酶选自Cphy3368、Cphy3367、 Cphyl799、Cphyl800、Cphy2105、Cphyl071、Cphy0430、Cphyll63、Cphy3854、Cphyl929、 Cphy2108、Cphy3158、Cphy3207、Cphy3009、Cphy3010、Cphy2632、Cphy3586、Cphy0218、 Cphy0220、Cphyl720、Cphy3160、Cphy2276、Cphyl714、Cphy0694、Cphy3202、Cphy3862、 Cphy0858、Cphyl510、Cphy2128、Cphyl 169、Cphyl888、Cphy2919 和 Cphyl612 组成的组。在一些实施方式中，所述ABC转运子选自Cphyl529、Cphyl530、Cphy 153U Cphy3858、 Cphy3859、Cphy3860、Cphy2569、Cphy2570、Cphy2571、Cphy2654、Cphy2655、Cphy2656、 Cphy3588、Cphy3589、Cphy3590、Cphy3210、Cphy3209、Cphy3208、Cphy2274、Cphy2273、 Cphy2272、Cphy2268、Cphy2267、Cphy2266、Cphy2265、Cphy2012、Cphy201U Cphy2010、 Cphy2009、Cphyl717、Cphyl716、Cphyl715 Cphyl451、Cphyl450、Cphyl449、Cphyl448、 Cphyl 134、Cphyl 133和Cphyl 132组成的组。在一些实施方式中，所述微生物选自 Clostridium ce1Iulovorans>Clostridium ce1IuloIyticum>Clostridium thermocellum、 Clostridium josui、 Clostridium papyrosolvens、 Clostridium eellobioparum、 Clostridium hungatei、 Clostridium cellulosi、 Clostridium stercorarium、 Clostridium termitidis、Clostridium thermocopriae、Clostridium celerecrescens、 Clostridium polysaccharolyticum> Clostridium populeti> Clostridium lentocellum、 Clostridium chartatabidum、 Clostridium aldrichii、 Clostridium herbivorans、 Acetivibrio cellulolyticus、Bacteroides cellulosolvens、Caldicellulosiruptor saccharolyticum、Ruminococcus albus、Ruminococcus flavefaciens> Fibrobacter succinogenes、Eubacterium cellulosolvens、Butyrivibrio fibrisolvens、 Anaerocellum thermophilum、Halocella eellulolytica、Thermoanaerobacterium thermosaccharoIyticum 禾口 Thermoanaerobacterium saccharolyticum 的^1。一些实施方式包括生产乙醇的方法，所述方法包括培养至少一种本文描述的重组微生物。这样的实施方式同样可以包括向微生物提供培养基。在具体实施方式
中，所述培养基可以选自锯末、木粉、木浆、纸浆、纸浆废汽、草如柳枝稷、生物质植物和农作物，如海甘蓝、海藻、稻壳、甘蔗渣、黄麻、树叶、大型藻类物质、微藻类物质、草屑(grass clippings)、 玉米杆、玉米棒子、玉米粒、玉米粉、蒸馏谷物和果胶组成的组。在具体实施方式
中，所述培养基可以是果胶。
一些实施方式包括处理水解酶培养基的方法，包括提供外源表达Clostridium phytofermentans水解酶的微生物和向所述微生物提供水解酶的培养基，使得所述培养基被处理以形成产物。在一些实施方式中，所述微生物外源表达转运(如输入或输出)产物白勺 Clostridium phytofermentans ATP(ABC) $fgi。一些实施方式包括用于生物燃料生产的产物，包括木质纤维生物质和能够直接水解和发酵所述生物质的微生物，其中所述微生物被改良以提高一种或多种纤维素酶(如在本文中公开的一种或多种纤维素酶,如 Cphy3367、Cphy3368、Cphy0218、Cphy3207、Cphy2058 和Cphyll63)的活性。在一些实施方式中，所述微生物能够直接发酵五碳和六碳糖。在一些实施方式中，所述微生物是细菌，如梭菌属的种，如Clostridium phytofermentans。在一些实施方式中，所述微生物包含一种或多种提高一种或多种纤维素酶活性的异源多核苷酸。一些实施方式包括用于生物燃料生产的产物，包括碳质生物质和能够直接水解和发酵所述生物质的微生物，其中所述微生物被修饰以提高一种或多种纤维素酶(如在本文中公开的一种或多种纤维素酶,如 Cphy3367、Cphy3368、Cphy0218、Cphy3207、Cphy2058 和 Cphyl 163)的活性。在一些实施方式中，所述微生物能够生产发酵终产物。在一些实施方式中，发酵终产物的实质部分是乙醇。在一些实施方式中，所述发酵终产物包括乳酸、乙酸和/或蚁酸。在一些实施方式中，所述微生物能够吸收一种或多种复杂碳水化合物。在一些实施方式中，所述生物质具有比单体碳水化合物更高浓度的低聚体碳水化合物。一些实施方式包括生产生物燃料的方法，包括(a)用能够直接水解和发酵碳质生物质的微生物接触碳质生物质，其中所述微生物被改良以提高一种或多种纤维素酶(如在本文中公开的一种或多种纤维素酶，如 Cphy3367、Cphy3368、Cphy0218、Cphy3207、Cphy2058 和 Cphyl 163)的活性；和(b)对上述水解和发酵给予充分时间以生产生物燃料。在一些实施方式中，所述微生物能够吸收一种或多种复杂碳水化合物。在一些实施方式中，所述生物质具有比单体碳水化合物更高浓度的低聚体碳水化合物。在一些实施方式中，所述水解导致相对单体碳水化合物更高浓度的纤维二糖和/或更大的低聚物。本文中使用的抬头仅出于结构目的，并不能被解释为以任何方式限定所描述的主题。本申请中引用的所有文献和相似的材料，包括但不限于专利、专利申请、论文、书籍、论述和因特网网页，特别地出于任何目的通过引用的方式全部结合至本文。如果术语在结合的参考文献中的定义与本申请中提供的定义不同，以本申请提供的定义为准。应当意识到， 在本申请讨论的度量如温度、浓度和时间之前有隐含的“大约”，因此稍微的和非实质的偏差包括在本申请的范围内。在本申请中，除另有明确说明，单数包括复数。同样，“包含”、 “包括”的使用并不意味限定。应当理解，前述的一般性描述和之后的具体描述都仅是示例和说明性的，而不是限制本发明。本文中使用的术语“一”指的是一或多于一(即至少一) 的文章的文法对象。例如，“一个元件”意味着一个元件或多于一个元件。除非另有限定，用于与本文所描述的发明相关的科技术语应当具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非文中另有要求，单数术语应当包括复数并且复数术语应当包括单数。通常，与本文描述的细胞和组织培养、分子生物学和蛋白和寡聚或多聚核苷酸化学和杂交相关使用的术语和技术是本领域中已知和通常使用的那些。例如，标准技术被用于核酸纯化和制备、化学分析、重组核酸和寡核苷酸合成。根据生产商的说明书或如本领域通常使用的或如本文描述的方式实施酶反应和纯化技术。本文描述的技术和工作程序一般根据本领域已知的常规方法和如在多个一般和更具体的参考文件中描述的方式实施，所述参考文件在本说明书中贯穿引用和讨论。见，如Sambrook等，Molecular Cloning A Laboratory Manual (第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. 2000)。所使用的与本文有关的术语和本文所描述的实验室工作程序和技术是本领域已知和通常使用的那些。为与本文提供的实施方式使用一致，除非有其它说明，以下术语应当被理解为具有以下含义“核苷酸”指核苷的磷酸酯，作为单体单位或核酸内。“5’ -三磷酸核苷酸”指三磷酸酯基团的5’位置有核苷酸，其有时被表示为“NTP”或“dNTP”和“ddNTP”以具体指出核糖的结构特征。所述三磷酸酯基团可以包括对于不同氧的硫取代物，如α-硫代-5'-三磷酸核昔酸。核酸化学的综述见Shabarova，Z.禾P Bogdanov，A，Advanved Organic Chemistry of Nucleic Acids, VCH, New York,1994。术语“核酸”和“核酸分子”指如DNA (脱氧核糖核酸)和RNA (核糖核酸)的天然核酸序列、人工核酸、它们的类似物或它们的组合。如本文中所用的，术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”可交替使用，意思是核苷酸单体 (核酸)的单链或双链聚合体，包括但不限于由如3’ -5’和2’ -5’的核苷间磷酸二酯键所连接的、如5’-5’的反向连接的2’-脱氧核糖核苷酸(核酸)和核糖核苷酸(RNA)，分枝结构，或核酸类似物。多核苷酸具有缔合的反离子，如H+、NH4+、三烷基铵、Mg2+、Na+等等。多核苷酸可以完全由脱氧核糖核苷酸、完全由核糖核苷酸或它们的混合物组成。多核苷酸可以由核苷碱基和糖类似物组成。多核苷酸典型的大小范围在几个单体单元(例如在本领域当它们更通常普遍被指定为寡核苷酸时，为5-40)至几千个单体核苷酸单元。除非另有指定， 只要出现多核苷酸序列，应当理解所述核苷酸从左至右是按照5’到3’顺序，并且“A”表示脱氧腺苷，“C”表示脱氧胞苷，“G”表示脱氧鸟苷，“T”表示胸苷。本文使用的“燃料和/或其它化学品”指的是适于作为液体或气体燃料的化合物， 包括但不限于烃、氢、甲烷、羟基化合物如醇(如乙醇、丁醇、丙醇、甲醇等)、羰基化合物如醛和酮(如丙酮、甲醛、ι-丙醛等)、有机酸、有机酸衍生物如酯(如蜡酯、甘油酯等)和其它官能化合物，包括但不限于1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、乳酸、蚁酸、乙酸、琥珀酸和丙酮酸， 所述化合物由纤维素酶、多糖酶、脂肪酶、蛋白酶、木质素酶和半纤维素酶等酶产生。术语“质粒”指环形核酸载体。通常，质粒包含复制起点，使得在细菌(或有时真核的)细胞中质粒产生许多拷贝而没有整合至宿主细胞DNA中。本文中使用的术语“构建体”指重组核苷酸序列，通常是重组核酸分子，它的产生出于表达特异核苷酸序列的目的，或被用在其它重组核苷酸序列的构建中。大体上，本文中使用的“构建体”指重组核酸分子。“表达盒”指一组允许多核苷酸在宿主细胞中转录的多核苷酸元件。典型地，所述表达盒包括启动子和被转录的异源或本身的多核苷酸序列。表达盒或构建体同样可以包括，如转录终止信号、多腺苷酸化信号和增强子元件。“表达载体”意思是使得多核苷酸在细胞内表达的载体。多核苷酸的表达包括转录和/或转录后事件。“表达构建体”是插入有目标核苷酸序列的载体，所述目标核苷酸序列以使得所述目标核苷酸序列置于可操作地连接至表达载体中存在的表达序列的方式插入。“操纵子”指一组产生信使RNA(mRNA)的多核苷酸元件。典型地，所述操纵子包括启动子和一个或多个结构基因。典型地，操纵子包含一个或多个被转录至一个多顺反子 mRNA(编码多于一个蛋白的单一 mRNA分子)的结构基因。在一些实施方式中，操纵子也可以包括调节操纵子结构基因活性的操纵基因。本文中使用的术语“宿主细胞”指使用本发明的方法和组合物转化的细胞。大体上，本文中使用的宿主细胞意思是引入有目标核酸的微生物细胞。本文中使用的术语“转化”指在细胞中随着非宿主核酸序列的融合而诱导的永久或瞬时遗传改变，如永久遗传改变。本文中使用的术语“转化的细胞”指通过重组核酸技术手段已经将编码目标基因产物(如RNA和/或蛋白)的核酸分子引入细胞(或其祖先细胞)的细胞。本文中使用的术语“基因”指宿主基因组的任何和所有不连续的编码区，或者仅编码功能性RNA (如tRNA、rRNA、调控RNA如核酶)的区和包括相关的非编码区和调控区。术语“基因”的范围包括编码特异多肽的开放阅读框、内含子和涉及表达调控的邻近的5’和 3’非编码核苷酸序列。在这点上，基因可以进一步包含控制信号如启动子、增强子和/或与给出基因天然相关的终止信号，或异源控制信号。基因序列可以是cDNA或基因组核酸或它们的片段。基因可以被引入至合适的载体以在染色体外存在或整合至宿主。本文中使用的术语“目标基因”、“目标核苷酸序列”、“目标多核苷酸”或“目标核酸”指任何编码期望在宿主细胞中表达的蛋白或其它分子(如在靶细胞中生产蛋白或其它生物分子(如RNA产物))的核苷酸或核酸序列。所述目标核苷酸序列可以可操作地连接至促进表达的其它序列，如启动子。本文中使用的术语“启动子”指足以引导与其可操作连接的核酸序列转录的最小的核酸序列。本文中使用的术语“诱导型启动子”指当结合转录激活剂时有转录活性的启动子，其进而在特定条件下被激活，如存在影响转录激活剂与诱导型启动子结合和/或影响转录激活剂本身的功能的特定化学信号或化学信号的组合时。本文中使用的术语“操纵子”、“控制序列”或“调控序列”指调控可操作地连接的编码序列在特定宿主生物体中表达的核酸序列。适合原核生物的控制序列包括例如启动子、 任选地操纵基因序列和核糖体结合位点。“可操作地连接”等的意思是多核苷酸元件具有功能关系的连接。当核酸序列被置于与另一核酸序列具有功能关系，则所述核酸序列是“可操作地连接”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则它是可操作地连接至编码序列。在一些实施方式中，可操作地连接意思是被连接的核酸序列典型地是邻近的，其中有必要使两个蛋白编码区，邻近的并在读码框中连接。编码序列“可操作地连接至”另一编码序列，RNA聚合酶将转录所述两条编码序列至单一 mRNA，其然后被翻译成具有源自两条编码序列的氨基酸的单一多肽。所述编码序列不需要彼此邻近，只要表达序列最终被加工产生需要的蛋白。“可操作地连接”启动子至可转录的多核苷酸意思是将可转录的多核苷酸置于启动子的调控控制下，其然后控制多核苷酸的转录和可选地多核苷酸的翻译。在异源启动子/ 结构基因化合物的构建中，典型地将启动子或它的变异体远离可转录的多核苷酸的转录起始位点放置，大约与该启动子和它在自然情况下控制的基因，即启动子起源的基因之间的距离相同。如本领域所知，可以在这个距离设置一些变异体而不丧失功能。相似地，与处于调控序列元件控制下的可转录的多核苷酸相关的调控序列元件如操纵子、增强子的典型放置由所述元件在它的自然情况下，即它所源于的基因的放置限定。“培养”表示在细胞或生物能够进行一些(如果不是全部)生物学过程的条件下孵育细胞或生物。例如，培养细胞使之生长或繁殖，或者它可能是非活性的但仍然能够进行生物学和/或生物化学过程如复制、转录、翻译等。“转基因生物”意思是在其部分细胞中存在有非内源性(即异源)核酸序列或非内源性(即异源)核酸序列稳定整合至其种系核酸中的非人类生物(如单细胞生物(如微生物)、哺乳动物、非哺乳动物(如线虫或果蝇))。本文中使用的术语“生物质”指大量活的或生物材料并包括天然的或加工的，以及更宽泛地天然有机材料。“重组”指合成的或其它体外操作的多核苷酸(重组多核苷酸)和在细胞或其它生物系统中使用重组多核苷酸生产由那些多核苷酸编码的基因产物的方法。例如，可以将克隆的多核苷酸插入至合适的表达载体中，例如细菌质粒，所述质粒可以用于转化合适的宿主细胞。包含重组多核苷酸的宿主细胞被称为“重组宿主细胞”或“重组细菌”。然后所述基因在重组宿主细胞中被表达以产生如“重组蛋白”。另外，重组多核苷酸可以提供非编码功能，例如启动子、复制起点或核糖体结合位点。术语“异源重组”指基于核酸序列相似性两个核酸分子之间的重组过程。该术语包括交互重组和非交互重组(也被称为基因转变)。此外，所述重组可以是等价或非等价的交叉事件的结果。等价交叉发生在两个等价序列或染色体区之间，而非等价的交叉发生在非等价序列或染色体区的相同(或基本上相同)片段之间。非相等的交叉典型地导致基因重复或删除。涉及同源重组的酶和机制的描述见Watson等，Molecular Biology of the Gene 313-327 页，The Benjamin/Cummings Publishing Co.第 4 版(1987)。术语“非同源或随机整合”指不包括同源重组的、核酸被整合至基因组的任何过程。它表现出是整合可以发生在很多基因组定位的任意一个的随机过程。“异源多核苷酸序列”或“异源核酸”是相对术语，指与另一多核苷酸(如启动子序列)以使得两条多核苷酸序列没有被设置成如在自然中彼此一样的关系的方式而功能相关的多核苷酸。异源多核苷酸序列包括如可操作地连接至异源核酸的启动子，和包含它天然启动子的多核苷酸序列，其被插入至异源载体中用于转化至重组宿主细胞。异源多核苷酸序列被认为是“外源”因为它们通过转化技术被引入至宿主细胞。但是异源多核苷酸可以来自不同来源或来自相同来源。异源多核苷酸序列的改变可以发生，例如，通过用限制性酶处理所述多核苷酸以产生能够可操作地连接至调控元件的多核苷酸序列。改变也可以通过如定点突变发生。术语“内源表达”指相对于宿主细胞是天生的并且在所述宿主细胞中天然表达的多核苷酸。“能够表达”指为内源和/或外源多核苷酸的表达提供足够的细胞环境的宿主细胞。本申请涉及2008年2月27日提交的美国临时申请号61/032，048、2009年2月27日提交的国际申请号PCT/US2009/35597、2009年4月6日提交的美国申请号12/419,211、 2008年6月11日提交的美国临时申请号61/060，620和2009年6月11日提交的美国申请号12/483，118，每一个的全部内容都出于任何目的通过引用的方式结合至本文。下面的图、描述和实施例详细说明了本发明的一些具体实施方式
。本领域技术人员将意识到许多变化和修改形式都包括在它的范围内。因此，一些具体实施方式
的描述不应当被认为限制本发明的范围。
图1是一系列多核苷酸基因组合实施例的简图。R代表转录调控序列；A、B和C代表编码ATP结合盒(ABC)转运子的序列；GH代表编码糖苷水解酶的序列；S代表信号序列。图2是一系列C. phytofermentans中基因组合的具体实施例的简图。数字代表特定序列在C. phytofermentans染色体上的定位。图3是C. phytofermentans Affymetrix微列阵设计的简图。破折号表示微列阵上合成的M碱基探针。盒子表示预测的开放阅读框，如蛋白编码区。11个M碱基探针被用于测量每一个开放阅读框(ORF)的水平。基因间区在DNA两侧均由M碱基探针覆盖，所述M碱基探针由单一 DNA碱基区分。图4是测量mRNA转录本范围的方法的简图。假定的mRNA转录本包括延伸相应预测的ORF的5’和3’的非编码区。探针由破折号表示。在这个实施例中，ORF的左端(5’ ) 的三个探针和ORF的右端(3’ )的两个探针将指示mRNA的转录本范围。图 5 是 C. phytofermentans 染色体的图示。图6是显示Ikb基因组片段中GC含量作为随C. phytofermentans基因组距离的函数的图示。6个GC含量> 50%的基因组岛被编号。这6个区构成总共16个11Λ区。图7是基于16S rRNA基因序列梭状芽胞杆菌类内的菌株C. phytofermentans和相关分类的邻接树。簇I包括引起疾病的梭状芽胞杆菌，簇III包括可水解纤维素的梭状芽胞杆菌，簇XIVa包括肠道微生物，以及梭菌属中的宏基因组序列。节点上的数字是基于 1000个重复取样数据库的邻接分析的自引支持度的水平(百分比)。Bacillus subtilis 被用作为外群体。条形，每个位置4个核苷酸取代。图8是显示Clostridium phytofermentans ISDg CDk在其它测序的梭状芽胞杆菌类细菌基因组中的最好匹配(e值截止于0.01)的数值的环状图。图9A和9B是显示了使用BLASTP比较在不同生物中糖苷水解酶(GH)编码基因 (9A)和所有基因(9B)的环状图。图10是显示了糖苷水解酶家族GH9域的分子系统发生的邻接树。图11是显示了糖苷水解酶家族GH5域的分子系统发生的邻接树。图12是显示了实施例假定水解酶的概略图。一些水解酶可以是细胞外或膜结合的。GH 水解酶；CBM 碳水化合物结合域。图13是C. phytofermentans中吸收和代谢戊糖的描述。图14是C. phytofermentans中吸收和代谢岩藻糖的描述。图15是C. phytofermentans中吸收和代谢鼠李糖的描述。图16是C. phytofermentans中调节、吸收和代谢海带多糖的描述。
图17是C. phytofermentans中吸收和代谢纤维二糖的描述。图18是ρ IMP-Cphy质粒图的描述。图 19 是 pCphyP;3510-3367 质粒图的描述。
具体实施例方式本文公开的多个实施方式一般集中在制造重组微生物的组合物和方法，在多种发酵环境下培养时所述重组微生物能够生产燃料。一般性地，重组微生物能够有效地和稳定地生产燃料，如醇，和相关化合物，从而可以从相对低廉的天然生物质材料如纤维素中得到高产量燃料。在一些实施方式中，重组微生物可以有效地和稳定地催化低廉的天然生物质材料如木质纤维素的转化，以生产糖类和多糖，和相关的化合物。目前，有少数几项使用能够生产燃料的重组生物的技术。许多技术通常具有导致低燃料产量、高耗费和不期望的副产品的问题。例如，一些已知技术使用玉米颗粒和其它谷类作为给料。但是，在谷物供应上竞争性饲料和食物需求以及价格可能最终限制从玉米和其它谷类生产乙醇的发展。其它给料来源包括木质纤维素，通过糖化作用和发酵其可以生产乙酉享(Lynd, L. R. , Cushman, J. H. , Nichols, R. J.禾口 Wyman, C. Ε. Fuel ethanol from cellulosic biomass, “ Science 251,1318-1323 (1991)) 由于木质纤维素是生物质的主要成分，也是地球上最丰富的生物材料，因此源自木质纤维生物质的燃料是可更新能源选择，具有维持世界经济、能源和环境的潜力。但是，常规的木质纤维素乙醇产品需要昂贵的和复杂的多步过程，包括木质纤维素材料的生产和用外源糖分解酶预处理木质纤维素材料、水解存在于预处理的生物质中的多糖，和己糖和戊糖的分离发酵。在一种实施方式中，本发明的方法和组合物包含遗传性改良或制造微生物以提高一种或多种酶的酶活性，包括但不限于纤维素酶。这样的改良的实施例包括修改内源核酸调控元件以增加一种或多种酶的表达(如将编码目标酶的基因可操作地连接至强启动子)，向微生物中引入额外的核酸分子拷贝以提供酶的增强的活性，将编码一种或多种酶的基因可操作地连接至诱导型启动子，或它们的组合。可以改良本发明的不同的微生物以提高一种或多种纤维素酶或与纤维素处理相关的酶的活性。纤维素酶的分类通常基于将形成具有相似或同样活性的家族的酶集合，但不需要同样的底物特异性。这些分类之一是CAZY系统(CAZY代表碳水化合物活性酶)， 例如，列有115种不同的糖苷水解酶(GH)，命名为GHl至GHl 15。每一种不同的蛋白家族通常具有相应的酶活性。本数据库包括纤维素和半纤维素活性酶。此外，Clostridium phytofermentans 白勺 i角军白勺■ @ 砠胃 M 3 1 www. ncbi. nlm. nih. gov/sites/ entrez上获得。通过提供使木质纤维素生物质可以在单一步骤中发酵成乙醇的方法和组合物，本文描述的一些实施方式简化了木质纤维素乙醇生产的常规多步过程。这被认为是综合生物过程(CBP)。由于CBP简化了整个转化过程，减少了成本和能源浪费，它被预示为唯一的经济地和环境地可持续的纤维素乙醇生物过程。在一些实施方式中，提供用于有效的燃料生产系统的多核苷酸和表达盒。所述多核苷酸和表达盒可以用于制备转化微生物的表达载体以赋予转化的微生物能够有效地生产极大数量的产物，如燃料。
在一些实施方式中，微生物的新陈代谢可以通过引入和表达多种基因而被改良。根据本发明的一些实施方式，重组微生物可以使用来自Clostridium phytofermentans (ISDgT，美国模式培养物保藏所700394T)的基因作为用于促进例如纤维素转化成燃料如乙醇和氢的生物催化剂。在一些实施方式中，C. phytofermentans (美国模式培养物保藏所700394τ)可以根据培养的菌株ISDgT的表型和基因型特征来定义(Warnick等，International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,52 :1155-60,2002)。Clostridium phytofermentans 白勺 i角军白勺■ @ 胃 M 3 1 www. ncbi. nlm. nih. gov/sites/ entrez上获得。多个实施方式大体上涉及用于生产燃料和/或其它有用的有机产物的系统、方法和组合物，包括菌株ISDgT和/或源自菌株ISDgT或单独分离的C. phytofermentans 种的任何其它菌株。可以使用标准的分类学因素对所述种进行定义(Mackebrandt和 Goebel，International Journal of Systematic Bacteriology, 44 :846-9，1994) 与模式株(ISDgT)相比，具有16s rRNA序列同源性值在97%和以上的菌株被认为是 C. phytofermentans菌株，除非显示它们具有DNA重新组合值小于70%。相当多的证据存在显示具有70%或以上的DNA重新组合值的微生物同样具有至少96%的DNA序列一致性并共享限定种类的表型特征。C. phytofermentans菌株ISDgT的基因组序列分析表明存在大量可能涉及植物多糖发酵的机制和途径的基因和遗传基因座，导致该微生物不平常的发酵性质。基于上述分类学因素，C. phytofermentans种的所有菌株可能同样具有所有、或近似所有的这些发酵性质。C. phytofermentans菌株可以是天然分离种或遗传改良菌株。可以将不同表达载体引入宿主微生物中使得转化的微生物可以在不同发酵条件下产生大量的燃料。可以将重组微生物改良使得当微生物被培养在包含例如纤维素的培养基上时稳定、高产量地生产燃料。C. phytofermentans,单独或与一种或多种其它微生物的组合可以大规模地将纤维素生物质材料发酵成易燃的生物燃料，如乙醇、丙醇和/或氢(见如美国专利申请号 2007/0178569 ;Warnick 等，Int J Syst Evol Microbiol (2002), 52 1155-1160，每一篇的全部内容都通过引用的方式结合至本文)。本文所公开的多核苷酸、表达盒和表达载体可以与许多不同宿主微生物一起使用以生产燃料如乙醇和氢。例如，除了 Clostridium phytofermentans，水解纤维素的微生物如 Clostridium cellulovorans、Clostridium cellulolyticum、Clostridium thermocellum、 Clostridium josui、 Clostridium papyrosolvens、 Clostridium eellobioparum、Clostridium hungatei、Clostridium eellulosi> Clostridium stercorarium、Clostridium termitidis、Clostridium thermocopriae、Clostridium thermocellum、 Clostridium celerecrescens、 Clostridium polysaccharoIyticum> Clostridium populeti、 Clostridium lentocellum> Clostridium chartatabidum、 Clostridium aldrichii、Clostridium herbivorans、Acetivibrio cellulolyticus、 Bacteroides cellulosolvens、Caldicellulosiruptor saccharoIyticum> Ruminococcus albus、 Ruminococcus flavefaciens> Fibrobacter succinogenes、 Eubacterium cellulosolvens、Butyrivibrio fbrisolvens、Anaerocellum thermophilum 禾口 Halocella cellulolytica都是特别有希望的宿主，因为它们能够水解纤维素。能够使用的其它微生物包括，例如糖分角军微生物，如 Thermoanaerobacterium thermosaccharoIyticum 禾口 Thermo anaerobacterium saccharolyticum。其它潜在的宿主包括其它细菌、酵母、藻类、真菌和真核细胞。在多种实施方式中，本发明所公开的多核苷酸、表达盒和表达载体可以与 C. phytofermentans或其它梭菌属的种一起使用以增加燃料如乙醇和氢的产量。如本领域技术人员将意识到的，生产能够生产燃料的重组生物可以具有非常大的益处，特别是对于有效的、划算的和对环境无破坏的燃料生产。例举的实施方式下面的描述和实施例详细描述本发明的一些实施方式。本领域技术人员将意识到它的范围包括多种变化和改良。因此，优选的实施方式的描述不能被认为限定了本发明的范围。本发明的多种实施方式提供了使用重组微生物生产燃料的益处。用于燃料生产最优化的多核苷酸、表达盒、表达载体和重组微生物根据本发明的一些实施方式而公开。水解酶本发明描述的一些实施方式涉及包含在C. phytofermentans中鉴定的编码水解酶的核酸的多核苷酸、多核苷酸盒、表达盒、表达载体和微生物。一些实施方式涉及使用包含在C. phytofermentans中鉴定的编码水解酶的核酸的多核苷酸、多核苷酸盒、表达盒、表达载体和微生物生产燃料的方法。使用编码水解酶的核酸的优势包括改进微生物水解多聚体如多糖和多肽的能力和性能。水解酶可以包括降解多聚体如二糖、三糖和多糖、多肽和蛋白的酶。多聚体同样可以包括例如纤维素、半纤维素、胶质、木质素和蛋白聚糖。降解多糖的酶和酶活性的例子包括但不限于糖苷水解酶(GH)、糖基转移酶(GT)、多糖裂解酶(PL)、碳水化合物酯酶(CE) 和包含碳水化合物结合模块(CBM)的蛋白(可以在互联网“cazy.org”上获得；Coutinho， P. Μ.禾口 Henrissat，B. (1999)Carbohydrate-active enzymes :an integrated database approach。在"Recent Advances in Carbohydrate Bioengineering，，中，H. J. Gilbert, G. Davies,B. Henrissat禾口B. Svensson, The Royal Society of Chemistry,剑桥，3-12页)。在一些实施方式中，GH、GT、PL、CE和CMB可以是具有不同活性的单独的酶。在其它实施方式中，GH、GT、PL、CE和CMB可以是具有具体催化活性的酶域。例如，具有多种活性的酶可以具有多种酶域，包括例如GH、GT、PL、CE和/或CBM催化域。0-糖基水解酶是广泛分布的一组酶，水解两个或多个碳水化合物之间、或碳水化合物和非碳水化合物部分之间的糖苷键。基于序列相似度的糖基水解酶分类系统已经导致鉴定 85 种不同家族 PUBMED :7624375, PUBMED :8535779, PUBMED。该分类可以在 CAZy (碳水化合物活性酶)网站PUBMED中获得。由于蛋白折叠比它的序列更保守，一些家族可以以 “部族(clan)”分组。糖苷水解酶家族9包括具有几种已知活性的酶，如内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶。在C. phytofermentans中，典型的GH9纤维素酶是ABX43720。任何水解酶可以选自C. phytofermentans的注解的基因组中以在本发明的产物和方法中使用。例子包括如一种或多种内切葡聚糖酶、几丁质酶、纤维二糖水解酶或内进行纤维素酶(在还原端或非还原端)。
此外，可以改良微生物如C. phytofermentans以改进一种或多种纤维素酶或水解酶的生产，或一种或多种这样的酶可以在不同的宿主(如其它细菌或酵母)中异源表达。 对于异源表达，可以通过重组技术改良细菌或酵母(如Brat等，Appl. Env. Microbiol. 29 ； 75 :2304_2311，公开了 Saccharomyces cerevisiae 中木糖异构酶的表达)。可以采取其它改良以提高在本发明的重组微生物中的末端产物(如乙醇)产量。 例如，所述宿主可以进一步包括额外的异源DNA片段，其表达产物是涉及单糖和/或寡聚糖运输至重组宿主的蛋白。同样地，来自糖酵解途径的额外的基因可以整合至宿主。在这样的途径中，可以提高乙醇生产速度。C. phytofermentans基因组的最显著和意想不到的特征之一是编码碳水化合物活性酶基因的数量和多样性。这个多样性在与C. phytofermentans相关的生物中是独一无二的。表1说明了涉及其它生物的碳水化合物基因的多样性。表1 碳水化合物活性基因数量和多样性
权利要求
1.一种用于生物燃料生产的产物，包括木质纤维生物质、能够直接水解和发酵所述生物质的微生物，其中所述微生物被改良以提高一种或多种纤维素酶的活性。
2.根据权利要求1所述的产物，其特征在于，所述微生物能够直接发酵五碳糖和六碳 糖。
3.根据权利要求2所述的产物，其特征在于，所述微生物是细菌。
4.根据权利要求1所述的产物，其特征在于，所述微生物是梭菌属的种。
5.根据权利要求1所述的产物，其特征在于，所述微生物是Clostridium phytofermentans0
6.根据权利要求1所述的产物，其特征在于，所述微生物是非重组体或重组体。
7.根据权利要求2所述的产物，其特征在于，所述微生物包含一种或多种能够提高所述一种或多种纤维素酶活性的异源多核苷酸。
8.一种用于生物燃料生产的产物，包括含碳的生物质、能够直接水解和发酵所述生物质的微生物，其中所述微生物被改良以提高一种或多种纤维素酶的活性。
9.根据权利要求8所述的产物，其特征在于，所述微生物能够生产发酵终产物，其实质部分是乙醇。
10.根据权利要求8所述的产物，其特征在于，所述微生物能够生产包括乳酸、乙酸和蚁酸的发酵终产物。
11.根据权利要求8所述的产物，其特征在于，所述微生物能够吸收一种或多种复杂碳水化合物。
12.根据权利要求8所述的产物，其特征在于，所述生物质包含比单体碳水化合物更高浓度的寡聚碳水化合物。
13.根据权利要求8所述的产物，其特征在于，所述一种或多种纤维素酶选自由 Cphy3367、Cphy3368、Cphy0218、Cphy3207、Cphy2058 和 Cphyl 163 组成的组。
14.根据权利要求8所述的产物，其特征在于，所述一种或多种纤维素酶是Cphy3367。
15.用于生产生物燃料的方法，所述方法包括(a)用能够直接水解和发酵含碳的生物质的微生物接触含碳的生物质，其中所述微生物被改良以提高一种或多种纤维素酶的活性；以及(b)对所述水解和发酵给予足够时间以生产生物燃料。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述一种或多种纤维素酶选自由 Cphy3367、Cphy3368、Cphy0218、Cphy3207、Cphy2058 和 Cphyl 163 组成的组。
17.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述微生物能够吸收一种或多种复杂碳水化合物。
18.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述生物质包含比单体碳水化合物更高浓度的寡聚碳水化合物。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述水解产生比单体碳水化合物更高浓度的纤维二糖和/或更大的寡聚体。
20.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述一种或多种纤维素酶是Cphy3367。
21.根据SEQID NO 1的分离核苷酸。
全文摘要
本发明提供在微生物中改进产物生产的方法和组合物，所述产物如燃料产物如乙醇。更具体地，本文描述了用于利用在Clostridium phytofermentans中鉴定的基因改进乙醇生产的方法和组合物。
文档编号C12P7/06GK102224249SQ200980138193
公开日2011年10月19日 申请日期2009年7月28日 优先权日2008年7月28日
发明者埃尔莎·珀蒂, 杰弗里·布兰查德, 约翰·费伯尔, 苏珊·莱申, 马蒂亚斯·施马利士 申请人:特瑞斯有限公司, 马萨诸塞大学