放线菌的代谢产物及其制备的抑制物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及生物领域，具体而言，涉及一种放线菌的代谢产物及其制备的抑制物。放线菌的代谢产物，所述代谢产物包括：糖基多肽、邻苯二甲酸二丁酯、无色天竺葵素；所述放线菌为从桃树根癌病的土壤中筛选出的菌株。本发明放线菌的代谢产物包括：糖基多肽、邻苯二甲酸二丁酯、无色天竺葵素。由该代谢产物制备的抑制物包括以质量比计，所述抑制物用于抑制桃根癌病菌。达到了较好的抑菌效果。由于放线菌是从桃树高发根癌病的土壤中筛选出的具有耐氰作用的菌株。因此本发明主要作用于引起桃树根癌病的根癌弄杆菌有效。
【专利说明】放线菌的代谢产物及其制备的抑制物
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物领域，具体而言，涉及一种放线菌的代谢产物及其制备的抑制物。【背景技术】
[0002]桃树根癌病(亦称冠瘿病)是一种世界范围的植物细菌肿瘤病害，是根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)通过自然转基因方式引发的基因病害。桃树根癌病在我国江苏、浙江、福建及上海郊区普遍发生，北京南口农场桃树根癌病发病率为58.2%-100%。桃树染病后在根及根茎部形成大小不等的肿瘤，影响根部的水分和养料吸收，病株常表现为叶黄、势弱，使果实产量和品质下降，严重的甚至毁园、绝收。
[0003]目前桃树根癌病在生产上主要以化学农药和抗菌剂防治为主，虽有一定效果，但经长期实践证明，这种防治方法存在以下不足:长期使用会造成土壤污染，产品不安全，不利于环保，不利于消费者健康。
[0004]另外，采用了生物防治的方法，比如:1972年Kerr从土壤杆菌中分离得到的放射土壤杆菌K84菌株，对核果类果树及其近源花卉的根癌病具有良好防效，但只对根癌土壤杆菌的生化I型和II型病菌具有防效，对根瘤菌的生化III型病菌无效。。近年来我国报道分离出的放射土壤杆菌HLB-2、E26和Ml 15对葡萄根癌病菌有明显抑制作用，经大田试验防效为85%-100%。2004年王关林等筛选出高产细菌素的菌株WJK84-1和其产生的细菌素均对樱桃冠瘿瘤病原菌C58有明显的抑制作用，抑瘤率达到83.4%左右。这些防治方法防治效果好，但是，由于桃树根 系分泌一种物质即扁桃甙(氰的配糖体)，在微生物的作用下分解为苯甲醛和氢氰酸(HCN)，桃根围这些有毒物质会致使一些微生物死亡。利用上述生物防治方式并不适用。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种放线菌的代谢产物及其制备的抑制物，以解决上述的问题。
[0006]在本发明的实施例中提供了一种放线菌的代谢产物，所述代谢产物包括:糖基多肽、邻苯二甲酸二丁酯、无色天竺葵素；
[0007]所述放线菌为从桃树根癌病的土壤中筛选出的菌株。
[0008]优选的，所述糖基多肽的提取方法包括:
[0009]将放线菌置于高氏液体培养基中进行培养得到第一放线菌菌株发酵液；
[0010]将所述第一放线菌菌株发酵液进行离心分离得第一上清液；
[0011 ] 将所述第一上清液通过无菌滤膜过滤；
[0012]在滤液中加入(NH4)2SO4至60%饱和度，静置，离心得沉淀；
[0013]将所述沉淀用截流分子量为8000-14000道尔顿的透析袋在0.lmol/L磷酸缓冲液中透析过夜，离心，得上清粗提物；所述磷酸缓冲液的pH值优选为7 ；
[0014]将所述上清粗提物进行高效液相色谱分离提纯；[0015]对高效液相色谱分离提纯后的产物进行中压制备色谱分离提纯；
[0016]收集中压制备色谱分离提纯后的产物冷冻干燥得到所述糖基多肽。
[0017]优选的，所述高效液相色谱分离提纯包括:
[0018]所述上清粗提物经0.22微米微孔滤膜过滤；流动相:以体积比，乙腈:水为3:7 ；色谱柱为zorboxXDB-C18，其管径为4.6毫米，柱长为150毫米，填充物粒径为5微米；268纳米的紫外线检测；柱温为25°C，流速为1.0毫升.mirT1，进样量为10微升。
[0019]优选的，所述中压制备色谱分离纯化包括:
[0020]质谱柱为zorboxXDB-C18，其管径为4.6纳米，柱长为250纳米，填充物粒径为20微米，流动相:体积比，乙腈:水=3:7，268纳米的紫外线检测，柱温25°C，流速为10毫升.min \进样量为200微升。
[0021]优选的，所述高氏液体培养基每升包括:可溶性淀粉20g，KNO3Ig, K2HPO40.5g，NaCl0.5g, MgSO40.5g, FeSO40.01g,琼脂 20g, pH 值 7.2 ~7.4 ;
[0022]优选的，所述放线菌在高氏液体培养基中培养的条件为:培养温度为28°C，180转/分钟的震荡条件，培养时间为8天；
[0023]和/ 或，
[0024]优选的，在对所述第一放线菌菌株发酵液进行离心分离时采用的离心速度为10000转/分钟，离心时间优选为15分钟。
[0025]优选的，所述糖基多肽的检测方法为:`[0026]提纯后的糖基多肽用少量基质溶解得到水溶物，取0.5微升所述水溶物于基质辅助激光解吸电离MALDI目标板上，风干所述目标板，风干后置于MALD1-T0FMS中检测，得到一级质谱图后，进行二级质谱检测。经过MALD1-T0FMS检测后的三个主要质量纹，进行MALD1-T0FMS/MS 二次激光检测，并对其显示的二级质量纹图谱，确定其为糖基多肽；所述基质为以体积比计，乙腈--水为3:7。
[0027]优选的，所述邻苯二甲酸二丁酯和所述无色天竺葵素的提取方法包括:
[0028]将放线菌置于高氏I号液体培养基中进行培养得到第二放线菌菌株发酵液；
[0029]将所述第二放线菌菌株发酵液过滤滤除放线菌菌体和发酵残渣，得到第二上清液；
[0030]向所述第二上清液中加入固体硫酸铵，离心并收集离心上清液；
[0031]用乙酸乙酯对所述离心上清液进行一次以上的萃取，合并萃取液；
[0032]将合并后的所述萃取液进行减压浓缩得到粗提物；
[0033]采用S印hadex LH_20柱层析对所述粗提物进行分离得到分离产物；
[0034]将所述分离产物进行减压浓缩，以根癌土壤杆菌为指示菌，采用K-B滤纸片法测定各组分抑菌活性，挑选抑菌活性组分；
[0035]将所述抑菌活性组分进行高效液相色谱分离确定出峰保留时间；
[0036]将经过高效液相色谱分离后的产物进行中压制备色谱分离纯化；
[0037]对中压制备色谱分离纯化后的产物进行减压浓缩，得到邻苯二甲酸二丁酯和无色
天竺葵素。
[0038]优选的,采用Sephadex LH-20柱层析包括:`[0039]用分段洗脱法，洗脱梯度水(体积):甲醇(体积)依次为7:3，5:5，3:7，1:9;[0040]每个梯度I倍体积洗脱液，流速控制在0.8-1.0mL/min ；
[0041]用核酸蛋白检测仪在254纳米下监测，并根据出峰情况分部收集得到分离产物。
[0042]优选的，所述高效液相色谱分离包括:
[0043]将抑菌活性组分经0.22 μ m微孔滤膜过滤，流动相:甲醇和水，梯度洗脱:O-1Omin, 30% 甲醇;10_20min, 30%_60% 甲醇；20_30min，60% ~80% 甲醇；30-40min, 80%-90%甲醇；40-50min, 90%-50%甲醇；254nm紫外检测；柱温25 °C，色谱柱为ZORBAXEclipseXDB-C18，其管径为4.6毫米，柱长为150毫米，填充物粒径为5微米；流速为1.0毫升.π?η-1，进样量为10微升。 [0044]优选的，所述中压制备色谱分离纯化包括:
[0045]取活性较强组分0.5克，用乙腈的体积:水的体积为3:7的流动相溶解，制成浓度为500毫克/毫升的待测样品，将I毫升的待测样品经0.22微米微孔滤膜过滤，200微升的进样量，色谱柱为Waters C0SM0SIL5C18-MS-1I，其管径为20毫米，柱长为250毫米，流速为
10毫升/分钟。
[0046]在一些实施例中，本发明提供了上述任一项所述的放线菌的代谢产物制备的抑制物，包括:以质量比计，糖基多肽:邻苯二甲酸二丁酯:无色天竺葵素为1:1:1 ;所述抑制物用于抑制根癌病菌。
[0047]本发明上述实施例提供的放线菌的代谢产物包括:糖基多肽、邻苯二甲酸二丁酯、无色天竺葵素。由该代谢产物制备的抑制物包括以质量比计，糖基多肽:邻苯二甲酸二丁酯:无色天竺葵素为1:1:1;所述抑制物用于抑制桃根癌病菌。达到了较好的抑菌效果。由于放线菌是从桃树高发根癌病的土壤中筛选出的具有耐氰作用的菌株。因此该放线菌的代谢产物主要作用于引起桃树根癌病的根癌弄杆菌有效。
【专利附图】
【附图说明】
[0048]图1示出了糖基多肽(al)、邻苯二甲酸二丁酯(a2)、无色天竺葵素(a5)、抑制物(a3 )、硫酸铵(a4)、乙酸乙酯(a6 )的抑制效果示意图。
【具体实施方式】
[0049]下面通过具体的实施例子并结合附图对本发明做进一步的详细描述。
[0050]在本发明的实施例中提供了一种放线菌的代谢产物，所述代谢产物包括:糖基多肽、邻苯二甲酸二丁酯、无色天竺葵素；所述放线菌为从桃树根癌病的土壤中筛选出的菌株。
[0051]在一些实施例中，本发明提供了上述任一项所述的放线菌的代谢产物制备的抑制物，包括:以质量比计，糖基多肽:邻苯二甲酸二丁酯:无色天竺葵素为1:1:1;所述抑制物用于抑制根癌病菌。
[0052]本发明上述实施例提供的放线菌的代谢产物包括:糖基多肽、邻苯二甲酸二丁酯、无色天竺葵素。由该代谢产物制备的抑制物包括以质量比计，糖基多肽:邻苯二甲酸二丁酯:无色天竺葵素为1:1:1 ;所述抑制物用于抑制根癌病菌。达到了较好的抑菌效果。
[0053]接下来通过一些实施例来详细描述该代谢产物的制备方法:
[0054]糖基多肽的提取方法:[0055]放线菌G-19在高氏液体培养基中，高氏液体培养基每升包括:可溶性淀粉20g，KN031g, K2HP040.5g, NaCl0.5g, MgS040.5g, FeS040.01g，琼脂 20g, pH 值 7.2 ~7.4 ;，在28°C, 180r/min的条件下震荡培养8天,放线菌菌株发酵液离心(lOOOOr/min, 15min),得上清液，无菌滤膜过滤，加入(NH4) 2S04至60%饱和度,静置2h, 10000r/min离心IOmin,取沉淀，用截流分子量为8000-14000道尔顿的透析袋在0.lmol/L磷酸缓冲液(pH7.0)中透析过夜，离心10000r/min低温离心IOmin,弃不溶物,得上清粗提物。
[0056]可溶性淀粉为白色或类白色粉末，系玉米淀粉改性而成。
[0057]将上清粗提物分别经过高效液相色谱仪和中压制备色谱仪进行分离纯化。
[0058]高效液相色谱:样品经0.22 μ m微孔滤膜过滤,流动相:乙腈:水(v:v,即体积比)=3:7,色谱柱为zorboxXDB-C18(4.6mmX 150mm, 5 μ m即:管径为4.6毫米，柱长为150毫米，填充物粒径为5微米)；268nm紫外检测，柱温25°C，流速为1.0mL.mirT1，进样量为10 μ L。
[0059]中压制备色谱:质谱柱为zorboxXDB_C18 (4.6_X 250mm, 20 μ m,即管径为4.6纳米，柱长为250纳米,填充物粒径为20微米),流动相:乙腈:水(V: V) =3:7, 268nm紫外检测，柱温25°C，流速为IOmL.mirT1，进样量为200 μ L0
[0060]经制备色谱后，收集冷冻干燥为糖基多肽，其为粉状样品。
[0061]纯化后的样品用少量基质(乙腈:水(V:V)=3: 7溶解得到水溶物，取0.5uL该水溶物于 MALDI (matrix-assisted laser desorption ionisation)目标板上，风干所述目标板，等风干后置于MALD1-T0FMS中检测，得到一级质谱图后，进行二级质谱检测。经过MALD1-TOFMS检测后的三个主 要质量纹，进行MALD1-T0FMS/MS 二次激光检测，并对其显示的二级质量纹图谱，确定其为糖基多肽。对根癌病菌有较好的抑制效果见图1中的al (糖基多肽的抑制效果)。
[0062]邻苯二甲酸二丁酯、无色天竺葵素的提纯是混合在一起提纯，提纯方法为:
[0063]将放线菌菌株G-19接种到高氏I号液体培养基中，28° C摇床(转速为120r/min)培养7天后，滤除菌体和发酵残渣，取上清液加不用饱和度的固体硫酸铵，去掉蛋白部分，静置12小时后，4° C、12000r/min离心lOmin，收集上清液部分。
[0064]上清液用等体积的乙酸乙酯取2次，合并萃取液，40° C减压浓缩至干，得抑菌物质粗提物。
[0065]抑菌物质粗提物采用SepHadex LH-20柱层析对抑菌粗提物进行分离。用分段洗脱法，洗脱梯度体积(水):体积(甲醇)依次为7: 3，5: 5，3: 7，1:9。每个梯度I倍体积洗脱液，流速控制在0.8-1.0mL/min。用核酸蛋白检测仪在254nm下监测,并根据出峰情况分部收集得到分离产物。
[0066]将分离产物减压浓缩后，以根癌土壤杆菌为指示菌，采用K-B滤纸片法测定各组分抑菌效果，抑菌活性组分活性较强部分(抑菌活性组分)作为下一步骤的起始样品进一步纯化。
[0067]将抑菌活性组分进行如下操作:所述高效液相色谱分离包括:将抑菌活性组分经0.22 μ m微孔滤膜过滤，流动相:甲醇和水，梯度洗脱:0-10min，30%甲醇；10_20min，30%-60% 甲醇；20-30min，60% ~80% 甲醇；30_40min，80%_90% 甲醇；40_50min，90%_50% 甲醇；254nm紫外检测；柱温25°C，色谱柱为ZORBAX Eclipse XDB-C18，其管径为4.6毫米，柱长为150毫米，填充物粒径为5微米；流速为1.0毫升.min-1，进样量为10微升；[0068]高效液相色谱能够确定样品准确的出峰保留时间。
[0069]经过高效液相色谱分离后的产物进行如下操作:所述中压制备色谱分离纯化包括:取活性较强组分0.5克，用乙腈的体积:水的体积为3:7的流动相溶解，制成浓度为500毫克/毫升的待测样品，将I毫升的待测样品经0.22微米微孔滤膜过滤，200微升的进样量，色谱柱为Waters C0SM0SIL5C18-MS-1I，其管径为20毫米，柱长为250毫米，流速为10毫升/分钟。中压制备色谱处理能够达到富集效果。
[0070]对中压制备色谱分离纯化后的产物进行减压浓缩，得到邻苯二甲酸二丁酯和无色天竺葵素。邻苯二甲酸二丁酯和无色天竺葵素检测方法为:采用液质联用(LC-MS)和核磁共振(NMR)对所得纯品进行结构测定，得到两种化合物。对根癌病菌的抑制效果见图l，a2(邻苯二甲酸二丁酯的抑制效果)和a5 (无色天竺葵素的抑制效果)。
[0071]将上述代谢产物进行混合配比后制备抑制物，制备添加比例为:以质量比计，糖基多肽:邻苯二甲酸二丁酯:无色天竺葵素为1:1:1;所述抑制物用于抑制根癌病菌，其对根癌病菌的抑制效果见图la3 (糖基多肽:邻苯二甲酸二丁酯:无色天竺葵素按1:1:1制备的抑制物的抑制效果)。
[0072]由于在上述的各种处理步骤中涉及到了硫酸铵和乙酸乙酯，为了排除硫酸铵、乙酸乙酯的抑菌可能性，也对这种中物质进行了抑菌检测，如图1的a4、a6，其中a4为硫酸铵的抑制效果，a6为乙酸乙酯的抑制效果。
[0073]以上所述仅为本发明的 优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种放线菌的代谢产物，其特征在于， 所述代谢产物包括:糖基多肽、邻苯二甲酸二丁酯、无色天竺葵素； 所述放线菌为从桃树根癌病的土壤中筛选出的菌株。
2.如权利要求1所述的代谢产物，其特征在于， 所述糖基多肽的提取方法包括: 将放线菌置于高氏液体培养基中进行培养得到第一放线菌菌株发酵液； 将所述第一放线菌菌株发酵液进行离心分离得第一上清液； 将所述第一 上清液通过无菌滤膜过滤； 在滤液中加入(NH4) 2S04至60%饱和度，静置，离心得沉淀； 将所述沉淀用截流分子量为8000-14000道尔顿的透析袋在0.lmol/L磷酸缓冲液中透析过夜，离心，得上清粗提物；所述磷酸缓冲液的PH值优选为7 ； 将所述上清粗提物进行高效液相色谱分离提纯； 对高效液相色谱分离提纯后的产物进行中压制备色谱分离提纯； 收集中压制备色谱分离提纯后的产物冷冻干燥得到所述糖基多肽。
3.如权利要求2所述的代谢产物，其特征在于， 所述高效液相色谱分离提纯包括: 所述上清粗提物经0.22微米微孔滤膜过滤；流动相:以体积比，乙腈:水为3:7 ;色谱柱为zorboxXDB-C18，其管径为4.6毫米，柱长为150毫米，填充物粒径为5微米；268纳米的紫外线检测；柱温为25°C，流速为1.0毫升.mirT1，进样量为10微升。
4.如权利要求2所述的代谢产物，其特征在于， 所述中压制备色谱分离纯化包括: 质谱柱为zorboxXDB-C18，其管径为4.6纳米，柱长为250纳米，填充物粒径为20微米，流动相:体积比，乙腈:水=3:7,268纳米的紫外线检测，柱温25°C，流速为10毫升.mirT1,进样量为200微升。
5.如权利要求2所述的代谢产物，其特征在于， 所述高氏液体培养基每升包括:可溶性淀粉20g, KNO3Ig, K2HPO40.5g，NaCl0.5g，MgSO40.5g，FeSO40.01g,琼脂 20g, pH 值 7.2 ~7.4 ;和 / 或， 所述放线菌在高氏液体培养基中培养的条件为:培养温度为28°C，180转/分钟的震荡条件，培养时间为8天； 和/或， 在对所述第一放线菌菌株发酵液进行离心分离时采用的离心速度为10000转/分钟，离心时间优选为15分钟。
6.如权利要求1所述的代谢产物，其特征在于， 所述糖基多肽的检测方法为: 提纯后的糖基多肽用少量基质溶解得到水溶物，取0.5微升所述水溶物于基质辅助激光解吸电离MALDI目标板上，风干所述目标板，风干后置于MALD1-T0FMS中检测，得到一级质谱图后，进行二级质谱检测，经过MALD1-T0FMS检测后的三个主要质量纹，进行MALD1-T0FMS/MS 二次激光检测，并对其显示的二级质量纹图谱，确定其为糖基多肽； 所述基质为以体积比计，乙腈:水为3:7。
7.如权利要求1所述的代谢产物，其特征在于， 所述邻苯二甲酸二丁酯和所述无色天竺葵素的提取方法包括: 将放线菌置于高氏I号液体培养基中进行培养得到第二放线菌菌株发酵液； 将所述第二放线菌菌株发酵液过滤滤除放线菌菌体和发酵残渣，得到第二上清液； 向所述第二上清液中加入固体硫酸铵，离心并收集离心上清液； 用乙酸乙酯对所述离心上清液进行一次以上的萃取，合并萃取液； 将合并后的所述萃取液进行减压浓缩得到粗提物； 采用Sephadex LH-20柱层析对所述粗提物进行分离得到分离产物； 将所述分离产物进行减压浓缩，以根癌土壤杆菌为指示菌，采用K-B滤纸片法测定各组分抑菌活性，挑选抑菌活性组分； 将所述抑菌活性组分进行高效液相色谱分离确定出峰保留时间； 将经过高效液相色谱分离后的产物进行中压制备色谱分离纯化； 对中压制备色谱分离纯化后的产物进行减压浓缩，得到邻苯二甲酸二丁酯和无色天竺葵素。
8.如权利要求7所述的代谢产物，其特征在于， 采用Sephadex LH-20柱层析包括: 用分段洗脱法，洗脱梯度水(体积):甲醇(体积)依次为7: 3，5: 5，3: 7，1:9 ; 每个梯度I倍体积洗脱液，流速控制在0.8-1.0mL/min ； 用核酸蛋白检测仪在254纳米下监测，并根据出峰情况分部收集得到分离产物。
9.如权利要求7所述的代谢产物，其特征在于， 所述高效液相色谱分离包括:将抑菌活性组分经0.22 μ m微孔滤膜过滤，流动相:甲醇和水，梯度洗脱:0-10min,30% 甲醇;10_20min，30%_60% 甲醇；20_30min，60% ~80% 甲醇；30-40min,80%-90% 甲醇；40_50min，90%_50% 甲醇；254nm 紫外检测；柱温 25°C，色谱柱为ZORBAX Eclipse XDB-C18，其管径为4.6毫米，柱长为150毫米，填充物粒径为5微米；流速为1.0毫升.min \进样量为10微升； 和/或， 所述中压制备色谱分离纯化包括:取活性较强组分0.5克，用乙腈的体积:水的体积为3:7的流动相溶解，制成浓度为500毫克/毫升的待测样品，将I毫升的待测样品经0.22微米微孔滤膜过滤，200微升的进样量，色谱柱为Waters COSMOSIL5C18-MS-1I，其管径为20晕米，柱长为250晕米，流速为10毫升/分钟。`
10.一种由权利要求1-9任一项所述的放线菌的代谢产物制备的抑制物，其特征在于， 包括:以质量比计，糖基多肽:邻苯二甲酸二丁酯:无色天竺葵素为1:1:1 ; 所述抑制物用于抑制桃根癌病菌。
【文档编号】C07D311/62GK103614438SQ201310157227
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年4月28日 优先权日:2013年4月28日
【发明者】刘志民, 马焕普, 季敬霖, 候柄竹, 王树芳 申请人:北京农学院