北极海洋红球菌B7740产类异戊二烯的结构鉴定方法与流程

本发明属于红球菌b7740产类异戊二烯分析的技术领域，具体涉及北极海洋红球菌b7740产类异戊二烯的结构鉴定方法。

背景技术：

红球菌属是一类广泛分布于自然界的革兰氏阳性菌，在土壤、海底沉积物和食草动物粪便中含量丰富，且多数为营腐生生活。红球菌属(rhodococcussp.)是在1891年由zoof建立的，从建立至今，分类地位一直不确定。目前，红球菌归属于放线菌门(actinobacteria)，放线菌纲(actinobacteria)，放线菌亚纲(actinobacteridae)，放线菌目(actinomycetales)，棒杆菌亚目(croynebacterineae)，诺卡氏菌科(nocardiaceae)，红球菌属(rhodococcus)。

目前，国内外对红平红球菌的研究较多，主要集中在其生物降解能力研究和分子学研究，而对红球菌产类异戊二烯物质研究较少，尤其对极地海洋来源的红球菌所产类异戊二烯物质的鉴定与研究尚十分匮乏，红球菌b7740是我国北极科考队于第三次北极科考时从b77站点20米的表层海水中发现，对于该菌所产物质的研究与传统类异戊二烯物质的鉴定有所不同。常见高等植物来源的类胡萝卜素按照含氧和不含氧分为两类，作为动植物生长必需的色素，目前已鉴定出来的约有750种，其中来自于海洋的约有250种，40种出现在人类膳食之中。红球菌b7740所产类胡萝卜素因该微生物独特的代谢通路，与常见高等植物来源类胡萝卜素相比，结构相差较大，结构种类不单一，其独特的结构不仅赋予了它独特的活性，也增大了鉴定其分子结构的难度。

技术实现要素：

为解决上述现有技术存在的问题，本发明提供了北极海洋红球菌b7740产类异戊二烯的结构鉴定方法，该鉴定方法操作方便快捷，结果可靠、稳定。

实现本发明上述目的所采用的技术方案为：

北极海洋红球菌b7740产类异戊二烯的结构鉴定方法，采用液质联用法对北极海洋红球菌b7740产类异戊二烯进行初步鉴定。

北极海洋红球菌b7740产类异戊二烯的结构鉴定方法，包括如下步骤：

1、类异戊二烯待测样品的配制：

将类异戊二烯提取液加入8-10wt％的氯化钠溶液中，类异戊二烯提取液与氯化钠溶液的体积比为1:1，混合均匀，得混合液，将混合液在3-8℃离心分层，取下层有色层，将有色层干燥，再用甲醇与甲基叔丁基醚体积比为1:1的混合溶剂复溶，并用微孔滤膜过滤，得到类异戊二烯待测样品；

2、类异戊二烯待测样品的检测：

采用液质联用仪对类异戊二烯待测样品进行检测：

2.1、液相色谱条件：

色谱柱ymcc30，柱温25℃，紫外吸收检测器，检测波长450nm和242nm；

流动相：流动相a为甲醇，流动相b为甲基叔丁基醚，流速：1ml/min；

洗脱程序：

第一阶段：采用流动相a和流动相b的混合液洗脱30分钟，其中流动相a的体积百分含量由95％变为70％，流动相b的体积百分含量由5％变为30％；

第二阶段：采用流动相a和流动相b的混合液洗脱20分钟，其中流动相a的体积百分含量由70％变为50％，流动相b的体积百分含量由30％变为50％；

第三阶段：采用流动相a和流动相b的混合液洗脱10分钟，其中流动相a的体积百分含量由50％变为95％，流动相b的体积百分含量由50％变为5％；

2.2、质谱条件：

apci离子源，正离子模式，离子源温度300℃，毛细管电压350v，电晕电压1v，干燥气流7l/min，雾化室温度350℃，雾化器压力10psi，质荷比扫描范围50-1200。

进一步，步骤2.1中，离心的转速为7000rpm，时间为10min。

进一步，步骤2.1中，微孔滤膜的孔径为0.22μm。

与现有技术相比，本发明的优点和有益效果在于：

1、类异戊二烯包括类异戊二烯醌与类胡萝卜素，是自然界中广泛存在的一类天然活性物质。目前，对于植物和部分海洋动物来源的类异戊二烯的研究逐渐完善，已达到广泛应用阶段，但微生物(特别是海洋微生物)作为类异戊二烯物质的巨大来源，尚未有广泛的报道与研究。红球菌b7740作为我国第三次北极科考首次发现的菌种，其所产类异戊二烯物质含量较高，种类丰富，需要我们用化学分析的方法对其进行结构的鉴定与主要产物的纯化。本发明所用agilent1100serieslc-msd-trap-xct初步鉴定方法，分析快速，结果可靠、稳定，适合作为分析红球菌b7740所产类胡萝卜素的初步鉴定方法。

2、本发明可初步鉴定出红球菌b7740产类异戊二烯物质中包含9种类胡萝卜素和14种类异戊二烯醌。

说明书附图

图1为北极海洋红球菌b7740产类异戊二烯物质在242nm处的液相图谱。

图2为北极海洋红球菌b7740产类异戊二烯物质在450nm处的液相图谱。

图3a为1号峰的紫外吸收图谱。

图3b为1号峰的二级质谱图谱。

图4a为11号峰的紫外吸收图谱。

图4b为11号峰的二级质谱图谱。

图5a为17号峰的紫外吸收图谱。

图5b为17号峰的二级质谱图谱。

图6a为20号峰的紫外吸收图谱。

图6b为20号峰的二级质谱图谱。

图7a为21号峰的紫外吸收图谱。

图7b为21号峰的二级质谱图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。

北极海洋红球菌b7740，是发明人于2008年7-9月中国第三次北极科学考察期间，用seabird911plusctd系统从北冰洋b77站点(146°49.28′w，76°58.08′n)25m深的表层海水样品中分离得到，宁波市微生物与环境工程重点实验室通过16srdna序列blast在线比对，判定该菌为红球菌属。

实施例1

北极海洋红球菌b7740产类异戊二烯的结构鉴定实验

1、实验材料

1.1、实验试剂

溶菌酶(20000u/mg)购自国药集团化学试剂有限公司，醋酸锌、氯化钠、甲醇和二氯甲烷购自国药集团化学试剂有限公司，色谱级甲醇购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，色谱级甲基叔丁基醚购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，β-胡萝卜素标准品(97％)购于美国sigma公司。

1.2、实验仪器

agilent1100serieslc-msd-trap-xct液质联用仪购自安捷伦公司；centrifuge5810r台式低温离心机购自德国eppendorf公司。

1.3、实验原料

按照中国专利(一种红球菌b7740类胡萝卜素的微胶囊制备方法、201510016005.8)公开的方法制备类异戊二烯提取液：

称取0.8g北极海洋红球菌b7740冻干菌粉(浙江万里学院提供)置于离心管中，加入16ml溶菌酶溶液(1mg/ml)，将离心管置于37℃水浴中，避光放置1h，然后加入24ml饱和醋酸锌溶液使已破壁的红球菌沉降，将该离心管于7000rpm、4℃下离心10min，丢弃上清液，再将64ml混合有机溶剂(甲醇：二氯甲烷＝4:1，体积比)加入到红球菌沉淀中，用玻璃棒搅拌均匀，离心，分离出上清液，继续向离心管中加入混合有机溶剂(甲醇：二氯甲烷＝4:1，体积比)，如此反复提取2-3次，合并上清液，得到类异戊二烯提取液。

2、实验方法

2.1、类异戊二烯待测样品的配制：

将60ml类异戊二烯提取液加入60ml10wt％氯化钠溶液中，混合均匀，得混合液，将混合液在7000rpm、4℃离心分层，取下层有色层，将有色层用氮气吹干，再用2ml甲醇与甲基叔丁基醚的混合溶剂(甲醇与甲基叔丁基醚的体积比为1:1)复溶，并用0.22μm微孔滤膜过滤，得到约1.5ml待测样品。

2.2、类异戊二烯待测样品的检测：

采用液质联用仪对类异戊二烯待测样品进行检测：

2.2.1、液相色谱条件：

色谱柱ymcc30(5um×4.6mm×150mm)，柱温25℃，紫外吸收检测器，检测波长450nm，进样量10ul；

流动相：流动相a为甲醇，b为甲基叔丁基醚；

洗脱程序：

第一阶段：采用流动相a和流动相b的混合液洗脱30分钟，其中流动相a的体积百分含量由95％变为70％，流动相b的体积百分含量由5％变为30％；

第二阶段：采用流动相a和流动相b的混合液洗脱20分钟，其中流动相a的体积百分含量由70％变为50％，流动相b的体积百分含量由30％变为50％；

第三阶段：采用流动相a和流动相b的混合液洗脱10分钟，其中流动相a的体积百分含量由50％变为95％，流动相b的体积百分含量由50％变为5％；

2.2.2、质谱条件：

apci离子源，正离子模式，离子源温度300℃，毛细管电压350v，电晕电压1v，干燥气流7l/min，雾化室温度350℃，雾化器压力10psi，质荷比扫描范围50-1200。

3、实验结果：

在检测波长242和450nm下，分别出现了两张液相色谱图，图1为242nm下红球菌b7740产类异戊二烯物质的液相色谱图谱，图2为450nm下红球菌b7740产类异戊二烯物质的液相色谱图谱，按照出峰顺序分别编号，图1中出现了10个峰，分别为1、2、3、4、5、6、9、11、13和15号峰，图2中出现了14个峰，分别为7、8、10、11、12、13、16、17、18、19、20、21、22和23号峰。

3.1、类异戊二烯醌的分析鉴定：

1号峰经分析，从图3a、图3b和表1中可以看出，其二级质谱图中有m/z＝197的特征碎片离子，其紫外特征吸收峰258nm处，且加氢分子离子峰m/z＝455，因此，判断1号峰为泛醌类物质uq4。

2、3号峰经分析，从表1中可以看出，其二级质谱图中都有m/z＝187(甲基萘醌)的特征碎片离子峰，它们的加氢分子离子峰m/z分别为717、649，同时紫外特征吸收峰都集中在242nm处，因此，判定2、3号峰分别为甲基萘醌mk8、mk7。

4、6、7和13号峰经分析，从表1中可以看出，其二级质谱图中都有m/z＝187(甲基萘醌)的特征碎片离子峰，与2号峰相比，其紫外特征吸收峰有所红移，分别为248nm、244nm、244nm、248nm，它们的氢分子离子峰m/z均为717，因此，判定4、6、7和13号峰均为2号峰的同分异构体，均为甲基萘醌mk8。

8号峰经分析，从表1中可以看出，其二级质谱图有m/z＝187(甲基萘醌)的特征碎片离子峰，与3号峰相比，其紫外特征吸收峰有所红移，为246nm，其氢分子离子峰m/z为649，因此，判定8号峰为3号峰的同分异构体，为甲基萘醌mk7。

5和11号峰经分析，从表1、图4a和图4b中可以看出，其二级质谱图都有m/z＝187(甲基萘醌)的特征碎片离子峰，与3号峰相比，其紫外特征吸收峰有所红移，分别为248nm、244nm，其加氢分子离子峰m/z分别增加了4、2da，分别为653、651，因此，我们推断其为mk7异戊二烯链上的加氢产物，分别为mk7(h4)、mk7(h2)。

9和15号峰经分析，从表1可以看出，其二级质谱图有m/z＝187(甲基萘醌)的特征碎片离子峰，与2号峰相比，其紫外特征吸收峰有所红移，分别为254nm、248nm，其加氢分子离子峰m/z分别增加了4、2da，推断其为mk8异戊二烯链上的加氢产物，mk8异戊二烯链上的加氢产物，分别为mk8(h4)、mk8(h2)。

14、18号峰从检测数据初步判定其也为类异戊二烯醌。

上述峰的液质联用仪检测数据如表1所示：

表1：红球菌b7740产类异戊二烯醌的出峰时间，紫外特征峰及质谱数据

由上述可知，1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、13、14、15和18号峰所对应的物质均为类异戊二烯醌。

3.2、类胡萝卜素的分析鉴定：

17号峰经分析，从表2、图5a、图5a可以看出，其二级质谱图都有m/z＝163(c10h12o2+h)的特征碎片离子峰，其紫外特征吸收峰分别在274nm、452nm、468nm处，其加氢离子峰m/z＝589，因此，判定17号峰为all-trans-synechoxanthin(χ,χ-caroten-18,18'-dioicacid)。

10、12号峰经分析，从表2可以看出，其二级质谱碎片与17号峰一致，因其紫外吸收图谱中含有在340左右的顺式结构特征吸收峰，判断其为cis-synechoxanthin。

19号峰经分析，具体数据见表2，将19号峰与β-胡萝卜素标准品的紫外吸收图谱、液相图谱和二级质谱图进行对比，发现两者的图谱基本保持一致，因此，判定19号峰为β-胡萝卜素。

16号峰经分析，从表2可以看出，其二级质谱碎片与19号峰一致，因其紫外吸收图谱中含有在340左右的顺式结构特征吸收峰，判断其为cis-β-carotene。

20号峰经分析，从表2、图6a、图6a可以看出，其二级质谱图有m/z＝413[m+h-c9h12]的特征碎片离子峰，紫外特征吸收峰在460nm处，加氢分子离子峰m/z＝533，因此，判定20号峰为chlorobactene(φ，ψ-carotene)。

21号峰经分析，从表2、图7a、图7a可以看出，其二级质谱图有m/z＝409[m+h-c9h12]的特征碎片离子峰，紫外可见特征吸收峰在282nm、452nm、476nm处，加氢分子离子峰为m/z＝529，因此，判定21号峰为isorenieratene(φ，φ-carotene)。

22、23号峰从检测数据初步判定其也为类胡萝卜素。

上述峰的液质联用仪检测数据如表2所示：

由上述可知，10、12、16、17、19、21、22、23号峰所对应的物质均为类胡萝卜素。