异戊二烯合成酶基因及其应用
【专利摘要】本发明涉及一种异戊二烯合成酶基因及其应用，其解决了利用工程菌合成异戊二烯效率不高的技术问题，本发明提供了一种异戊二烯合成酶基因、其表达的蛋白质、含有异戊二烯合成酶基因的原核表达载体及工程菌以及产异戊二烯工程菌的制备方法及应用。本发明可广泛用于异戊二烯制备领域。
【专利说明】
异戊二烯合成酶基因及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种异戊二烯合成酶基因及其应用。
【背景技术】
[0002] 自然界中，异戊二烯主要是由某些植物叶片排放至大气中的，而工业生产中，目 前异戊二烯主要是由石油裂解物C5馏分萃取蒸馏而来。然而随着石油资源日益枯竭及不 可再生，天然植物释放的异戊二烯收集又事倍功半，通过微生物工程菌生产异戊二烯成为 一种可持续发展的必然趋势。
[0003] 据报道，每年植物释放到大气中的异戊二烯达到5百万吨，细菌自身又不具有异 戊二烯合成酶基因，因此植物是异戊二烯合成酶（ISPS)很好来源。利用基因工程技术开展 异戊二烯合成酶基因研究已取得了一些进展，研究人员分离鉴定得到了少量的异戊二烯合 成酶基因，但国内尚未有这方面的报道。
[0004] 2000年，Miller B首次在杨树（白杨X颤杨）中获得了全长IspS基因，并 且在大肠杆菌中得到了 7.7nmol/mgDCW的异戊二烯（Miller B et al.Planta.2001 213(3):483-7) ;2005 年，Sasaki 克隆得到了白杨的 IspS 基因 （Sasaki K et al.FEBS Lett. 2005 579(11) :2514-8) ;Thomas D. Sharkey 于 2005 年克隆得到蒙大拿葛 IspS cDNA 全长（Sharkey TD et al. Plant Physiol. 2005 137 (2) :700-12.),随后又扩充了数个杨柳 科IspS基因，并且得到了刺槐的IspS cDNA全长序列（Sharkey TD et al, Evolution 2013 67(4):1026-1040)。
[0005] 可见国内外目前获得的异戊二烯合成酶大多限于杨柳科和豆科植物，豆科植物关 于异戊二烯合成酶基因的研究主要集中在葛根、刺槐上，杨柳科的相关研究主要集中在杨 属，而在壳斗科辽东栎中并无研究报道，基因库中也没有辽东栎异戊二烯合成酶基因。
【发明内容】
[0006] 本发明就是为了解决利用工程菌合成异戊二烯效率不高的技术问题，提供一种具 有较高合成效率的异戊二烯合成酶基因及应用。
[0007] 为达到上述目的，一种异戊二烯合成酶基因，其是如下（a)或（b)的基因：（a)所 述基因 cDNA的核昔酸序列如序列表的序列1所7K ; (b)所述基因是编码如下蛋白质的基 因：序列表的序列2所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有 异戊二烯合成酶活性的由序列表的序列2所示氨基酸序列组成的蛋白质衍生的蛋白质。
[0008] 本发明同时提供一种异戊二烯合成酶基因表达的蛋白质，其是如下（a)或（b)的 蛋白质：(a)由序列表的序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)在（a)中的氨基酸序 列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有异戊二烯合成酶活性的由（a)衍生的 蛋白质；序列表的序列2所7K的氨·基酸序列组成的蛋白质是由序列表的序列1所不喊基序 列编码。
[0009] 本发明还提供一种异戊二烯合成酶基因的原核表达载体。
[0010] 本发明还提供异戊二烯合成酶基因原核表达载体的产异戊二烯工程菌。
[0011] 本发明同时提供产异戊二烯工程菌在制备异戊二烯中的应用。
[0012] 本发明的有益效果：根据植物在自然界异戊二烯的释放速率，本发明选择了释放 量较高的辽东栎异戊二烯合成酶基因进行了分离鉴定和克隆，成功构建异戊二烯生产菌 株，为生物法生产异戊二烯寻找到一个高效的异戊二烯合成酶。本发明利用基因工程手段， 克隆得到了辽东栎基因 Qllsps，应用到大肠杆菌中，使用气相色谱进行检测，大肠杆菌具备 生产异戊二烯的能力，本发明对于使用微生物进行异戊二烯大规模工业生产提供了一个高 效有效的酶。
【附图说明】
[0013] 图1是辽东栎总RNA的琼脂糖电泳结果；
[0014] 图2是辽东栎QlIspS基因3' -RACE的琼脂糖电泳结果；
[0015] 图3是辽东栎QlIspS基因5' -RACE的琼脂糖电泳结果；
[0016] 图4是辽东栎QLISPS氨基酸序列BlastP分析结果图；
[0017] 图5是RACE原理图；
[0018] 图6是辽东栎QLISPS蛋白在大肠杆菌中表达的SDS-PAGE结果；
[0019] 图7是异戊二烯标准品的气相色谱结果；
[0020] 图8是辽东栎QlIspS基因在大肠杆菌中应用的气相检测结果；
[0021] 图9是辽东栎QLISPS蛋白经过取代突变之后在大肠杆菌中应用的气相检测结 果；
[0022] 图10是辽东栎QLISPS蛋白经过添加突变之后在大肠杆菌中应用的气相检测结 果；
[0023] 图11是辽东栎QLISPS蛋白经过缺失突变之后在大肠杆菌中应用的气相检测结 果。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为 常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0025] 下述实施例中，大肠杆菌 BW25113 (Baba T et al. Mol Syst Biol. 2006 ; 2:2006. 0008.)是一株非病原菌，遗传背景清楚，世代时间短、容易培养且培养基原料低廉。 大肠杆菌BW25113公众可从中国科学院微生物研究所获得，以上所述生物材料只为重复本 发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
[0026] 实施例 1 :RACE_Ready cDNA 的制备
[0027] L提取辽东栎叶片总RNA
[0028] 采集辽东栎叶片，使用RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen公司）提取杨树叶片总 RNA，按照试剂盒说明方法进行，进行电泳（图1)验证RNA提取质量，可见RNA完整性良好， 可以进行后续实验。
[0029] 2. RACE-Ready cDNA 的制备
[0030] 获得 cDNA 全长的方法为 SMARTer-RACE，使用 SMARTer? PCR cDNA Synthesis Kit (Clontech公司）进行，以下使用的引物及试剂除GSP均为SMARTer? PCR cDNA Synthesis Kit内提供，按照试剂盒说明方法进行。
[0031] RACE-Ready cDNA第一链的反转录体系如下：
[0032]
[0033] 3.基因特异性引物的设计：
[0034] 根据杨柳科及豆科植物的已知氨基酸序列的保守区，参考所有已知IspS的核酸 序列及单萜合成酶的核酸序列，并且参考本发明人获得的夏橡IspS序列设计基因特异性 引物（GSP)，RACE_Ready cDNA 做模版，GSP 及通用引物（Universal Primer Mix，UPM)做引 物进行扩增，可以得到3'-RACE cDNA片段及5' -RACE cDNA片段。引物位置如图5所示， 中间黑色部分为简并PCR获得序列，两侧黑色部分为通用引物序列，白色部分为需要得到 的未知序列部分。
[0035] 共10个GSP序列，如下表：
[0036]
[0037] 实施例2 :QlIspS基因编码区全长的获得
[0038] 1. 3' -RACE cDNA末端序列的获得
[0039] 使用辽东栎的3' -RACE-Ready cDNA为模版，UPM与GSP为引物进行扩增
[0040] 反应体系：
[0041]
[0043] 反应条件：
[0044]
[0045] 3' -RACE的琼脂糖凝胶检测结果如图（图2):
[0046] 得到一个单一明亮的辽东栎DNA扩增条带，连接T载体，转化感受态细胞，挑选阳 性克隆Sanger测序，得到3'端cDNA序列。
[0047] 2. 5' -RACE cDNA末端序列的获得
[0048] 使用辽东栎的5' -RACE-Ready cDNA为模版，UPM与GSP为引物进行扩增.
[0049] 反应体系：
[0052] 反应条件：
[0053]
[0054] 5' -RACE的琼脂糖凝胶检测结果如图（图3):
[0055] 由图可见得到单一明亮的扩增条带，选择其一连接T载体，转化感受态细胞，挑选 阳性克隆Sanger测序，得到5'端cDNA序列。
[0056] 3.全长序列的获得
[0057] 根据3' -RACE及5' -RACE测序结果，进行序列比对，得到该基因 cDNA全长序列 (SEQ ID No. 1所示序列），对DNA、氨基酸序列进行分析：该基因有1761bp，编码586个氨基 酸，有ATG起始密码子和TGA终止密码子，说明该基因的完整性；其编码的氨基酸含有一个 IspS高度保守标签序列DDXXD区域，同时也包含了 RRX8W保守区域。利用BLAST软件在NCBI 中进行同源比对，结果如图4,显示该基因为Isoprenoid_Biosyn_Clsuperfamily成员，与 葡萄（Vitis vinifera)异戊二烯合成酶同源性达到59%;与川桑（Morus notabilis)的异 戊二烯合成酶有61%同源性，与棉豆（Phaseolus lunatus)的β罗勒烯合成酶有58%的 同源性，说明我们得到的是异戊二烯合成酶基因，简写为QlIspS基因，得到了编码QLISPS 蛋白的氨基酸序列（SEQ ID No. 2所示序列）。
[0058] 实施例3 :大肠杆菌异戊二烯生产菌株的构建
[0059] 全长引物QLFa及QLRa序列如下：
[0060] QLFa :5'AATTAACCATGGCGAGCAAACAAGTGCTTTCTA 3'
[0061] QLRa :5'ATATGGTACCCTAAAGGTGGATCTGGCTGTG 3'
[0062] 1.大肠杆菌表达载体pBAD-QlIspS构建
[0063] 将使用引物QLFa及QLRa获得的QlIspS基因片段进行Ncol和Kpnl (TAKARA公 司）双酶切，并将pBAD-HisB表达载体（购自Invitrogen公司）进行Ncol和ΚρηΙ双酶 切，QlIspS基因连接至pBAD-HisB载体后转化至trans5 α感受态细胞，选取阳性克隆进行 测序，pBAD-QlIspS的核苷酸序列是SEQ ID Νο·5。
[0064] 2.异戊二烯生产菌株MV/pQlIspS的构建
[0065] 将构建好的pBAD-QlIspS与质粒pi及p2共转化至BW25113宿主得到异戊二烯生 产菌株 MV/pQlIspS。
[0066] 并且构建对照菌株MV/pBAD，方法为将pBAD-HisB与质粒pi及p2共转至BW25113 宿主，得到无异戊二烯合成酶基因的对照菌株MV/pBAD。
[0067] 上述异戊二烯生产菌的构建方法中，pl，p2包含异戊二烯合成途径-甲羟戊酸 (MVA)途径基因。其中pi由MvaE (乙酰辅酶A乙酰转移酶）基因、MvaS(HMG-乙酰辅酶A 合成酶）基因及MVK(甲羟戊酸激酶）基因组成，所述MvaE基因编码由SEQ ID No. 8所示的 氣基酸序列组成的蛋白质；所述MvaS基因编码由SEQ ID No. 9所不的氣基酸序列组成的蛋 白质；所述MVK基因编码由SEQ ID No. 10所示的氨基酸序列组成的蛋白质。p2由PMK(磷 酸甲羟戊酸激酶）基因、MVD(焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶）基因及idi (异戊二烯焦磷酸异构 酶）基因组成，所述PMK基因编码由SEQ ID No. 11所不的氨1基酸序列组成的蛋白质；所述 MVD基因编码由SEQ ID No. 12所示的氨基酸序列组成的蛋白质；所述idi基因编码由SEQ ID No. 13所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
[0068] 其中，pi为链霉素抗性阿拉伯糖诱导型表达载体，pi的核苷酸序列是SEQ ID No. 6,包含MVA上游途径基因表达盒，MVA上游途径基因表达盒的核苷酸序列是SEQ ID No. 6的第1307-5821位，SEQ ID No. 6的第89-964位为阿拉伯糖启动子，SEQ ID No. 6的 第5930-6087位为TrrnB终止子，SEQ ID No. 6的第1307-3729位是MvaE基因的编码序列， SEQ ID No. 6的第3730-4904位是MvaS基因的编码序列，SEQ ID No. 6的第4905-5821位 是MVK基因的编码序列。
[0069] P2为氯霉素抗性阿拉伯糖诱导型表达载体，p2的核苷酸序列是SEQ ID No. 7,包 含MVA下游途径基因表达盒，MVA下游途径基因表达盒的核苷酸序列是SEQ ID No. 7的第 1309-4442位，SEQ ID No. 6 的第 89-964位为阿拉伯糖启动子，SEQ ID No. 6 的第 4569-4726 位为TrrnB终止子，SEQ ID No. 6的第1309-2661位是PMK基因的编码序列，SEQ ID No. 6 的第2677-3864位是MVD基因的编码序列，SEQ ID No. 6的第3894-4442位是idi基因的 编码序列。
[0070] 实施例4 :QlIspS基因在大肠杆菌中的应用
[0071] 1、ISPS蛋白表达
[0072] 上述大肠杆菌工程菌MV/pQlIspS，使用L-arab诱导之后，蛋白表达结果SDS-PAGE 如图所示（图6)，可见不含异戊二烯合成酶的大肠杆菌宿主本身不表达异戊二烯合成酶 ISPS，QlIspS基因的转入使宿主细胞表达ISPS蛋白。
[0073] 备注：图为QLISPS蛋白在大肠杆菌工程菌中表达情况。
[0074] 2、大肠杆菌发酵产物的检测
[0075] 将上述2个菌株进行发酵，方法如下：将工程菌以百分之一的接种量转接到 30mL(500mL三角瓶）含有链霉素、氯霉素及氨苄抗性的阿拉伯糖自诱导培养基（ZYM)中， 30°〇，280印111培养2011后。41：，4000印111离心收集菌液，用含有4%葡萄糖的19培养基重悬 至600D菌体浓度，取lmL重悬菌液置于20mL顶空瓶内，37°C，280rpm震荡培养30h。
[0076] 含有链霉素、氯霉素及氨苄的自诱导培养基自诱导培养基ZYM配方如下：100mL A+2mL B+2mL C+200yL D+100yL E (以下均为质量百分比浓度）；
[0077] A. ZY :1%胰蛋白胨，0.5%酵母粉；
[0078] Β· 50XM :1. 25M Na2HP04,1. 25M KH2P04, 2· 5M NH4C1 和 0· 25M Na2S04 ;
[0079] C. 50X5052 :25%甘油，2. 5%葡萄糖，10%乳糖；
[0080] D. 1M MgS04 ；
[0081] Ε· 1000X 微量元素：50Mm FeC13,20mM CaC12,10mM MnC12,10mM ZnS04, CoC12、 NiC12、Na2Mo4、Na2Se03 和 H3B03 各 2mM ;
[0082] 链霉素：终浓度50mg/L、氯霉素终浓度34mg/L、氨苄终浓度100mg/L。
[0083] M9培养基配方如分子克隆实验指南（科学出版社）第三版1595页所示。
[0084] 反应结束后，进行气相色谱（GC)分析，使用的气相色谱分析仪为Agilent 7890A GC Sysytem及Agilent7697A headspace Sampler顶空进样器,气相分离柱为HP-5。顶空取 样方法如下，Time :GC cycle time 20min, Vial equib time 6min ；Temperature (°C ) ：0ven 51, Loop/Valve 55, Transfer line 60。GC 方法如下：流速：2mL/min, Omin ~4min 50°C, 4min ~8. 5min 50 ~280°C，8. 5min ~10. 6min 280°C。
[0085] 此方法下异戊二烯标准品（Sigma公司）出峰时间为1. 75min (图7)，大肠杆菌工 程菌MV/pQlIspS及阴性对照菌株MV/pBAD的GC色谱图（图8)，可见MV/pQlIspS在1. 75min 的保留峰，而对照没有。可见未加入QlIspS基因的菌株不具备异戊二烯生产能力，转入 QlIspS基因后使得大肠杆菌具备了生产异戊二烯的能力，大肠杆菌中产量可达11. 74mg/ L〇
[0086] 实施例5 :经过氨基酸突变的QLISPS蛋白在大肠杆菌中的应用
[0087] 对QLISPS蛋白进行取代、添加和缺失突变，使用实施例3构建的pBAD-QlIspS为 模版，按照Fast Mutagenesis System(TransGen公司）试剂盒说明进行突变。
[0088] 1、QLISPS蛋白的氨基酸突变
[0089] 氨基酸的取代突变：将33位氨基酸T突变为A，即将核酸序列97-99位的ACA突 变为GCA，使用突变引物为1F和1R ;
[0090] 氨基酸的添加突变：33位氨基酸T后面添加一个氨基酸A，即将核酸序列99位之 后添加 GCG碱基，使用的突变引物为2F和2R ;
[0091] 氨基酸的缺失突变：将33位氨基酸T去掉，即将核酸序列97-99位碱基ACA去掉， 使用的突变引物为3F和3R。
[0092] 突变引物序列如下：
[0093]
[0094] 备注：有下划线碱基为突变碱基
[0095] PCR 体系
[0096]
[0100] 电泳检测
[0101] 取?ο μ 1 PCR产物，1 %琼脂糖凝胶电泳检测。
[0102] 观察到目的条带大小正确，可用DMT酶消化及转化反应。
[0103] PCR产物的消化
[0104] 加1 μ 1 DMT酶于PCR产物中，混匀，37 °C孵育lh。
[0105] 转化
[0106] a.加入2-5 μ 1 DMT酶消化产物于50 μ 1 DMT感受态细胞中（在感受态细胞刚刚 解冻时加入产物），轻弹混匀，冰浴30分钟。
[0107] b. 42°C准确热激45秒，立即置于冰上2min。
[0108] c.加250μ 1平衡至室温的S0C，225转，37°C培养1小时。
[0109] d.取200μ 1菌液铺板，培养过夜（为得到较多的克隆，4000rpm离心lmin，弃掉部 分上清，保留100-150 μ 1，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板，培养过夜）
[0110] 用对照质粒模板（4. 5Kb)检验突变效率，在含氨苄的平板上涂8μ 1500mM IPTG， 40μ1 40mg/mix-gal，突变成功的菌落呈蓝色。
[0111] 挑选蓝色菌落进行质粒抽提（Plasmid Mini Kit 1，OMEGA公司），Sanger测序。得 到正确突变克隆，取代突变株命名为pBAD-QlIspScl，添加突变株命名为pBAD-QlIspSc2， 取代突变株命名为pBAD-QlIspSc3。
[0112] 2、异戊二烯生产菌株MV/pQlIspSc的构建
[0113] 将构建好的pBAD-QlIspScl与质粒pi及p2共转化至BW25113宿主得到异戊二烯 生产菌株 MV/pQlIspScl ;
[0114] 将构建好的pBAD-QlIspSc2与质粒pi及p2共转化至BW25113宿主得到异戊二烯 生产菌株 MV/pQlIspSc2 ;
[0115] 将构建好的pBAD-QlIspSc3与质粒pi及p2共转化至BW25113宿主得到异戊二烯 生产菌株 MV/pQlIspSc3。
[0116] 3、大肠杆菌发酵产物的检测
[0117] 具体检测方法同实施例4所述方法。MV/pQlIspScl得到的气相检测结果如图9， MV/pQlIspSc2得到的气相检测结果如图10，MV/pQlIspSc3得到的气相检测结果如图11所 示，可见MV/pQlIspScl、MV/pQlIspSc2及MV/pQlIspSc3菌株同样具备生产异戊二烯的能 力，产量分别达到 11. 58mg/L，12. 46mg/L 及 11. 36mg/L。
【主权项】
1. 一种异戊二烯合成酶基因，其特征是如下（a)或（b)的基因： (a) 所述基因 cDNA的核苷酸序列如序列表的序列1所示； (b) 所述基因是编码如下蛋白质的基因：序列表的序列2所示的氨基酸序列中经过取 代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有异戊二烯合成酶活性的由序列表的序列2所示氨 基酸序列组成的蛋白质衍生的蛋白质。2. 如权利要求1所述的异戊二烯合成酶基因表达的蛋白质，其特征是如下（a)或（b) 的蛋白质： (a) 由序列表的序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b) 在（a)中的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有异戊二 烯合成酶活性的由（a)衍生的蛋白质； 所述序列表的序列2所7K的氨·基酸序列组成的蛋白质是由序列表的序列1所不喊基序 列编码。3. -种含有如权利要求1所述异戊二烯合成酶基因的原核表达载体。4. 一种含有如权利要求3所述异戊二烯合成酶基因原核表达载体的产异戊二烯工程 菌。5. 如权利要求4所述的产异戊二烯工程菌在制备异戊二烯中的应用。
【文档编号】C12N9/88GK105985972SQ201510069785
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年2月10日
【发明人】李春, 赖小勤, 冯凡, 傅深展, 陶勇
【申请人】中国科学院微生物研究所