异戊二烯合成酶基因及其应用
【专利摘要】本发明涉及一种异戊二烯合成酶基因及应用，其解决了利用工程菌合成异戊二烯效率不高的技术问题，本发明提供了一种异戊二烯合成酶基因、其表达的蛋白质、含有异戊二烯合成酶基因的原核表达载体及工程菌以及产异戊二烯工程菌的制备方法及应用。本发明可广泛用于异戊二烯制备领域。
【专利说明】
异戊二烯合成酶基因及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种异戊二烯合成酶基因及其应用。
【背景技术】
[0002] 自然界中，异戊二烯主要是由某些植物叶片排放至大气中的，而工业生产中，目 前异戊二烯主要是由石油裂解物C5馏分萃取蒸馏而来。然而随着石油资源日益枯竭及不 可再生，天然植物释放的异戊二烯收集又事倍功半，通过微生物工程菌生产异戊二烯成为 一种可持续发展的必然趋势。
[0003] 据报道，每年植物释放到大气中的异戊二烯达到5百万吨，细菌自身又不具有异 戊二烯合成酶基因，因此植物是异戊二烯合成酶（ISPS)很好来源。利用基因工程技术开展 异戊二烯合成酶基因研究已取得了一些进展，研究人员分离鉴定得到了少量的异戊二烯合 成酶基因，但国内尚未有这方面的报道。
[0004] 2000年，Miller B首次在杨树（白杨X颤杨）中获得了全长IspS 基因，并且在大肠杆菌中得到了 7. 7nmol/mgDCW的异戊二烯（Miller B et al.Planta. 2001213 (3): 483-7) ;2005 年，Sasaki 克隆得到了 白杨的 IspS 基因 （Sasaki K et al.FEBS Lett. 2005579(11) :2514-8) ;Thomas D. Sharkey 于 2005 年克隆得到蒙大 拿葛 IspS cDNA 全长（Sharkey TD et al. Plant Physiol. 2005137 (2) :700-12.),随后又 扩充了数个杨柳科IspS基因，并且得到了刺槐的IspS cDNA全长序列（Sharkey TD et al，Evolution 201367 (4):1026-1040)。
[0005] 可见国内外目前获得的异戊二烯合成酶大多限于杨柳科和豆科植物，特别是杨柳 科的几种异戊二烯合成酶基因同源性很高，在豆科植物上关于异戊二烯合成酶基因的研究 主要集中在葛根、刺槐上，而在紫穗槐中并无研究报道，基因库中也没有紫穗槐异戊二烯合 成酶基因。
【发明内容】
[0006] 本发明就是为了解决利用工程菌合成异戊二烯效率不高的技术问题，提供一种具 有较高合成效率的异戊二烯合成酶基因及应用。
[0007] 为达到上述目的，一种异戊二烯合成酶基因，其是如下（a)或（b)的基因：（a)所 述基因 cDNA的核昔酸序列如序列表的序列1所7K ; (b)所述基因是编码如下蛋白质的基 因：序列表的序列2所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有 异戊二烯合成酶活性的由序列表的序列2所示氨基酸序列组成的蛋白质衍生的蛋白质。
[0008] 本发明同时提供一种异戊二烯合成酶基因表达的蛋白质，其是如下（a)或（b)的 蛋白质：(a)由序列表的序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)在（a)中的氨基酸序 列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有异戊二烯合成酶活性的由（a)衍生的 蛋白质；序列表的序列2所7K的氨·基酸序列组成的蛋白质是由序列表的序列1所不喊基序 列编码。
[0009] 本发明还提供一种异戊二烯合成酶基因的原核表达载体。
[0010] 本发明还提供异戊二烯合成酶基因原核表达载体的产异戊二烯工程菌。
[0011] 本发明同时提供产异戊二烯工程菌在制备异戊二烯中的应用。
[0012] 本发明的有益效果：根据植物在自然界异戊二烯的释放速率，本发明选择了释放 量较高的紫穗槐异戊二烯合成酶基因进行了分离鉴定和克隆，成功构建异戊二烯生产菌 株，为生物法生产异戊二烯寻找到一个高效的异戊二烯合成酶。本发明利用基因工程手段， 克隆得到了紫穗槐基因 AflspS，应用到大肠杆菌和酿酒酵母中，使用气相色谱进行检测，大 肠杆菌和酿酒酵母都具备生产异戊二烯的能力，本发明对于使用微生物进行异戊二烯大规 模工业生产提供了一个高效有效的酶。
【附图说明】
[0013] 图1是紫穗槐总RNA的琼脂糖电泳结果；
[0014] 图2是紫穗槐AflspS基因片段的琼脂糖电泳结果；
[0015] 图3是紫穗槐AflspS基因3' -RACE的琼脂糖电泳结果；
[0016] 图4是紫穗槐AflspS基因5' -RACE的琼脂糖电泳结果；
[0017] 图5是紫穗槐AFISPS氨基酸序列BlastP分析结果图；
[0018] 图6是RACE原理图；
[0019] 图7是紫穗槐AFISPS蛋白在大肠杆菌中表达的SDS-PAGE结果；
[0020] 图8是异戊二烯标准品的气相色谱结果；
[0021] 图9是紫穗槐AflspS基因在大肠杆菌中应用的气相检测结果；
[0022] 图10是紫穗槐AflspS基因在酿酒酵母中应用的气相检测结果；
[0023] 图11是紫穗槐AFISPS蛋白经过取代突变之后在大肠杆菌中应用的气相检测结 果；
[0024] 图12是紫穗槐AFISPS蛋白经过添加突变之后在大肠杆菌中应用的气相检测结 果；
[0025] 图13是紫穗槐AFISPS蛋白经过缺失突变之后在大肠杆菌中应用的气相检测结 果。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为 常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0027] 下述实施例中，大肠杆菌 BW25113 (Baba T et al. Mol Syst Biol. 2006 ; 2:2006. 0008.)是一株非病原菌，遗传背景清楚，世代时间短、容易培养且培养基原料低廉。 大肠杆菌BW25113公众可从中国科学院微生物研究所获得，酿酒酵母BY4741a是模式菌， 也可以从中国科学院微生物研究所获得，以上所述生物材料只为重复本发明的相关实验所 用，不可作为其它用途使用。
[0028] 实施例1 :基因片段的获得
[0029] 1.提取紫穗槐叶片总RNA
[0030] 采集紫穗槐叶片，使用RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen公司）提取杨树叶片总 RNA，按照试剂盒说明方法进行，进行电泳（图1)验证RNA提取质量，可见RNA完整性良好， 可以进行后续实验。
[0031] 2. RT-PCR
[0032] 以01ig〇(dT)2(^j(为反转录引物，按照反转录试剂盒Superscript. III First-Strand Synthesis System for RT_PCR(Invitrogen 公司）说明将核酸反转录为 cDNA ；
[0033] 反应体系如下：
[0034] RNA 1 μ g
[0035] 10mM dNTP 1 μ 1
[0036] 01igo(dT)20(0. 5μ g/μ 1) 1 μ 1
[0037] 65°C 5min,置于冰上lmin,加入下面的10 μ 1的mix
[0038] 10XRT buffer 2 μ 1 25mM MgCl2 4 μ 1 0. 1MDTT 2 μ 1 RNase0UT?(40U/u 1) 1 w 1 Superscript? III RT 1 μ 1
[0039] 5(TC 50min，85°C 15min 加入 1 μ 1 RNase H，37°C 20min
[0040] 反应完毕，加入100 μ 1水稀释cDNA，得到cDNA第一链。
[0041] 3.简并引物设计
[0042] 根据杨柳科及豆科植物的已知氨基酸序列的保守区，并且参考所有已知IspS的 核酸序列及单萜合成酶的核酸序列设计的简并引物ZSHF1及ZSHR1 :
[0043] ZSHF1 :5'TTCCTNCAAGAAGCAAAATGG 3'
[0044] ZSHR1 :5'YTGRTANGTGCARTGNGA 3'
[0045] 4.简并PCR反应
[0046] 反应体系
[0047]
[0050] 扩增出450bp左右的片段（图2)，扩增产物于1. 5%琼脂糖凝胶上电泳，产物单一 明亮。
[0051] 备注：所示明亮单一条带为ZSHF1和ZSHR1引物组扩增产物，Marker为TAKARA 100bp DNA Ladder〇
[0052] 5.连接T载体，Sanger测序
[0053] 将单一明亮的条带回收，连接PMD18-T (TAKARA公司）载体，转化至 trans5a (TransGen公司）感受态细胞，第二天选择白斑进行验证，选取阳性克隆，送至生 工Sanger测序。
[0054] 6.测序及序列分析，
[0055] 测序结果经序列比对，显示与黑洋槐的IspS基因同源性达到79%，与蒙大拿葛 IspS同源性达到76 %，可以猜测此序列为豆科IspS基因，此片段命名为AflspS基因片段， 序列如SEQ ID No. 3所示。
[0056] 核酸序列进行翻译后氨基酸序列如SEQ ID No. 4所示。
[0057] 实施例2 :AfIspS基因编码区全长的获得
[0058] 获得 cDNA 全长的方法为 SMARTer-RACE，使用 SMARTer? PCR cDNA Synthesis Kit (Clontech公司）进行，以下使用的引物及试剂除GSP均为SMARTer? PCR cDNA Synthesis Kit内提供，按照试剂盒说明方法进行。
[0059] 1. RACE-Ready cDNA 的制备
[0060] RACE-Ready cDNA第一链的反转录体系如下：
[0061]
[0063] 2.基因特异性引物的设计：
[0064] 根据已经获得的ΑΠ spS片段的序列设计基因特异性引物（GSP)，RACE-Ready cDNA做模版，GSP及通用引物（Universal Primer Mix, UPM)做引物进行扩增，可以得到 3'-RACE cDNA片段及5' -RACE cDNA片段。引物位置如图6所示，中间黑色部分为简并 PCR获得序列，两侧黑色部分为通用引物序列，白色部分为需要得到的未知序列部分。
[0065] 共8个GSP序列，如下表：
[0066]
[0067] 3. 3' -RACE cDNA末端序列的获得
[0068] 使用紫穗槐的3' -RACE-Ready cDNA为模版，UPM与GSP为引物进行扩增
[0069] 反应体系：
[0070]
[0072] 反应条件：
[0073]
[0074] 3' -RACE的琼脂糖凝胶检测结果如图（图3):
[0075] 得到一个单一明亮的紫穗槐DNA扩增条带，连接T载体，转化感受态细胞，挑选阳 性克隆Sanger测序，得到3'端cDNA序列。
[0076] 4. 5' -RACE cDNA末端序列的获得
[0077] 使用紫穗槐的5' -RACE-Ready cDNA为模版，UPM与GSP为引物进行扩增.
[0078] 反应体系：
[0081] 反应条件：
[0082]
[0083] 5' -RACE的琼脂糖凝胶检测结果如图（图4):
[0084] 由图可见得到单一明亮的扩增条带，选择其一连接T载体，转化感受态细胞，挑选 阳性克隆Sanger测序，得到5'端cDNA序列。
[0085] 5.全长序列的获得
[0086] 根据3' -RACE及5' -RACE测序结果，进行序列比对，得到该基因 cDNA全长序列 (SEQ ID No. 1所示序列），对DNA、氨基酸序列进行分析：该基因有1770bp，编码589个氨 基酸，有ATG起始密码子和TGA终止密码子，说明该基因的完整性；其编码的氨基酸含有一 个IspS高度保守标签序列DDXXD区域，同时也包含了 RRX8W保守区域。利用BLAST软件在 NCBI中进行同源比对，结果如图5,显示该基因为Isoprenoid_Biosyn_Clsuperfamily成 员，与蒙大拿葛（Pueraria montana var. lobata)异戊二烯合成酶同源性达到77% ;与刺 槐（Robinia pseudoacacia)的异戊二烯合成酶有81 %同源性，与紫藤（wisteria sp.)的 异戊二烯合成酶有76%的同源性，说明我们得到的是异戊二烯合成酶基因，简写为AflspS 基因，得到了编码AFISPS蛋白的氨基酸序列（SEQ ID No. 2所示序列）。
[0087] 实施例3 :大肠杆菌异戊二烯生产菌株的构建
[0088] 全长引物ZSHFa及ZSHRa序列如下：
[0089] ZSHFa :5'GTCATGCCATGGGGTGTGCATTGAGCACACAGGATACTC 3'
[0090] ZSHRa :5'TATCGAGCTCTTCTGCAATTAATTGGAATAGGGTCAAG 3'
[0091] 1.大肠杆菌表达载体pBAD-AflspS构建
[0092] 将使用引物ZSHFa及ZSHRa获得的AflspS基因片段进行Ncol和Kpnl (TAKARA公 司）双酶切，并将pBAD-HisB表达载体（购自Invitrogen公司）进行Ncol和ΚρηΙ双酶 切，AflspS基因连接至pBAD-HisB载体后转化至trans5 α感受态细胞，选取阳性克隆进行 测序，pBAD-AflspS的核苷酸序列是SEQ ID No. 5。
[0093] 2.异戊二烯生产菌株MV/pAfispS的构建
[0094] 将构建好的pBAD-AflspS与质粒pi及p2共转化至BW25113宿主得到异戊二烯生 产菌株 MV/pAfispS。
[0095] 并且构建对照菌株MV/pBAD，方法为将pBAD-HisB与质粒pi及p2共转至BW25113 宿主，得到无异戊二烯合成酶基因的对照菌株MV/pBAD。
[0096] 上述异戊二烯生产菌的构建方法中，pl，p2包含异戊二烯合成途径-甲羟戊酸 (MVA)途径基因。其中pi由MvaE (乙酰辅酶A乙酰转移酶）基因、MvaS(HMG-乙酰辅酶A 合成酶）基因及MVK(甲羟戊酸激酶）基因组成，所述MvaE基因编码由SEQ ID No. 8所示的 氣基酸序列组成的蛋白质；所述MvaS基因编码由SEQ ID No. 9所不的氣基酸序列组成的蛋 白质；所述MVK基因编码由SEQ ID No. 10所示的氨基酸序列组成的蛋白质。p2由PMK(磷 酸甲羟戊酸激酶）基因、MVD(焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶）基因及idi (异戊二烯焦磷酸异构 酶）基因组成，所述PMK基因编码由SEQ ID No. 11所不的氨1基酸序列组成的蛋白质；所述 MVD基因编码由SEQ ID No. 12所示的氨基酸序列组成的蛋白质；所述idi基因编码由SEQ ID No. 13所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
[0097] 其中，pi为链霉素抗性阿拉伯糖诱导型表达载体，pi的核苷酸序列是SEQ ID No. 6,包含MVA上游途径基因表达盒，MVA上游途径基因表达盒的核苷酸序列是SEQ ID No. 6的第1307-5821位，SEQ ID No. 6的第89-964位为阿拉伯糖启动子，SEQ ID No. 6的 第5930-6087位为TrrnB终止子，SEQ ID No. 6的第1307-3729位是MvaE基因的编码序列， SEQ ID No. 6的第3730-4904位是MvaS基因的编码序列，SEQ ID No. 6的第4905-5821位 是MVK基因的编码序列。
[0098] P2为氯霉素抗性阿拉伯糖诱导型表达载体，p2的核苷酸序列是SEQ ID No. 7,包 含MVA下游途径基因表达盒，MVA下游途径基因表达盒的核苷酸序列是SEQ ID No. 7的第 1309-4442位，SEQ ID No. 6 的第 89-964位为阿拉伯糖启动子，SEQ ID No. 6 的第 4569-4726 位为TrrnB终止子，SEQ ID No. 6的第1309-2661位是PMK基因的编码序列，SEQ ID No. 6 的第2677-3864位是MVD基因的编码序列，SEQ ID No. 6的第3894-4442位是idi基因的 编码序列。
[0099] 实施例4 :AfIspS基因在大肠杆菌中的应用
[0100] 1、ISPS蛋白表达
[0101] 上述大肠杆菌工程菌MV/pAfispS，使用L-arab诱导之后，蛋白表达结果SDS-PAGE 如图所示（图7)，可见不含异戊二烯合成酶的大肠杆菌宿主本身不表达异戊二烯合成酶 ISPS，AfispS基因的转入使宿主细胞表达ISPS蛋白。
[0102] 备注：图为AFISPS蛋白在大肠杆菌工程菌中表达情况。
[0103] 2、大肠杆菌发酵产物的检测
[0104] 将上述2个菌株进行发酵，方法如下：将工程菌以百分之一的接种量转接到 30mL(500mL三角瓶）含有链霉素、氯霉素及氨苄抗性的阿拉伯糖自诱导培养基（ZYM)中， 30°〇，280印111培养2011后。41：，4000印111离心收集菌液，用含有4%葡萄糖的19培养基重悬 至600D菌体浓度，取lmL重悬菌液置于20mL顶空瓶内，37°C，280rpm震荡培养30h。
[0105] 含有链霉素、氯霉素及氨苄的自诱导培养基自诱导培养基ZYM配方如下：100mL A+2mL B+2mL C+200yL D+100yL E (以下均为质量百分比浓度）；
[0106] A. ZY :1%胰蛋白胨，0.5%酵母粉；
[0107] Β· 50XM :1. 25M Na2HP04,1. 25M ΚΗ2Ρ04,2· 5M NH4C1 和 0· 25M Na2S04 ;
[0108] C. 50X5052 :25%甘油，2· 5%葡萄糖，10%乳糖；
[0109] D. 1Μ MgS04 ；
[0110] Ε· 1000X 微量元素：50Mm FeC13,20mM CaC12,10mM MnC12,10mM ZnS04, CoC12、 NiC12、Na2Mo4、Na2Se03 和 H3B03 各 2mM ;
[0111] 链霉素：终浓度50mg/L、氯霉素终浓度34mg/L、氨苄终浓度100mg/L。
[0112] M9培养基配方如分子克隆实验指南（科学出版社）第三版1595页所示。
[0113] 反应结束后，进行气相色谱（GC)分析，使用的气相色谱分析仪为Agilent 7890A GC Sysytem及Agilent7697A headspace Sampler顶空进样器,气相分离柱为HP-5。顶空取 样方法如下，Time :GC cycle time 20min, Vial equib time 6min ；Temperature (°C ) ：0ven 51, Loop/Valve 55, Transfer line 60。GC 方法如下：流速：2mL/min, Omin ~4min 50°C, 4min ~8. 5min 50 ~280°C，8. 5min ~10. 6min 280°C。
[0114] 此方法下异戊二烯标准品（Sigma公司）出峰时间为1. 75min (图8)，大肠杆菌工 程菌MV/pAfispS及阴性对照菌株MV/pBAD的GC色谱图（图9)，可见MV/pAfispS在1. 75min 的保留峰，而对照没有。可见未加入AflspS基因的菌株不具备异戊二烯生产能力，转入 AflspS基因后使得大肠杆菌具备了生产异戊二烯的能力，大肠杆菌中产量可达237. 96mg/ L〇
[0115] 实施例5 :经过氨基酸突变的AFISPS蛋白在大肠杆菌中的应用
[0116] 对AFISPS蛋白进行取代、添加和缺失突变，使用实施例3构建的pBAD-AflspS为 模版，按照Fast Mutagenesis System(TransGen公司）试剂盒说明进行突变。
[0117] 1、AFISPS蛋白的氨基酸突变
[0118] 氨基酸的取代突变：将53位氨基酸N突变为T，即将核酸序列157-159位的AAT突 变为ACT，使用突变引物为1F和1R ;
[0119] 氨基酸的添加突变：25位氨基酸Q后面添加一个P氨基酸，即将核酸序列75位之 后添加 CCG碱基，使用的突变引物为2F和2R ;
[0120] 氨基酸的缺失突变：将25位氨基酸Q去掉，即将核酸序列73-75位碱基CAA去掉， 使用的突变引物为3F和3R。
[0121] 突变引物序列如下：
[0122]
[0123] 备注：有下划线碱基为突变碱基
[0124] PCR 体系
[0125] Control Plasmid 1-§ ng Control Primers 1 μ 1 5 X Trans Start Fast Pfii buffer 10 u 1 10 ml dNTPs： 1 μ 1 Tr.ansStart FUs.tPfti. DNA Polymer.ase 1 u 1 ddH20 to SO μ 1
[0126] PCR 条件
[0127]
[0129] 电泳检测
[0130] 取10 μ 1 PCR产物，1 %琼脂糖凝胶电泳检测。
[0131] 观察到目的条带大小正确，可用DMT酶消化及转化反应。
[0132] PCR产物的消化
[0133] 加 1 μ 1 DMT酶于PCR产物中，混匀，37 °C孵育lh。
[0134] 转化
[0135] a.加入2-5 μ 1 DMT酶消化产物于50 μ 1 DMT感受态细胞中（在感受态细胞刚刚 解冻时加入产物），轻弹混匀，冰浴30分钟。
[0136] b. 42°C准确热激45秒，立即置于冰上2min。
[0137] c.加 250 μ 1平衡至室温的S0C，225转，37°C培养1小时。
[0138] (1.取20(^1菌液铺板，培养过夜（为得到较多的克隆，4000印111离心11^11，弃掉部 分上清，保留100-150 μ 1，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板，培养过夜）
[0139] 用对照质粒模板（4. 5Kb)检验突变效率，在含氨苄的平板上涂8 μ 1500mM IPTG， 40μ1 40mg/mlX-gal，突变成功的菌落呈蓝色。
[0140] 挑选蓝色菌落进行质粒抽提（Plasmid Mini Kit 1，0MEGA公司），Sanger测序。得 到正确突变克隆，取代突变株命名为pBAD-AflspScl，添加突变株命名为pBAD-AnspSc2， 取代突变株命名为pBAD-AfIspSc3。
[0141] 2、异戊二烯生产菌株MV/pAfispSc的构建
[0142] 将构建好的pBAD-AflspScl与质粒pi及p2共转化至BW25113宿主得到异戊二烯 生产菌株 MV/pAfispScl ;
[0143] 将构建好的pBAD_AnspSc2与质粒pi及p2共转化至BW25113宿主得到异戊二烯 生产菌株 MV/pAfispSc2 ;
[0144] 将构建好的pBAD-AfIspSC3与质粒pi及p2共转化至BW25113宿主得到异戊二烯 生产菌株 MV/pAfispSc3。
[0145] 3、大肠杆菌发酵产物的检测
[0146] 具体检测方法同实施例4所述方法。MV/pAfispScl得到的气相检测结果如图11， MV/pAfispSc2得到的气相检测结果如图12，MV/pAfispSc3得到的气相检测结果如图13所 示，可见MV/pAfispScl、MV/pAfispSc2及MV/pAfispSc3菌株同样具备生产异戊二烯的能 力，产量分别达到 45. 68mg/L，32mg/L 及 43. 56mg/L。
[0147] 实施例6 :酿酒酵母异戊二烯生产菌株构建
[0148] 将AflspS整合到酿酒酵母菌株BY4741a染色体基因组中。
[0149] 本实施例用使用的引物序列如下：
[0154] 共进行5轮PCR扩增，每一轮扩增反应体系所用的模版、引物1及引物2分别如下 表所列。
[0155]
[0156] 其中，质粒 pSFS2,参考文献为 Gene(2004)341:119 - 127, GeneBank 数据库的 登录号为：AY524979,来源于中国科学院微生物所。质粒pUC57-ispS为带有本发明所 述IspS基因完整编码区序列，来源于中国科学院微生物所。质粒pAG32,参考文献为 Yeast (1999) 15 (14) : 1541-53,带有TEF启动子和终止子序列，来源于中国科学院微生物 所。DNA聚合酶是宝生物工程有限公司的Pyrobest DNA聚合酶，或者是NEB公司的Phusion DNA聚合酶，活性单位均为5U/ μ 1。
[0157] PCR循环条件为：
[0158] 94度2分钟 （预变性阶段）
[0159] 94度20秒，58度20秒，72度1~6分钟 （30个循环扩增阶段）
[0160] 72度10分钟 （最后延伸阶段）
[0161] 2、DNA 纯化
[0162] 反应结束后，取5 μ 1上述PCR样品进行琼脂糖电泳检测，证明扩增所得的DNA片 段大小与预计的一样，而且没有杂带，利用PCR纯化试剂盒（购自Omega公司）进行纯化和 浓缩，为后面的转化准备DNA样品。
[0163] 3、LiAc法酵母转化
[0164] 酿酒酵母转化主要参照参考文献Methods Enzymol (2002) 350:87-96。从平板接 种酵母至2ml YH)试管，30°C摇床培养过夜，添加3-5ml培养基继续培养至对数生长中期。 按 lml 分装离心收集菌体，400 μ 1 LiAc/TE 溶液（0· 1M LiAc, 10mM Tris-HCl (pH 7. 5)，ImM EDTA ;用lOXLiAc和10XTE稀释）洗一遍，菌体重悬于100 μ 1 LiAc溶液。加入5 μ 1变性鲑 鱼精DNA(使用前95°C，5min，立即置于冰上）和1 一 5μ 1转化DNA，混匀，室温放置5min， 加入 280 μ 1 PEG/LiAc/TE 溶液（用灭菌 50% PEG4000 配制 IX LiAc/TE 溶液）。颠倒 4 一 6次混匀。30°C放置45min后加入39μ1 DMS0,42°C水浴热击5min。离心，菌体用ddH20洗 一遍，重悬于100 μ 1 ddH20,涂抗性筛选YPD平板（含100 μ g/ml clonNAT)，放置30°C培 养箱内培养至单菌落出现。
[0165] 4、筛选抗性菌落
[0166] 将上述抗性平板上长出的单菌落分别接种到lml YH)培养基的离心管中，加 clonNAT至终浓度为100μ g/ml，220转/分钟，30°C摇床培养。出现生长，说明带有抗性，证 明抗性基因已经整合到菌体基因组中并发挥作用，这部分菌落用于下一步验证。没有出现 生长的菌落，说明是假阳性，等同于出发菌株，停止处理。
[0167] 5、鉴定酿酒酵母异戊二烯生产菌株
[0168] 上面出现生长的抗性菌落，接种YH)液体培养基培养过夜，吸取500 μ 1菌液，利用 宝生物工程有限公司的基因组提取试剂盒制备基因组DNA，具体操作按照试剂盒说明书进 行。以获得的基因组DNA为模版，Scl8Sup和Scl8Sdown为引物进行PCR扩增。检测引物 退火位点分别位于酿酒酵母菌株BY4741a染色体基因组整合位点的上下游，PCR扩增产物 的大小分别为1. 7k(整合前）和3. 6k(整合后）。如果IspS基因没有整合到酿酒酵母菌 株BY4741a染色体基因组整合位点，PCR扩增产物的大小为1. 7kb。如果IspS基因整合到 酿酒酵母菌株BY4741a染色体基因组整合位点，PCR扩增产物的大小则为3. 6kb。鉴定为阳 性的菌株，再进一步经菌落纯化和相同方法的鉴定，得到本发明所述的酿酒酵母异戊二烯 生产菌株。
[0169] 实施例7 :酿酒酵母异戊二烯生产菌株生产异戊二烯的检测
[0170] 从平板接种酵母单菌落至2ml YPD(1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖）试 管，30°C摇床培养过夜，离心收集菌体，菌体重悬于YPG (1 %酵母提取物，2 %蛋白胨，2%半 乳糖）至0D600约为0. 5,转lml上述菌液于10ml顶空瓶内，密封，30°C摇床培养3天，气相 色谱检测方法同实施例5中检测方法，检测到酿酒酵母异戊二烯生产菌株有20 μ g/L的异 戊二烯产量。对照菌株为野生型酿酒酵母BY4741a，检测不到异戊二烯（图10)。
【主权项】
1. 一种异戊二烯合成酶基因，其特征是如下（a)或（b)的基因： (a) 所述基因 cDNA的核苷酸序列如序列表的序列1所示； (b) 所述基因是编码如下蛋白质的基因：序列表的序列2所示的氨基酸序列中经过取 代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有异戊二烯合成酶活性的由序列表的序列2所示氨 基酸序列组成的蛋白质衍生的蛋白质。2. 如权利要求1所述的异戊二烯合成酶基因表达的蛋白质，其特征是如下（a)或（b) 的蛋白质： (a) 由序列表的序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b) 在（a)中的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有异戊二 烯合成酶活性的由（a)衍生的蛋白质； 所述序列表的序列2所7K的氨·基酸序列组成的蛋白质是由序列表的序列1所不喊基序 列编码。3. -种含有如权利要求1所述异戊二烯合成酶基因的原核表达载体。4. 一种含有如权利要求3所述异戊二烯合成酶基因原核表达载体的产异戊二烯工程 菌。5. 如权利要求4所述的产异戊二烯工程菌在制备异戊二烯中的应用。
【文档编号】C12N15/60GK105985977SQ201510071163
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年2月10日
【发明人】李春, 赖小勤, 胡开蕾, 毋鸿江, 傅深展, 陶勇
【申请人】中国科学院微生物研究所, 中科鸿基生物科技有限公司