本发明属于水稻功能基因组学应用技术领域，特别是一种水稻生长素响应蛋白基因arp克隆及应用。
背景技术：
水稻是三大粮食作物之一，超过世界人口总数三分之一的人将其作为食物的主要来源，它在国民经济中占有举足轻重的地位。随着世界人口的不断增加以及对粮食需求的加大，每年对水稻的需求量都在不断的上升，在土地面积日趋缩小的今天，如何使水稻稳产、高产以缓解因人口的增加给水稻生产带来的压力是世界范围内所面临的难题，也是摆在科研工作者面前的一个重大科研课题。尽管传统的遗传研究和常规育种已经为水稻的产量提高和品质改善作出了重要贡献，但是由于稻属种质资源及常规育种方法的局限性，给水稻进一步的遗传改良带来一定的困难。
随着分子生物学、分子标记育种、基因组学、生物信息学的快速发展和水稻基因组计划的实施，给水稻的生产和育种带来了新机遇。但是严重缺乏拥有自主知识产权的重要功能基因是严重制约我国分子育种及分子设计育种高水平发展的一个“瓶颈”。目前水稻基因组序列的测定和水稻功能基因组研究的成果将对我国农业生产发挥重要影响，加快农作物品种的更新换代。国际水稻基因组测序计划启动于1998年，由政府和其它公共资金支持，中国、日本、美国、法国等11个国家和地区共同发起并承担了这项庞大的科研任务。这是继人类基因组计划后的又一重大国际合作的基因组研究项目[takujisasakietal.，2000]。水稻基因组相对于玉米、小麦等禾谷类作物小，约420-460m个碱基，基因数约3-5万个，被国际上广泛选为模式作物，进行基因组测序和功能基因组研究。随着2002年水稻全基因组测序草图的完成和精确测序的完成[junyuetal.，2002；stephena.goffetal.，2002；qifeng，etal.，2003；sasakitetal.，2003]，水稻的研究重点由结构基因组学开始向功能基因组学转移，功能基因组学的研究现已经成为全球研究的重点，由于基因组序列研究成果的国际共享性，为人们利用该研究成果进入水稻基因资源的竟争提供了新的机遇。特别是，这样的局面为中国开展功能基因组研究，发现重要功能基因，实现基因组研究的跨越式发展提供了千载难逢的机会。谁先克隆了基因，谁就享有该基因的知识产权。反之，就丧失主动权，就会受治于人。为了在这场“基因大战”中取得胜利，世界上一些发达国家及大的跨国公司纷纷投巨资于这一领域的研究[hieterpetal.，1997]。在美洲，美国、加拿大投巨资于玉米、小麦基因的研究；在欧洲，英国johninnes研究中心从杜邦公司每年得到1-2千万英镑从事小麦基因的研究；在亚洲，日本、韩国等投巨资从事水稻基因研究；在澳洲，澳大利亚政府投巨资成立了小麦分子育种合作研究中心，每年投入上千万澳元从事小麦分子育种研究。人们预计，在未来的10-20年时间内，国际上的“基因大战”将会愈演愈烈。在功能基因及其编码蛋白质的结构与功能的研究领域，并在此基础上发现一批具有重要生理活性和开发应用前景的功能基因是未来工作和研究的重点，从而为我国以基因和基因表达产物为基础的动植物遗传改良奠定基础，更有力地推动我国农业生物技术产业的快速发展。随着2002年全球水稻基因组测序计划的完成和水稻全基因组序列的公布，水稻功能基因组学的研究现已成为世界范围内研究的重点，了解这些基因在生长和发育中的作用越来越受到人们的关注。
技术实现要素：
本发明的目的在于为水稻分子育种，提供一种水稻生长素响应蛋白基因arp克隆及应用。
本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：
一种水稻生长素响应蛋白基因arp克隆，该基因位于水稻基因组的4号染色体，距离4，5，7－三羟黄烷酮加双氧酶基因3.8kb位置，该基因没有内含子，其基因序列为sq1。
一种水稻生长素响应蛋白基因arp克隆的应用，该应用是将所述水稻生长素响应蛋白基因arp应用于水稻转基因育种、分子设计育种及水稻矮化育种领域。
本发明的优点和积极效果是：
1、本发明的生长素响应蛋白基因arp可广泛应用于作物分子育种领域，将会给水稻等作物分子育种及矮化育种带来株高降低起推动作用，对水稻等作物育种产生巨大影响。
2、本发明的生长素响应蛋白基因arp，在实施推广过程中对实验室及田间施肥管理要求条件宽松，株高矮化效果显著，为基因克隆和分子育种提供一套行之有效的方法。
具体实施方式
以下对本发明实施做进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
一种水稻生长素响应蛋白基因arp，该基因位于水稻基因组的4号染色体，距离4，5，7－三羟黄烷酮加双氧酶基因3.8kb位置，该基因没有内含子，大小为462个碱基序列，其基因序列为sq1。
一种水稻生长素响应蛋白基因arp的应用，该应用是将所述水稻生长素响应蛋白基因arp应用于水稻转基因育种、分子设计育种及水稻矮化育种领域。
上述水稻生长素响应蛋白基因arp的发现及验证过程，该过程包括步骤如下：
(1)水稻转化受体的制备
水稻品种日本晴成熟后的种子脱壳，先用70％酒精浸泡1分钟，然后用0.1％升汞溶液灭菌20分钟，再用无菌水冲洗3次，吸干后接种到nbd培养基上进行愈伤诱导，培养温度25±1℃，1周后，挑取愈伤进行继代培养，继代2周后，取出愈伤进行转化。
(2)水稻遗传转化
挑取农杆菌单菌落到含有50mg/l卡那霉素和20mg/l利福平的yep液体培养基中，28℃振荡培养14小时，使菌液浓度达到od值0.5，再取1ml菌液加到含有同样抗生素浓度的ab和0.5％蔗糖的100ml溶液中继续培养17小时左右，使od值达到0.8。将上述菌液置于50ml离心管中，4000rpm离心20分钟，去除上清，加入同原菌液等量的aam培养基，重新悬浮；重复上述做法，再离心，去掉上清，再用aam悬浮，使od值约0.4；将愈伤组织在农杆菌液中浸泡30分钟；然后将愈伤组织移至干燥的灭菌滤纸上，吸去多余的菌液，最后将愈伤组织置于其培养基na上，共培养一般2-3天。待愈伤组织周围出现农杆菌菌落后，用500mg/l的头孢霉素和200mg/l氨苄青霉素溶液充分漂洗，以后再置于选择培养基nbdh。
(3)抗性愈伤的筛选和植株再生
愈伤组织在选择培养基上培养大约10-15天后，大部分愈伤变褐死亡，一些新鲜的抗性愈伤就陆续死亡的愈伤表面出现，挑取抗性愈伤于选择培养基上继代20天左右，选择黄色质地坚硬的愈伤抗性愈伤再转移到预分化培养基nbp上，25天后待愈伤变白后就可以转移到分化培养基nbr上，3天就开始有绿点产生，10天左右苗就陆续出来，30天左右就可以移苗于1/2ms培养基上生根，当幼苗长至8cm以上时，练苗7天时间就可以移入温室中的土里种植。
(4)t-dna(转移dna)插入后代的突变体筛选
通过农杆菌介导转化日本晴，获得t-dna插入群体。通过对t0代各个时期的表型的观察和接种实验来进行突变体筛选。共发现突变体208个，突变率为11.3％，表型涉及株高、叶片、穗型、生育期、颖花、颖壳着色、抗病等，其中出现株高矮化突变体，后代分离接近3：1，株高37cm，茎杆细，多分蘖，株高层次分明。
(5)tail-pcr(热不对称交错pcr)
根据pcambia1301t-dna右边界设计的三个嵌套式的特异性引物sp1，sp2和sp3分别距t-dna右边界重复序列297bp，234bp和48bp。通过切胶回收第三次扩增所得到的比第二次小的片断，连接到pgm-teasy载体(一种高效克隆pcr产物的专用载体)上，然后采用电击法转入到大肠杆菌dh5α，然后通过测序获得基因序列。
(6)水稻侧翼序列网上序列比对分析由上面分析可知：p1424突变体t－dna插入水稻基因组的位置处在水稻4号染色体上，与已知水稻bac克隆(bacclone:osjnba0084k01)序列同源性达到97％；通过分析发现该克隆含有两个基因，t-dna插在距上游基因1.3kb与下游基因2.7kb之间的位置上；通过分析插入位点上游基因氨基酸序列比对发现，与未知功能基因的氨基酸序列同源性达到75％，通过网上比对认为该基因与拟南芥生长素诱导蛋白基因同源性达到71％，因此预测该基因的功能为生长素响应蛋白基因；同时对下游距离插入位点较远的基因通过网上氨基酸序列比对，下游基因与水稻未知功能基因同源性达到96％，与玉米4,5,7-三羟黄烷酮加双氧酶基因同源性达到85％；为了更进一步证明所预测的基因到底是否存在，通过网上搜索水稻cdna克隆，找到了t-dna插入位点上游基因-生长素响应蛋白基因的cdna克隆，证明该基因是存在的，该cdna序列与基因序列完全一致，说明该基因没有内含子，该基因我们命名为arp(auxinresponsiveprotein)，大小为462个碱基序列，其碱基序列sq1如下：
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(7)表达载体构建及转基因功能验证
通过构建超表达载体pcambia1300-arp的水稻转基因植株65株，其中63株通过pcr扩增出目的基因片段和潮霉素基因片段；通过半定量rt-pcr证明arp基因在水稻2号、8号、50号株系中表达量明显高于野生型，且转基因植株的株高明显低于野生型，发育迟缓；通过转化拟南芥后也发现与水稻相似的结果，但叶片变小且多，果荚变小，主根和下胚轴长度缩短，侧根和须根增多；将arp基因敲除载体pcambia1300-amirna和对照pcambia1300载体转化水稻基因组后，发现arp基因敲除载体所获得的抗性愈伤与对照相比较小且软，分化率也比较低，而且转基因再生苗株型小，茎细，叶片颜色较浅为浅绿色，须根和侧根变少。
sequencelisting
<110>天津农学院
<120>一种水稻生长素响应蛋白基因arp克隆及应用
<130>2014-04-18
<160>5
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>462
<212>dna
<213>水稻生长素响应蛋白基因arp的基因组碱基序列
<400>1
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