本发明属于酶固定化领域，具体涉及一种乙酰胆碱酯酶的复合固定化方法。
背景技术：
乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase，简称为ache，ec3.1.1.7)是胆碱酯酶的一大类，广泛存在于人、动物、昆虫等体内，可专一性将乙酰胆碱水解为胆碱和乙酸，是一种十分重要的与神经传导相关的酶。乙酰胆碱酯酶可被有机磷、氨基甲酸酯类农药特异性抑制，据此乙酰胆碱酯酶被广泛用于农药检测、环境检测等多个领域。
酶的固定化技术(enzymeimmobilization)是指将酶束缚或限制于一定区域内，但仍保留其催化特性并可回收和重复使用的一类技术。与游离酶相比，固定化酶具有高稳定性、易分离、可重复使用等特点，被广泛应用于工业、农业、医药和食品等领域。
目前，乙酰胆碱酯酶(ache)固定化方法多使用一般酶的常规固定方法，如吸附法和交联法等。在乙酰胆碱酯酶(ache)固定化过程中研究多集中于寻找温和、亲和性好的固定化材料和固定方法，而未考虑乙酰胆碱酯酶(ache)蛋白分子的结构特点与区域性差异，导致乙酰胆碱酯酶(ache)在固定化的过程中部分酶的结构发生改变，活性大幅下降。这严重影响了固定化酶的使用，成为固定化乙酰胆碱酯酶(ache)实际应用的瓶颈。
乙酰胆碱酯酶的结构基础为蛋白质，其氨基酸序列和分子三维晶体结构信息已被完全解析。同时，针对乙酰胆碱酯酶的区域性结构功能关系的研究已较为完备。研究显示，乙酰胆碱酯酶分子上不同区域具有不同的理化性质(如，疏水性、带电性等)，存在显著的区域性功能差异。
为了改善现有技术中固定化乙酰胆碱酯酶(ache)的性能，开发一种分子水平设计的专门针对乙酰胆碱酯酶区域差异的酶固定化方法具有重要意义。
技术实现要素：
本发明为了解决现有技术中乙酰胆碱酯酶固定化过程中结构发生改变而导致活性降低的问题，基于分子对接筛选技术，提出一种乙酰胆碱酯酶的复合固定化方法。具体技术方案如下：
一种乙酰胆碱酯酶的复合固定化方法，包括如下步骤：
(1)区域打分：构建乙酰胆碱酯酶的三维结构数据，使用分子对接软件或模块将小分子分别与乙酰胆碱酯酶分子上的区域i、区域ii进行分子对接打分，获得小分子的区域i打分和区域ii打分；
(2)评估分类：计算步骤(1)中所述小分子总打分，并据此将小分子分类，分为优先类小分子、良好类小分子和淘汰类小分子；
(3)酶固定化：将步骤(2)中所述优先类小分子或良好类小分子与固定化载体表面连接，之后与乙酰胆碱酯酶孵育，即得到复合固定化乙酰胆碱酯酶。
进一步地，所述乙酰胆碱酯酶为人类乙酰胆碱酯酶，或与其氨基酸序列具有85％以上相似性的具有相似功能的人类乙酰胆碱酯酶。
进一步地，所述人类乙酰胆碱酯酶的氨基酸序列如seqidno.1所示。
步骤(1)中所述乙酰胆碱酯酶的三维结构数据来自公开数据，或通过insightii、modeller软件进行构建。
步骤(1)中所述小分子为位于固定化载体末端，且能与乙酰胆碱酯酶分子发生相互作用的分子或官能团，其分子量为50-8000da。
进一步地，所述小分子为不限于如下的种类：抗生素类、农药类、兽药类或人药类。
进一步地，所述小分子具体可以是有机磷类、甾体化合物、四环素类、酰胺类或低分子量聚合物类。
步骤(1)中所述区域i为乙酰胆碱酯酶分子上由氨基酸val330、val331、lys332、asp333、glu334、gly335、ser336、arg395、glu396、ser399、asp400、gly403、asp404、val408、val429、glu431、trp442、met443、gly444、tyr510、leu524和arg525所构成的区域。
步骤(1)中所述区域ii为乙酰胆碱酯酶分子上由氨基酸gln71、tyr72、asp74、gly82、thr83、trp86、asn87、pro88、gly120、gly121、gly122、tyr124、ser125、gly126、ala127、leu130、tyr133、gln202、ser203、ala204、ser229、gly230、trp236、trp286、val294、phe295、arg296、phe297、tyr337、phe338、tyr341、val407、trp439、met443、pro446、his447、gly448、tyr449和ile451所构成的区域。
步骤(1)中所述分子对接软件或模块为dock、3d-dock、autodock、surflex、glide、gold、flexx、z-dock、ftdock、molegrovirtualdocker或affinity分子模拟软件、模块或程序。
步骤(1)中所述分子对接打分为根据分子对接计算所得小分子与乙酰胆碱酯酶区域位点的结合常数(logka)。
步骤(2)中所述计算小分子总打分的方法为：如果小分子的区域ii打分大于等于零，则该小分子总打分等于其区域i打分减去其区域ii打分；如果小分子的区域ii打分小于零，则该小分子总打分等于其区域i打分。
步骤(2)中所述小分子分类的方法为：如果小分子总打分＞7.0，则此小分子为优先类小分子，在固定化乙酰胆碱酯酶时优先考虑和选择；如果4.5≤小分子总打分≤7.0，则此小分子为良好类小分子，在固定化乙酰胆碱酯酶时可予以考虑和选择；如果小分子总打分＜4.5，则此小分子为淘汰类小分子，在固定化乙酰胆碱酯酶时不予考虑和选择。
步骤(3)中所述固定化载体为聚合物、电极、介孔材料、纳米材料、无机材料或复合材料。
步骤(3)中小分子与固定化载体表面连接为直接的、间接的或复合型的化学连接或物理连接。
本发明的有益效果为：
1、本发明突破性地基于酶蛋白分子的三维结构信息，通过分析乙酰胆碱酯酶分子上不同区域的结构与性质差异，建立小分子筛选多位点评价方法，在分子层面设计固定化载体和固定方式，使酶的构象达到最适，最大限度保留了酶的活性。
2、固定化乙酰胆碱酯酶的稳定性得到极大提高，并可多次重复使用，其使用范围更广。
3、乙酰胆碱酯酶的固载量增大，可广泛应用于工业生产。
具体实施方式
以下实施例便于更好地理解本发明，但不限于本发明。
以下实施例选用乙酰胆碱酯酶(acetylcholineesterase，ache)，使用pdb编号为1f8u的人体乙酰胆碱酯酶分子三维晶体结构(三维晶体结构来自proteindatabankhttp://www.rcsb.org/pdb)。
基于乙酰胆碱酯酶蛋白分子的三维结构信息，通过分析乙酰胆碱酯酶分子上不同区域的结构与性质差异，在分子层面设计固定化载体和固定方式。乙酰胆碱酯酶的三维结构可以使用insightii、modeller等软件进行构建，也可以使用已有数据库中公开的酶蛋白的三维结构数据。
区域i为上述乙酰胆碱酯酶分子上由氨基酸val330、val331、lys332、asp333、glu334、gly335、ser336、arg395、glu396、ser399、asp400、gly403、asp404、val408、val429、glu431、trp442、met443、gly444、tyr510、leu524和arg525所构成的区域。
区域ii为上述乙酰胆碱酯酶分子上由氨基酸gln71、tyr72、asp74、gly82、thr83、trp86、asn87、pro88、gly120、gly121、gly122、tyr124、ser125、gly126、ala127、leu130、tyr133、gln202、ser203、ala204、ser229、gly230、trp236、trp286、val294、phe295、arg296、phe297、tyr337、phe338、tyr341、val407、trp439、met443、pro446、his447、gly448、tyr449和ile451所构成的区域。
本发明中小分子是指位于固定化载体末端、能与乙酰胆碱酯酶分子表面发生相互作用、用于连接酶蛋白与固定化载体的分子或官能团，例如但不限于如下的种类：抗生素类、农药类、兽药类、人药类，具体可以是有机磷类、甾体化合物、四环素类、酰胺类和低分子量聚合物类。
本发明制备的复合固定化乙酰胆碱酯酶的活性检测方法为：
反应体系配制(终体积0.2ml)
0.1mol/l，ph＝8.0的磷酸缓冲溶液100μl
0.75mmol/l底物(碘化硫代乙酰胆碱)50μl
酶源(调整蛋白含量在40～80μg/ml)或等酶量的固定化酶50μl
体系配制完成后在37℃下反应5min，然后加入1.8mldtnb-磷酸盐-乙醇试剂，在412nm波长下进行比色测定，调透光度到100％的空白管加入显色剂后再加入与测定管等量的酶液，以消除酶本身对光吸收的影响。
实施例1
乙酰胆碱酯酶复合固定化方法具体包括如下步骤：
(1)使用suflex-dock分子对接模块进行区域i和区域ii的小分子筛选。备选小分子来自常用有机小分子库(zinc数据库中的purchasable范围中的小分子化合物数据库，http://zinc.docking.org/)，共12520个分子。分子对接结果显示，编号为zinc18060741(cas60-09-3)的分子与乙酰胆碱酯酶的区域i打分为8.723，区域ii打分为-0.897。
(2)由于其区域ii打分小于零，zinc18060741分子的总打分为8.723，属于优先类小分子，优先用于乙酰胆碱酯酶的固定化。
(3)将15ml体积分数20％的对苯二醛乙醇溶液与2g氨基硅胶混合，30℃搅拌反应30min，沙芯漏斗过滤。将上述硅胶加入30ml乙醇，滴加20ml质量分数5％的zinc18060741乙醇溶液，于40℃搅拌反应60min。抽滤，并用20ml乙醇溶液洗涤3次，20ml水洗涤3次，制得固定化载体。将1g固定化载体分散在30ml0.1mtris-hcl缓冲溶液(ph＝7.4)中，加入1ml30u的乙酰胆碱酯酶的0.1mtris-hcl溶液，0℃搅拌反应15min，过滤并用0℃20ml0.1mtris-hcl缓冲溶液(ph＝7.4)洗涤3次，即制备得到复合固定化乙酰胆碱酯酶。
使用乙酰胆碱酯酶活性测定方法测定复合固定化乙酰胆碱酯酶的酶活性回收率为79.8％。重复10次使用，酶活性较首次使用的复合固定化酶活性可以保持76.2％以上。-18℃0.1mtris-hcl溶液存放10天，酶活性较第一天使用的复合固定化酶活性可以保持93.0％以上。
实施例2
乙酰胆碱酯酶复合固定化方法具体包括如下步骤：
(1)使用autodock分子对接模块进行区域i和区域ii的小分子筛选。备选小分子来自常用有机小分子库(zinc数据库中的purchasable范围中的小分子化合物数据库，http://zinc.docking.org/)，共12520个分子。分子对接结果显示，编号为zinc05273799(cas108608-63-5)的分子与乙酰胆碱酯酶与区域i打分为7.923，区域ii打分为0.897。
(2)由于其区域ii打分大于零，zinc05273799分子的总打分为7.026，属于优先类小分子，优先用于乙酰胆碱酯酶的固定化。
(3)将5g石英滤膜加入到3mol/l的盐酸中，于100℃搅拌反应8h，过滤，120℃干燥活化12h。活化后的5g石英滤膜，加入100ml无水甲苯，5ml3-氨丙基三乙氧基硅烷，110℃回流24h，过滤，并用20ml甲苯清洗3次。室温真空干燥6h，制成氨基石英滤膜。将20ml体积分数20％的对苯二醛乙醇溶液与3g氨基石英滤膜混合，30℃搅拌反应30min，将上述石英滤膜加入30ml乙醇，滴加20ml质量分数5％的zinc05273799乙醇溶液，于40℃搅拌反应90min。抽滤，并用20ml乙醇溶液洗涤3次，20ml水洗涤3次，制得固定化载体。将1g固定化载体放入在30ml0.1mtris-hcl缓冲溶液(ph＝7.4)中，加入1ml25u的乙酰胆碱酯酶的0.1mtris-hcl溶液，于0℃搅拌反应15min，过滤并用0℃20ml0.1mtris-hcl缓冲溶液(ph＝7.4)洗涤3次，即制备得到复合固定化乙酰胆碱酯酶。
使用乙酰胆碱酯酶活性测定方法测定复合固定化乙酰胆碱酯酶的酶活性回收率为81.7％。重复10次使用，酶活性较首次使用的复合固定化酶活性可以保持78.1％以上。-18℃0.1mtris-hcl溶液存放10天，酶活性较第一天使用的复合固定化酶活性可以保持95.6％以上。
实施例3
乙酰胆碱酯酶复合固定化方法具体包括如下步骤：
(1)使用suflex-dock分子对接模块，进行区域i和区域ii的小分子筛选。备选小分子来自常用有机小分子库(zinc数据库中的purchasable范围中的小分子化合物数据库，http://zinc.docking.org/)，共12520个分子。分子对接结果显示，编号为zinc04272010(cas538-41-0)的分子与乙酰胆碱酯酶与区域i打分为7.142，区域ii打分为1.067。
(2)由于其区域ii打分大于零，zinc04272010分子的总打分为6.075，属于良好类小分子，可用于乙酰胆碱酯酶的固定化。
(3)使用2g氨基修饰的磁性氧化碳纳米颗粒(200-400nm)。将20ml体积分数20％的对苯二醛乙醇溶液与2g氨基修饰的磁性氧化碳纳米颗粒(200-400nm)混合，30℃搅拌反应30min，磁分离出固体颗粒，加入30ml乙醇，滴加20ml质量分数5％的zinc04272010乙醇溶液，于40℃搅拌反应90min。磁分离并用20ml乙醇溶液洗涤3次，20ml水洗涤3次，制得固定化载体。将1g固定化载体放入30ml0.1mtris-hcl缓冲溶液(ph＝7.4)中，加入1ml25u的乙酰胆碱酯酶的0.1mtris-hcl溶液，于0℃搅拌反应15min，过滤并用0℃20ml0.1mtris-hcl缓冲溶液(ph＝7.4)洗涤3次，即制备得到复合固定化乙酰胆碱酯酶。
使用乙酰胆碱酯酶活性测定方法测定复合固定化乙酰胆碱酯酶的酶活性回收率为65.8％。重复10次使用，酶活性较首次使用的复合固定化酶活性可以保持63.2％以上。-18℃0.1mtris-hcl溶液存放10天，酶活性较第一天使用的复合固定化酶活性可以保持90.6％以上。
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<110>中国农业大学
<120>一种乙酰胆碱酯酶的复合固定化方法
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