丁酰胆碱酯酶两性离子聚合物缀合物的制作方法

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：1.生物清除剂有机磷化合物(op)对人体具有高毒性。二十世纪三十年代op被首次研制为杀虫剂，op对人类的极端毒性最终导致其被研制为用于战争的神经毒剂。现今，虽然op被国际法普遍禁止，但op被当成不断增加的军事和民事威胁。1995年，东京地铁系统遭到沙林袭击，造成十几名乘客死亡，其他数十人受伤。据报道，沙林气体近来已在叙利亚冲突中用于地地导弹，具有致命的效果。诸如沙林的op神经毒剂是乙酰胆碱酯酶的有效抑制剂。在脊椎动物中，乙酰胆碱是用于将信号从神经系统传递到肌肉纤维的神经递质。通常，从神经元释放乙酰胆碱以刺激肌肉。刺激后，乙酰胆碱酯酶代谢乙酰胆碱，使肌肉放松。然而，诸如沙林的op不可逆地抑制乙酰胆碱酯酶，抑制乙酰胆碱的降解。通常非常小剂量的op神经毒剂即可致死，对象通常死于某种类型的窒息。接受致死剂量op的对象可能会发生永久性神经损伤。另外，op农药还在广泛使用。虽然op农药的毒性远远低于神经毒剂，但op农药对人类的毒性仍然令人担忧。解毒剂和对op中毒的治疗非常有限。对于op中毒症状(例如震颤)存在小分子疗法。然而，总的来说，这些疗法的益处非常有限。可施用阿托品用于毒蕈碱ach受体阻断，施用地西泮用于抽搐的症状管理。leee.c.(2003)clinicalmanifestationsofsarinnervegasexposure.j.am.med.assoc.290:659–662。另外，使用2-磷定(2-pam)的肟疗法可以有效地重新激活一些op-ache加合物，但不是所有op-ache加合物。cannard,k.(2006)theacutetreatmentofnerveagentexposure.jneurolsci249:86–94。尽管这些疗法可以在毒性较小的op(如杀虫剂或非常低剂量的神经毒剂)的情况下降低死亡率，但临床医生通常认为它们对暴露于可能的战场水平的op神经毒剂高度无效。对于预防性抗op治疗，已经发现某些酶通过作为生物清除剂来解除诸如沙林的op的毒性。当预防性施用乙酰胆碱酯酶(ache)(来源于胎牛血清)，即op不可逆灭活的相同的酶时，能够保护恒河猴免受甲氟膦酸3,3-二甲基-2-丁基酯(梭曼)的ld50的二倍到五倍的攻击，梭曼是化学战争中设计的高毒性op神经毒剂。wolfe,a.d.等人,(1992)useofcholinesterasesaspretreatmentdrugsfortheprotectionofrhesusmonkeysagainstsomantoxicity.toxicol.applpharmacol.117:189-193。ache是羧酸酯酶/胆碱酯酶(ce/che)的成员，ce/che是水解多种羧酸酯的酶的多基因家族。家族成员包括ache、人羧酸酯酶1(hce1)和2(hce2)以及丁酰胆碱酯酶(buche)。其中，人们对buche作为生物清除剂产生了最大的兴趣。buche是人血清中主要的胆碱酯酶。虽然充分描述了密切相关的酶ache作为胆碱能传递的主要突触调节剂，但buche的确定的生理作用尚未得到证实。buche是催化混杂的，不仅水解乙酰胆碱(ach)，而且还水解更长链的胆碱酯(例如丁酰胆碱(其优选的底物)和琥珀酰胆碱)和各种非胆碱酯，例如乙酰水杨酸(阿司匹林)和可卡因。此外，buche结合大多数环境中存在的che抑制剂以及人造op农药和神经毒剂。然而，天然buche的生理可用水平太低，无法针对op给予任何有意义的保护。已使用从人血清纯化的buche来治疗人类。患者成功接受了部分纯化的人buche以抵消肌肉松弛剂和op农药中毒的作用。cascio,c.等人(1988)theuseofserumcholinesteraseinseverephosphorouspoisoning.minervaanestesiol(italian)54:337-345。然而，由于污染的威胁，非常不希望使用从人血清纯化的产品，该未知血源性病原体当然是不能测试的。在这方面，例如，现今通过重组dna技术生产了用于治疗血友病的fviii，并且在70年代末和80年代初数千名患者感染hiv病毒之后，不再从人血清中纯化fviii。此外，血清纯化的buche的生产受到可用血清体积的限制。lockridge,o.等人，(2005)j.med.chem.biol.radiol.def.3:nimhs5095。为了避免使用血清纯化的buche，在大肠杆菌中生产重组buche(rbuche)。masson,p.(1992)inmultidisciplinaryapproachestocholinesterasefunctions,edsshafferman,a.,velan,b.(plenum，纽约)pp49-52。然而，产生的蛋白是无功能的。也可以在哺乳动物293t(altamirano，c.v.和lockridge，o.(1999)chem.biol.interact.119-120:53-60)和cho(millard，c.b.,lockridge，o.，和broomfield，c.a.(1995)biochemistry34:15925-15933)中生产rbuche。然而，哺乳动物表达系统不能产生足够量的蛋白，使得可以消除对血浆纯化的buche的需要。鉴于哺乳动物细胞表达系统遇到的困难，产生转基因山羊，其具有在山羊β-酪蛋白启动子控制下的人buche基因，从而可以从山羊乳中纯化产生的rbuche。huang,y.j.等人，(2007)recombinanthumanbutyrylcholinesterasefrommilkoftransgenicanimalstoprotectagainstorganophosphatepoisoning.proc.nat.acad.sci.104(34):13603-13608。然而，当在动物中测试转基因山羊rbuche时，酶本身以及与peg缀合的酶的pk和生物利用度结果非常令人失望。转基因山羊中产生的rbuche并不明显具有与从血浆纯化的天然人buche相似的停留时间以使其可以被研制为预防op中毒的药剂。因此，仍然需要可以被大量生产并具有良好的pk性质的buche重组形式和相关生物清除剂。2.碘乙酰胺缀合由于第一种重组胰岛素产品在1982年被批准，蛋白治疗剂和肽治疗剂已被成功地用作治疗各种病理生理学疾病的非常有效的药物。这些药物的发展受到过去几十年重组dna技术的进步的推动。蛋白治疗剂通常分为两类：(1)模拟天然蛋白并用作替代物的生物药物，例如胰岛素，和(2)用作各种途径的激动剂或拮抗剂的单克隆抗体，例如虽然蛋白治疗剂在疾病改善和销售方面都取得了巨大的成功，但已观察到许多治疗剂具有次优的物理化学性质和药代动力学性质。蛋白治疗剂的主要缺点是物理化学不稳定性、溶解度有限、蛋白水解不稳定、消除半衰期短、免疫原性和毒性。提高蛋白治疗剂的药代动力学性质的一种方法是蛋白与生物聚合物的缀合。在这方面，迄今为止已经批准了十几种聚乙二醇(peg)缀合物，例如已观察到蛋白聚乙二醇化的各种益处，包括：改善药物溶解度、降低剂量频率而不降低功效且可能降低毒性、延长循环寿命、增加的药物稳定性以及对蛋白水解降解的抗性更高。还观察到聚乙二醇化的商业利益，包括新的递送形式和给药方案的机会。此外，由于聚乙二醇化产生新的化学实体，因此存在更多专利保护的机会。历史上，已经开发了大多数peg化试剂以利用蛋白上易于获得的胺官能团。根据定义氨基存在于所有蛋白质中(即氨基末端)，并且在绝大多数蛋白中存在多于一个氨基，例如lys贡献的氨基。胺缀合的peg蛋白已获得监管部门的批准。alconel,s.n.s.,baas,a.s.和maynard,h.d.(2011)fda-approvedpoly(ethyleneglycol)-proteinconjugatedrugs.polym.chem.2(7),1442。至少两种胺peg蛋白缀合物是一线疗法。foster,g.r.(2010)pegylatedinterferonsforthetreatmentofchronichepatitisc:pharmacologicalandclinicaldifferencesbetweenpeginterferon-2aandpeginterferon-2b.drugs70(2),147-165；piedmonte,d.m.和treuheit,m.j.(2008)formulationofneulasta(pegfilgrastim).adv.drugdeliveryrev.60,50-58。然而，存在与胺共轭相关的许多问题。特定的与胺缀合的试剂通常是低效的，这是由于试剂(例如peg-n-羟基琥珀酰亚胺酯)的竞争水解反应或亚胺形成过程中的不利平衡，而亚胺形成是还原胺化缀合所必需的。wang,x.,kumar,s.和singh,s.(2011)disulfidescramblinginigg2monoclonalantibodies:insightsfrommoleculardynamicssimulations.pharm.res.28,3128-3143。此外，大多数蛋白具有可用于反应的几个胺残基。因此，胺peg缀合物往往不是位点特异性的，导致最终产物为不同peg-蛋白缀合物的非均匀混合物。veronese,f.(2001)peptideandproteinpegylationareviewofproblemsandsolutions.biomaterials22(5),405-17；luxon,b.a.,grace,m.,brassard,d.,和bordens,r.(2002)pegylatedinterferonsforthetreatmentofchronichepatitiscinfection.clin.ther.24(9)1363-1383。与通过蛋白质氨基的peg缀合相关的各种缺点导致开发通过半胱氨酸将蛋白peg化的方法。实际上，通过cys的聚合物缀合是今天研究人员采用的主要方法之一。roberts,m.j.和harris,b.j.m.(2002)chemistryforpeptideandproteinpegylation.adv.drugdel.rev.54,459-576；stenzel,m.h.(2012)bioconjugationusingthiols:oldchemistryrediscoveredtoconnectpolymerswithnature’sbuildingblocks.acsmacroletters2,14-18。蛋白质表面游离半胱氨酸的数量远低于赖氨酸。如果缺乏游离半胱氨酸，则可以通过基因工程添加一个或多个游离半胱氨酸。goodson,r.j.和katre,n.v.(1990)site-directedpegylationofrecombinantinterleukin-2atitsglycosylationsite.biotechnology8,343-46。已经开发了各种化学物质用于通过半胱氨酸将聚合物与蛋白缀合，包括烷基卤化物、酯丙烯酸酯和乙烯基砜试剂。但最常见的共轭基团是马来酰亚胺。roberts,m.j.,bentley,m.d.和harris,j.m.(2002)chemistryforpeptideandproteinpegylation.adv.drugdel.rev.54,459。马来酰亚胺试剂与硫醇基团有效反应以在中性ph下提供缀合物，降低与蛋白变性相关的风险。马来酰亚胺缀合已用于临床批准的peg药物。goel,n.和stephens,s.(2010)certolizumabpegol.mabs2(2),137-47。马来酰亚胺也被用于一些批准的非peg缀合物中。参见例如gualberto,a.(2012)brentuximabvedotin(sgn-35),anantibody-drugconjugateforthetreatmentofcd30-positivemalignancies.expertopin.invest.drugs21(2),205-16。虽然已经批准了几种基于马来酰亚胺的产物，但已知一些马来酰亚胺-硫醇缀合物是不稳定的。在这方面，已观察到基于马来酰亚胺的缀合物可以进行交换反应。baldwin,a.d.和kiick,k.l.(2011)tunabledegradationofmaleimide-thioladductsinreducingenvironments.bioconjugatechem.22(10),1946-53；baldwin,a.d.和kiick,k.l.(2012)reversiblemaleimide-thioladductsyieldglutathione-sensitivepoly(ethyleneglycol)-heparinhydrogels.polym.chem.4(1),133。此外，已经检测到有关内源性蛋白的交换产品。alley,s.c.,benjamin,d.r.,jeffrey,s.c.,okeley,n.m.,meyer,d.l.,sanderson,r.j.和senter,p.d.(2008)contributionoflinkerstabilitytotheactivitiesofanticancerimmunoconjugates.bioconjugatechem.19,759-65；shen,b.q.等人，(2012)conjugationsitemodulatestheinvivostabilityandtherapeuticactivityofantibody-drugconjugates.naturebiotechnol.30(2),184-89。由于已知马来酰亚胺缀合物在某些情况下是不稳定的，所以采用了替代缀合策略。roberts,m.j.和harris,b.j.m.(2002)chemistryforpeptideandproteinpegylation.adv.drugdel.rev.54,459-576。这些替代方法之一是使用以下所示的基于碘乙酰胺的缀合剂：peg-碘乙酰胺通过亲核取代与游离硫醇反应，产生稳定的硫醚键。硫醚连接比使用马来酰亚胺化学制备的相应结构更稳定。碘乙酰胺与硫醇的反应对ph具有依赖性。硫醇通常仅以硫醇盐阴离子形式烷基化。lindley,h.(1960)astudyofthekineticsofthereactionbetweenthiolcompoundsandchloroacetamide.biochem.j.74,577-84。cys中硫醇的pk值一般在8.5+/-0.5左右，但是当硫醇与碘乙酰胺部分缀合时，该pk值取决于天然蛋白中cys的环境。kallis,g.和holmgren,a.(1980)differentialreactivityofthefunctionalsulfhydrylgroupsofcysteine-32andcysteine-35presentinthereducedformofthioredoxinfromescherichiacoli.j.bio.chem.255(21)10261-10266。kallis和holmgren观察到具有约8.5的正常pk的cys残基不容易用碘乙酰胺酰化或在中性ph下不容易用碘乙酸烷基化。仅在升高的ph值下观察到这些正常硫醇的快速反应。本领域公知将蛋白暴露于高ph值通常导致蛋白变性。暴露于碱性或高ph值的蛋白的变性是高度蛋白依赖性的。几种蛋白可以暴露于高ph下而不变性。然而，许多是永久变性的，从而导致活性和/或结合能力的丧失。因此，仍然需要在生理ph值下使用碘乙酰胺缀合将聚合物与蛋白缀合的方法。技术实现要素：本发明提供了缀合物，其包含选自化学计量的有机磷(op)生物清除剂和与两性离子聚合物共价结合的催化op生物清除剂的有机磷生物清除剂，其中所述聚合物包含一种或多种类型的单体单元，并且其中至少一种类型的单体单元包含两性离子基团。任选地，op生物清除剂为选自芳基二烷基磷酸酶、有机磷酸酯水解酶(oph)、羧酸酯酶、三酯酶(triesterase)、磷酸三酯酶、芳基酯酶、对氧磷酶(pon)、有机磷酸酐酶和二异丙基氟磷酸酶(dfpases)的催化生物清除剂。任选地，op生物清除剂为包含选自乙酰胆碱酯酶(ache)和丁酰胆碱酯酶(bche)的胆碱酯酶的化学计量的op生物清除剂。任选地，胆碱酯酶由血浆纯化而来。任选地，胆碱酯酶通过重组dna技术制备。任选地，胆碱酯酶为丁酰胆碱酯酶。任选地，丁酰胆碱酯酶与非丁酰胆碱酯酶蛋白融合为融合蛋白。任选地，非丁酰胆碱酯酶蛋白包含免疫球蛋白(ig)结构域。任选地，ig结构域选自igg-fc、igg-ch和igg-cl。任选地，igg为igg1。任选地，ig结构域为igg-fc(seqidno.8)。任选地，fc结构域在选自e233、l234、l235、g236、g237、a327、a330和p331的一个或多个位置处具有氨基酸取代。任选地，fc结构域具有以下取代：l234a、l235e、g237a、a330s和p331s。任选地，fc结构域还具有以下取代中的一种：q347c或l443c。任选地，取代为q347c。任选地，融合蛋白还包含丁酰胆碱酯酶和非丁酰胆碱酯酶蛋白之间的接头。任选地，接头选自g、gg、ggggs(seqidno.22)、gggs(seqidno.23)和ggges(seqidno.24)，以及上述接头的低聚物。任选地，接头选自gggsgggsgggs(seqidno.21)和ggsgggsgggs(seqidno.25)。任选地，丁酰胆碱酯酶为羧基截短物。任选地，丁酰胆碱酯酶包含seqidno.1的氨基酸29-561或由其组成。任选地，丁酰胆碱酯酶包含seqidno.1的氨基酸29-562或由其组成。任选地，丁酰胆碱酯酶具有突变，其中seqidno.1的残基94的c为y。任选地，丁酰胆碱酯酶融合物具有seqidno.2所示的氨基酸序列。在任何上述缀合物中，两性离子基团可以包含磷酸胆碱。任选地，至少一种类型的单体单元包含2-(丙烯酰氧基乙基)-2'-(三甲基铵乙基)磷酸酯。任选地，至少一种类型的单体单元包含2-(甲基丙烯酰氧基乙基)-2'-(三甲基铵乙基)磷酸酯(hema-pc)。任选地，聚合物具有3个或更多个臂。任选地，聚合物具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个臂。任选地，聚合物具有3、6或9个臂。任选地，缀合物的聚合物部分具有300,000-1,750,000道尔顿的峰值分子量。任选地，缀合物的聚合物部分具有500,000-1,000,000道尔顿的峰值分子量。任选地，缀合物的聚合物部分具有600,000-800,000道尔顿的峰值分子量。任选地，聚合物共价键合到所述胆碱酯酶的氨基、羟基、巯基和羧基中的至少一个。任选地，巯基来自胆碱酯酶中的半胱氨酸残基。任选地，半胱氨酸残基位于胆碱酯酶中天然无半胱氨酸存在的位置。任选地，胆碱酯酶为对应于seqidno.2的丁酰胆碱酯酶融合物，半胱氨酸残基为氨基酸672处的半胱氨酸残基。任选地，丁酰胆碱酯酶包含seqidno.1的氨基酸29-562或由其组成。任选地，残基94为酪氨酸。任选地，丁酰胆碱酯酶还包含通过重组dna工程引入的半胱氨酸残基。任选地，根据权利要求41的丁酰胆碱酯酶包含seqidno.13。本发明还提供了包含丁酰胆碱酯酶和非丁酰胆碱酯酶蛋白的丁酰胆碱酯酶融合蛋白。任选地，非丁酰胆碱酯酶蛋白包含免疫球蛋白(ig)结构域。任选地，ig结构域选自igg-fc、igg-ch和igg-cl。任选地，igg为igg1。任选地，igg1结构域为igg1-fc(seqidno.8)。任选地，fc结构域在选自e233、l234、l235、g236、g237、a327、a330和p331的一个或多个位置具有氨基酸取代。任选地，fc结构域具有以下取代：l234a、l235e、g237a、a330s和p331s。任选地，fc结构域还具有以下取代之一：q347c或l443c。任选地，取代为q347c。任选地，融合蛋白需要丁酰胆碱酯酶和非丁酰胆碱酯酶蛋白之间的接头。任选地，接头选自g、gg、ggggs(seqidno.22)、gggs(seqidno.23)和ggges(seqidno.24)以及上述接头的低聚物。任选地，接头选自gggsgggsgggs(seqidno.21)和ggsgggsgggs(seqidno.25)。任选地，丁酰胆碱酯酶为羧基截短物。任选地，丁酰胆碱酯酶包含seqidno.1的氨基酸29-561或由其组成。任选地，丁酰胆碱酯酶包含seqidno.1的氨基酸29-562或由其组成。任选地，丁酰胆碱酯酶具有突变，其中seqidno.1的残基94处的c为y。任选地，融合蛋白具有seqidno.2所示的氨基酸序列。本发明还提供了治疗或预防op中毒的方法，其包括向患者施用有效量的任一项前述权利要求中的任何缀合物或融合蛋白。任选地，缀合物通过静脉内给药、皮下给药、肌内给药、病灶内给药或皮内给药来施用。任选地，缀合物通过肌内给药施用。本发明还提供了一种针对op中毒进行长期预防的方法，其包括在预期暴露于op化合物前至少7天施用缀合物，所述缀合物包含选自化学计量的有机磷(op)生物清除剂和与两性离子聚合物共价结合的催化op生物清除剂的有机磷生物清除剂，其中所述聚合物包含一种或多种类型的单体单元，并且其中至少一种类型的单体单元包含两性离子基团。任选地，op化合物为op农药或op神经毒剂。任选地，缀合物在预期暴露于op神经毒剂之前至少14天施用。任选地，缀合物在预期暴露于op神经毒剂之前至少21天施用。任选地，缀合物在预期暴露于op神经毒剂之前至少30天施用。本发明还提供了一种用于快速预防op中毒的方法，其包括在预期暴露于op化合物之前至少12小时施用缀合物，所述缀合物包含选自化学计量的有机磷(op)生物清除剂和与两性离子聚合物共价结合的催化op生物清除剂的有机磷生物清除剂，其中所述聚合物包含一种或多种类型的单体单元，并且其中至少一种类型的单体单元包含两性离子基团。任选地，op化合物为op农药或op神经毒剂。任选地，缀合物在预期暴露于op神经毒剂之前至少24小时施用。任何上述方法可以包括施用选自氨基甲酸酯、抗毒蕈碱、胆碱酯酶再激活剂和抗惊厥药物的另一种药剂。本发明还提供了一种用于聚合物合成的引发剂，其包含其中l1为第一接头，l2为第二接头，l3为第三接头，其中l1、l2和l3相同或不同，并且各自选自-c1-c12烷基-、-c3-c12环烷基-、(-(ch2)1-6-o-(ch2)1-6-)1-12-、(-(ch2)1-4-nh-(ch2)1-4)1-12-、-(ch2)1-12o-、(-(ch2)1-4-o-(ch2)1-4)1-12-o-、-(ch2)1-12-(co)-o-、-(ch2)1-12-(co)-nh-、-(ch2)1-12-o-(co)-、-(ch2)1-12-nh-(co)-、(-(ch2)1-4-o-(ch2)1-4)1-12-o-(ch2)1-12-、-(ch2)1-12-(co)-o-(ch2)1-12-、-(ch2)1-12-(co)-nh-(ch2)1-12-、-(ch2)1-12-o-(co)-(ch2)1-12-、-(ch2)1-12-nh-(co)-(ch2)1-12-、-(c3-c12环烷基)-、-(c1-c8烷基)-(c3-c12环烷基)-、-(c3-c12环烷基)-(c1-8烷基)-、-(c1-8烷基)-(c3-c12环烷基)-(c1-8烷基)-、-nh-(ch2ch2-o-)1-20-nh-(ch2ch2-o-)1-20-和-(ch2)0-3-芳基-(ch2)0-3-、键以及以上的任意组合；r1和r2相同或不同，并且选自h(条件为r1和r2不都是h)和一个或多个碱性基团，其中碱性基团选自其中r6、r7、r8、r9和r10相同或不同，并且选自键、h、氨基、芳基6-12和烷基1-6；其中r11和r12相同或不同，并且选自键、h、芳基6-12和烷基1-6；其中r13、r14、r15、r16和r17相同或不同，并且选自键、h、氨基、芳基6-12和烷基1-6以及一个或多个精氨酸残基；且r3、r4和r5相同或不同，并且选自：其中y为ncs、f、cl、br或i。任选地，y为br。任选地，r3、r4和r5各自为任选地，r3、r4和r5各自为任选地，r4、r5和r6各自为任选地，l3为键，r2为h，r1为任选地，l2为-(ch2)1-6-。任选地，l2为-(ch2)3-。本发明还提供了一种聚合方法，其包括：在存在以下物质的条件下聚合一种或多种可自由基聚合的单体：包含可被自由基可转移原子或基团均匀裂解的键的引发剂；过渡金属化合物；和选自以下物质的配体：其中r6、r7、r8、r9和r10相同或不同，并且选自键、h、氨基、芳基6-12和烷基1-6；其中r11和r12相同或不同，并且选自键、h、芳基6-12和烷基1-6；其中r13、r14、r15、r16和r17相同或不同，并且选自键、h、氨基、芳基6-12和烷基1-6以及一个或多个精氨酸残基；其中所述配体与所述过渡金属化合物配位，并且其中所述过渡金属化合物和所述配体匹配以引发和促进(propagate)所述单体的聚合。任选地，配体与引发剂共价连接以形成单分子引发剂配体。任选地，所述单分子引发剂配体具有以下结构：其中l1为第一接头，l2为第二接头，l3为第三接头，其中l1、l2和l3相同或不同，并且各自选自-c1-c12烷基-、-c3-c12环烷基-、(-(ch2)1-6-o-(ch2)1-6-)1-12-、(-(ch2)1-4-nh-(ch2)1-4)1-12-、-(ch2)1-12o-、(-(ch2)1-4-o-(ch2)1-4)1-12-o-、-(ch2)1-12-(co)-o-、-(ch2)1-12-(co)-nh-、-(ch2)1-12-o-(co)-、-(ch2)1-12-nh-(co)-、(-(ch2)1-4-o-(ch2)1-4)1-12-o-(ch2)1-12-、-(ch2)1-12-(co)-o-(ch2)1-12-、-(ch2)1-12-(co)-nh-(ch2)1-12-、-(ch2)1-12-o-(co)-(ch2)1-12-、-(ch2)1-12-nh-(co)-(ch2)1-12-、-(c3-c12环烷基)-、-(c1-c8烷基)-(c3-c12环烷基)-、-(c3-c12环烷基)-(c1-8烷基)-、-(c1-8烷基)-(c3-c12环烷基)-(c1-8烷基)-、-nh-(ch2ch2-o-)1-20-nh-(ch2ch2-o-)1-20-和-(ch2)0-3-芳基-(ch2)0-3-，键以及以上的任意组合；r1和r2相同或不同，并且选自h(条件为r1和r2不都是h)和一个或多个碱性基团，其中碱性基团选自其中r6、r7、r8、r9和r10相同或不同，并且选自键、h、氨基、芳基6-12和烷基1-6；其中r11和r12相同或不同，并且选自键、h、芳基6-12和烷基1-6；其中r13、r14、r15、r16和r17相同或不同，并且选自键、h、氨基、芳基6-12和烷基1-6以及一个或多个精氨酸残基；且r3、r4和r5相同或不同，并且选自：其中y为ncs、f、cl、br或i。任选地，y为br。任选地，r3、r4和r5各自为任选地，r3、r4和r5各自为任选地，r4、r5和r6各自为任选地，l3为键，r2为h，r1为任选地，l2为-(ch2)1-6-或-(ch2)3-。任选地，可自由基聚合的单体为烯属不饱和单体。任选地，不饱和单体包括hema-pc。任选地，过渡金属为低价态过渡金属或与至少一种不带电配位配体配位的过渡金属中的一种，并且其中过渡金属包含抗衡离子。任选地，过渡金属选自铜、铁、镍或钌。附图说明图1显示来源于血浆的hbuche的随时间变化的活性与储存在食蟹猴血浆中的下述物质随着时间变化的活性的对比：来自转基因山羊乳的全长rhbuche、rbuche534ggc(c66y)和rhbuche534(c66y)-fc(l234a、l235e、g237a、a330s、p331s和q347c)。图2描绘了活性-时间曲线，其中在食蟹猴血浆中在4℃和37℃的条件下将与9臂750kdahema-pc聚合物缀合的rhbuche534(c66y)-fc(l234a、l235e、g237a、a330s、p331s和q347c)与来源于人血浆的buche进行对比。图3显示未缀合的rhbuche534(c66y)-fc(l234a、l235e、g237a、a330s、p331s和q347c)、与3臂500kdampc聚合物缀合的rhbuche534(c66y)-fc(l234a、l235e、g237a、a330s、p331s和q347c)、与9臂750kdampc聚合物缀合的rhbuche534(c66y)-fc(l234a、l235e、g237a、a330s、p331s和q347c)以及来源于血浆的hbuche在注入小鼠后随时间(小时)变化的归一化活性(个位×106)。图4显示了通过碘乙酰胺和马来酰亚胺与mpc聚合物缀合的来自转基因山羊乳的全长rhbuche的稳定性曲线。图5显示了具有改性(r1)碘乙酰胺部分的3臂250kdampc聚合物。详细描述i.综述本发明提供具有亲水基团或两性离子的高分子量(mw)聚合物，例如磷酸胆碱。本发明还提供了用于制备高分子量聚合物的方法和新的起始物料。本发明还提供了高分子量聚合物和胆碱酯酶的缀合物。wo2011/130694和wo/2007/100902通过引用并入本文用于所有目的。ii.定义“胆碱酯酶”(che)是指参与神经脉冲传递的一系列酶。胆碱酯酶催化乙酰胆碱在胆碱能突触的水解。胆碱酯酶包括但不限于乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶。提及的胆碱酯酶(包括乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶)包括前体胆碱酯酶和成熟胆碱酯酶(例如其中信号序列已被除去的胆碱酯酶)，其具有活性的截短形式，并且包括等位基因变体和物种变体、由剪接变体编码的变体和其他变体，包括与引用的seqidno所示的多肽具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的或更高的序列同一性的多肽。变体表现出op灭活活性。胆碱酯酶还包括含有化学修饰或转录后修饰的胆碱酯酶，以及不含化学修饰或转录后修饰的胆碱酯酶。这些修饰包括但不限于聚乙二醇化、聚(hema-pc)的添加、白蛋白化(albumination)、糖基化、法尼基化、羧化、羟基化、磷酸化和本领域已知的其他多肽修饰。截短的胆碱酯酶是其任何n-或c-末端缩短形式，特别是被截短并具有op失活活性的形式。“乙酰胆碱酯酶”(ache)是指能够水解乙酰酯(包括乙酰胆碱)并且其催化活性被化学抑制剂bw284c51抑制的酶或多肽。乙酰胆碱酯酶包括但不限于来源于血浆的乙酰胆碱酯酶或重组乙酰胆碱酯酶。乙酰胆碱酯酶包括人乙酰胆碱酯酶和任何非人来源的乙酰胆碱酯酶，包括但不限于大鼠乙酰胆碱酯酶、小鼠乙酰胆碱酯酶、猫乙酰胆碱酯酶、鸡乙酰胆碱酯酶、兔乙酰胆碱酯酶和牛乙酰胆碱酯酶。示例性人乙酰胆碱酯酶包括seqidno.3所示的人ache。乙酰胆碱酯酶可以是任何形式，包括但不限于单体、二聚体和四聚体形式。“丁酰胆碱酯酶”(buche)是指能够水解乙酰胆碱和丁酰胆碱并且其催化活性被化学抑制剂四异丙基焦磷酰胺(iso-ompa)抑制的酶或多肽。丁酰胆碱酯酶包括但不限于来源于血浆的丁酰胆碱酯酶或重组丁酰胆碱酯酶。丁酰胆碱酯酶包括任何非人类来源的丁酰胆碱酯酶，其来源包括但不限于大鼠、小鼠、猫、马、鸡、猪、兔和牛。丁酰胆碱酯酶还包括人源的丁酰胆碱酯酶。示例性的人丁酰胆碱酯酶包括seqidno.1所示的人buche。丁酰胆碱酯酶可以是任何形式，包括但不限于单体、二聚体和四聚体形式。在本文中可互换使用的“有机磷化合物”、“有机磷酸酯化合物”、“op化合物”和“op”是指含有磷酰中心并且还含有一个或多个酯键的化合物。在一些方面，磷酰中心处的磷酸酯键和/或其他共价键的类型将有机磷化合物分类。有机磷化合物包括有机磷农药和有机磷神经毒剂。“有机磷神经毒剂”、“有机磷酸酯神经毒剂”或“op神经毒剂”是指例如通过抑制乙酰胆碱酯酶的作用破坏生物体神经系统功能的化合物。神经毒剂通常通过化学合成制备，且如果被吸入、吸收、摄入或以其他方式遭遇，神经毒剂具有高毒性，神经毒剂可以是任何有机磷化合物，包括但不限于g型神经毒剂和v型神经毒剂。示范性有机磷神经毒剂包括塔崩(ga)、沙林(gb)、梭曼(gd)、环沙林(gf)、vx、俄罗斯vx(vr)和分类的非传统神经毒剂(nta)。“有机磷农药”、“有机磷酸酯农药”或“op农药”是指可以用作农药或杀虫剂来消灭害虫和昆虫的有机磷化合物。有机磷农药可以是任何有机磷农药，包括但不限于乙酰甲胺磷、甲基谷硫磷、地散磷、硫线磷、氯氧磷(chlorethoxyfos)、毒死蜱、甲基毒死蜱、虫螨磷、蝇毒磷、氯亚胺硫磷(dialifor)、二嗪磷(diazinon)、敌敌畏(ddvp)、百治磷(dierotophos)、乐果(dimethoate)、敌杀磷(dioxathion)、乙拌磷(disulfoton)、乙硫磷、灭克磷(ethoprop)、乙基对硫磷(ethylparathion)、克线磷(fenamiphos)、杀螟硫磷(fenitrothion)、倍硫磷(fenthion)、地虫磷(fonofos)、甲基氯唑磷(isazophosmethyl)、异硫磷(isofenphos)、马拉硫磷(malathion)、甲胺磷(methamidophos),杀扑磷(methidathion)、甲基对硫磷(methylparathion)、速灭磷(mevinphos)、久效磷(monocrotophos)、二溴磷(naled)、砜吸磷(oxydemetonmethyl)、甲拌磷(phorate)、伏杀磷(phosalone)、亚胺硫磷(phosmet)、磷胺(phosphamidon)、phostebupirim、安定磷(pirimiphosmethyl)、丙溴磷(profenofos)、烯虫磷(propetamphos)、硫特普(sulfotepp)、硫丙磷(sulprofos)、双硫磷(temephos)、特丁磷(terbufos)、杀虫畏(tetraehlorvinphos)、脱叶磷(tribufos,jdef)和敌百虫(trichlorfon)。“有机磷中毒”或“op中毒”是指对暴露于有机磷化合物(例如有机磷神经毒剂或有机磷农药)的生物的有害或不良影响。“胆碱能毒性”是指通过神经毒剂对乙酰胆碱酯酶的抑制、神经递质乙酰胆碱的积累以及对副交感神经、交感神经、运动系统和中枢神经系统的伴随作用而实现的毒性。胆碱能毒性可导致肌病、精神病、一般麻痹和死亡。暴露症状包括抽搐、颤抖、分泌过多、呼吸瘫痪、惊厥、最终死亡。可以通过测量血浆中的循环(活性)胆碱酯酶水平来监测胆碱能毒性。通常只有当由于神经毒剂的结合，胆碱酯酶活性低于正常水平的20％时，才会发生致死。“有机磷暴露相关损伤”是指例如由于胆碱能毒性对生理功能(如运动功能和认知功能)造成的短期(例如，暴露后几分钟至数小时)和长期(例如，暴露后一周至几年)损伤。有机磷暴露相关损伤可以由以下临床症状体现，临床症状包括但不限于头痛、弥漫性肌肉绞痛、虚弱、分泌过多、恶心、呕吐和腹泻。病情可能发展为癫痫发作、昏迷、麻痹、呼吸衰竭、迟发性神经病、肌肉无力、震颤、惊厥，永久性脑部畸形、社会/行为缺陷和一般胆碱能危象(例如可以通过加重炎症和低血细胞计数体现)。极端情况可导致中毒患者死亡。“有机磷生物清除剂”或“有机磷酸酯生物清除剂”或“op生物清除剂”是能够结合或水解有机磷化合物的酶，包括有机磷农药和有机磷神经毒剂。有机磷生物清除剂包括但不限于胆碱酯酶、芳基二烷基磷酸酶、有机磷酸酯水解酶(oph)、羧酸酯酶、三酯酶、磷酸三酯酶、芳基酯酶、对氧磷酶(pon)、有机磷酸酶和二异丙基氟磷酸酶(dfpases)。有机磷生物清除剂可以是化学计量的有机磷生物清除剂或催化有机磷生物清除剂。“化学计量的有机磷生物清除剂”或“化学计量的op生物清除剂”是指下述的酶：该酶每个活性位点以1:1的化学计量比与有机磷化合物结合。化学计量的op生物清除剂包括但不限于胆碱酯酶，如乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶。“催化有机磷生物清除剂”或“催化op生物清除剂”是指水解有机磷化合物的酶。催化op生物清除剂包括但不限于芳基二烷基磷酸酶、有机磷酸酯水解酶(oph)、羧酸酯酶、三酯酶、磷酸三酯酶、芳基酯酶、对氧磷酶(pon)、有机磷酸酐和二异丙基磷酸酶(dfpases)，上述酶包括引入其中的重组突变以增加其水解op化合物的能力。“芳基二烷基磷酸酶”是指使有机磷化合物失活或水解的天然存在的酶或重组酶。芳基二烷基磷酸酶(ec3.1.8.1)是一类能够水解宽范围的有机磷化合物的金属依赖性op水解酶。芳基二烷基磷酸酶需要二价金属离子(如zn2+、mn2+、co2+或cd2+)来实现其酶活性。芳基二烷基磷酸酶包括但不限于磷酸三酯酶或op水解酶(pte或oph)、对氧磷水解酶或对氧磷酶、对硫磷水解酶(ph)、opda、羧酸酯酶、三酯酶、磷酸三酯酶和芳基酯酶。芳基二烷基磷酸酶包括但不限于来自缺陷假单胞菌(pseudomonasdiminuata)mg、黄杆菌属(flavobacteriumsp.)、邻单胞菌属(plesiomonassp.)菌株m6、变铅链霉菌(streptomyceslividans)和放射性土壤杆菌(agrobacteriumradiobacter)的有机磷酸水解酶；来自伯克霍尔德氏杆菌属jba3、缺陷假单胞菌mg、缺陷短波单胞菌(brevundiomonasdiminuta)、黄杆菌属菌株atcc27552和嗜酸热硫化叶菌(sulfolobusacidocaldarius)的对硫磷水解酶；和来自枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)wb800以及邻单胞菌属菌株m6的甲基对硫磷水解酶(mph)。示例性的芳基二烷基磷酸酶包括但不限于seqidno.5所示的芳基二烷基磷酸酶。提及的芳基二烷基磷酸酶包括芳基二烷基磷酸酶的具有活性的截短形式，并且包括等位基因变体和物种变体、由剪接变体编码的变体和其他变体，其他变体包括与上述多肽和seqidno.5所示的多肽具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性的多肽。变异体显示op灭活活性。对氧磷酶是指使有机磷化合物失活或水解的天然存在的酶或重组磷酶。对氧磷酶包括但不限于天然或重组对氧磷酶。非人对氧磷酶包括但不限于来自兔、小鼠、大鼠、猪、牛、鸡、火鸡和狗的对氧磷酶。示例性对氧磷酶包括但不限于人对氧磷酶，包括pon1(seqidno.6)。提及的对氧磷酶包括其具有活性的截短形式，并且包括等位变体和物种变体、由剪接变体编码的变体和其他变体，其他变体包括与seqidno.6所示的多肽具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的多肽。变体表现出op灭活活性。对氧磷酶还包括那些含有化学修饰或翻译后修饰的对氧磷酶和那些不含化学修饰或翻译后修饰的对氧磷酶。这样的修饰包括但不限于聚乙二醇化、白蛋白化、糖基化、法尼基化、羧化、羟基化、磷酸化和本领域已知的其他多肽修饰。“二异丙基氟磷酸酶”是指使有机磷化合物失活或水解的天然存在的酶或重组酶。二异丙基氟磷酸酶包括但不限于从来自欧洲乌贼(loligovulgaris)、交替单胞菌属(alteromonassp.)、游海假交替单胞菌(pseudoalteromonashaloplanktis)、地中海海单胞菌(marinomonasmediterranea)、加州海兔(aplysiacalifornica)、欧洲章鱼(octopusvulgaris)和大鼠衰老标记蛋白30的二异丙基氟磷酸酶；和来自分枝杆菌属(streptomycessp)、地中海拟无枝酸菌(amycolatopsismediterranei)、天蓝色链霉菌(streptomycescoelicolor)、链霉菌属(streptomycessp)aa4)、sividus链霉菌(streptomycessividus)tk24、sviceus链霉菌(streptomycessviceus)和灰霉链霉菌(streptomycesgriseoalthiacus)m045的有机磷酸酐水解酶。示例性的二异丙基氟磷酸酶和有机磷酸酐水解酶包括但不限于来自欧洲乌贼的二异丙基氟磷酸酶，其示于seqidno.7。提及的二异丙基氟磷酸酶包括其具有活性的截短形式，并且包括等位变体和物种变体、由剪接变体编码的变体和其他变体，其他变体包括与seqidno.7所示的多肽具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的多肽。变体表现出op灭活活性。“氨基甲酸酯”是指作为胆碱酯酶的氨基甲酸酯抑制剂的任何化合物。示例性氨基甲酸酯为溴化吡啶斯的明。“抗毒蕈碱”是指作为毒蕈碱受体的竞争性拮抗剂的任何化合物，包括毒蕈碱型乙酰胆碱受体。示例性的抗毒蕈碱素是阿托品。“胆碱酯酶再活化剂”是指从胆碱酯酶释放结合的有机磷化合物的任何化合物。胆碱酯酶再活化剂包括胆碱再活化肟，包括吡啶鎓和双吡啶鎓乙醛肟，包括但不限于磷定、双解磷(trimedoxime)、双复磷(obidoxime)和hi-6、甲肟和地西泮。“抗惊厥”是指防止或逆转癫痫的任何化合物。“缀合物”是指直接或间接连接至一个或多个化学部分(如聚合物)的多肽。“融合蛋白”是指由包含来自一个核酸分子的编码序列和来自另一核酸分子的编码序列的核酸序列编码的多肽，其中编码序列在相同的阅读框中，使得当融合构建体在宿主细胞中转录并翻译时，产生含有两种蛋白质的蛋白质。两个分子可以在构建体中相邻或由包含1、2、3或更多但通常少于25、20、15、10、9、8、7或6个氨基酸的接头多肽分离。由融合构建体编码的蛋白质产物称为融合多肽或蛋白质。融合蛋白可以具有在两种蛋白质之间连接的肽或蛋白质。“半衰期”或“消除半衰期”或“t1/2”是指任何指定的性质或活性减少一半所需的时间。例如，半衰期是指物质(例如有机磷生物清除剂)失去其原始水平的活性的一半所花费的时间。因此，可以通过测量血浆中物质的活性来确定半衰期，或者可以通过测量血浆中物质的血浆水平来确定半衰期。例如，半衰期可以被确定为通过各种身体过程将药物减少到身体内原始水平的一半所需的时间。半衰期越长，物质或药物从身体中清除的时间越长。半衰期的单位通常为时间单位，如小时、分钟或天。“吸收”是指药物进入血流中的运动。“生物利用度”是指达到体循环的药物的给药剂量的分数。生物利用度是药物吸收到血流中的函数。“剂量”是指出于治疗或预防目的向个体施用的药物的量或数量。“核酸”包括dna、rna及其类似物，包括肽核酸(pna)及其混合物。核酸可以是单链或双链的。当涉及任选地标记的探针或引物(例如具有可检测标记，例如荧光或放射性标记)时，可考虑单链分子。这样的分子通常具有这样的长度，使得它们的靶标在统计学上是唯一的或具有低拷贝数(通常小于5，一般小于3)以探测或引发文库。通常，探针或引物含有与感兴趣的基因互补或相同的序列的至少14、16或30个连续核苷酸。探针和引物的长度可以为10、20、30、50、100或更多的核酸。“多肽接头”或“接头”是包含通过肽键连接的两个或多个氨基酸残基的多肽，其用于连接两个多肽(例如，vh和vl结构域或vh结构域和细胞外陷阱区段)。这样的接头多肽的实例是本领域公知的(参见例如holliger等人(1993)proc.natl.acad.sci.usa90:6444-6448；poljak等人(1994)structure2:1121-1123)。示例性的接头包括g、gg、ggggs(seqidno.22)、gggs(seqidno.23)和ggges(seqidno.24)和这些接头的寡聚体(例如，ggggsggggs(seqidno.4)和ggggsggggsggggsggggsg(seqidno.26))。“聚合物”是指连接在一起的一系列单体基团。高分子量聚合物由包括但不限于丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、苯乙烯、乙烯基吡啶、乙烯基吡咯烷酮和乙烯基酯(如乙酸乙烯酯)的单体制备。其他的单体可用于本发明的高分子量聚合物。当使用两种不同的单体类型时，两种单体类称型为“共聚单体”，这意味着不同单体类型共聚形成单一聚合物。聚合物可以是直链或支链的。当聚合物为支链聚合物时，每个聚合物链被称为“聚合物臂”。与引发剂部分连接的聚合物臂的末端是近端，聚合物臂的生长链末端是远端。在聚合物臂的生长链端上，聚合物臂端基可以是自由基清除剂或另一种基团。“引发剂”是指能够引发使用单体或共聚单体的聚合反应的化合物。聚合可以是常规的自由基聚合或优选的受控/“活性(living)”自由基聚合，例如原子转移自由基聚合(atrp)、可逆加成断裂终止(raft)聚合或硝基氧介导聚合(nmp)。聚合可以是“假”受控聚合，例如退化转移。当引发剂适用于atrp时，其包含可以被均一裂解以形成引发剂片段i和自由基清除剂i'的不稳定键，i是能够引发自由基聚合的自由基，i'与生长的聚合物链的自由基反应从而可逆地终止聚合。自由基清除剂i'通常是卤素，但也可以是有机部分，例如腈。“接头”是指将两个基团连接在一起的化学部分。接头可以是可裂解的或不可裂解的。可裂解接头可以是可水解接头、可酶促裂解接头、ph敏感接头、光不稳定接头或二硫化物接头等。其他接头包括同双功能和异双功能接头。“连接基团”是能够与生物活性剂形成由一个或多个键组成的共价连接的官能团。非限制性实例包括表1中所示的那些。本文所用的术语“反应性基团”是指能够与另一个化学基团反应形成共价键的基团，即在合适的反应条件下具有共价反应性，通常代表与另一种物质的连接点。反应性基团是本发明化合物上的部分，例如马来酰亚胺或琥珀酰亚胺酯，其能够与不同化合物上的官能团进行化学反应以形成共价键。反应性基团通常包括亲核体、亲电体和可光活化基团。“功能剂”被定义为包括生物活性剂或诊断剂。“生物活性剂”被定义为包括靶向特定生物学位置(靶向剂)和/或提供可在体内或体外证明的一些局部或全身生理或药理作用的任何药剂、药物、化合物或其混合物。非限制性实例包括药物、疫苗、抗体、抗体片段、scfv、双抗体、高亲和性多聚体(avimers)、维生素和辅因子、多糖、碳水化合物、类固醇、脂质、脂肪、蛋白质、肽、多肽、核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸和核酸(例如mrna、trna、snrna、rnai、dna、cdna、反义构建体、核酶等)。“诊断剂”被定义为包括能够检测或成像组织或疾病的任何试剂。诊断剂的实例包括但不限于放射性标记、荧光团和染料。“治疗性蛋白质”是指包括其全部或部分构成药物的氨基酸序列并可用于人或动物药物应用的肽或蛋白质，而不管长度如何。许多治疗性蛋白质是已知的，包括但不限于本文公开的那些。“磷酰胆碱”也称为“pc”，是指以下结构：其中*表示连接点。“含磷酰胆碱的聚合物”是含有磷酰胆碱的聚合物。“含两性离子的聚合物”是指含有两性离子的聚合物。含有聚(丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱)的聚合物是指含有2-(丙烯酰氧基)乙基-2-(三甲基铵)乙基磷酸酯作为单体的聚合物。含有聚(甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱)的聚合物是指含有2-(甲基丙烯酰氧基)乙基-2-(三甲基铵)乙基磷酸酯作为单体的聚合物。通过引用特定单体类型定义的聚合物可以是均聚物，即仅存在指定类型的单体，或共聚物，在这种情况下，指定类型的单体与其他单体类型一起存在。如果优选共聚物，至少50％、75％或90％的单体分子为所述指定类型的。聚合物上下文中的“分子量”可以表示为数均分子量或重均分子量或峰值分子量。除非另有说明，本文中所有提到的分子量都是指峰值分子量。可以使用尺寸排阻色谱法或其他液相色谱技术测定这些分子量，即数均分子量(mn)、重均分子量(mw)和峰值(mp)分子量。还可以使用其他测量分子量值的方法，例如使用端基分析或测定依数性性质(如凝固点下降、沸点升高或渗透压)以确定数均分子量，或使用光散射技术、超速离心或粘度测定来确定重均分子量。在本发明的优选实施方案中，通过sec-mals(尺寸排阻色谱法-多角度光散射)测量分子量。本发明的聚合物试剂通常是多分散的(即聚合物的数均分子量和重均分子量不相等)，优选具有例如按照凝胶渗透色谱法测定的小于约1.5的低多分散指数(pdi)值。在其他实施方案中，多分散性更优选约1.4至约1.2，更优选小于约1.15，更加优选小于约1.10，还更优选小于约1.05，最优选地小于1.03。本文所用的短语“一种(“a”或“an”)”实体是指一种或多种那个实体；例如，一种化合物是指一种或多种化合物或至少一种化合物。因此，术语一种(“a”或“an”)、“一种或多种”和“至少一种”在本文中可以互换使用。本文所用的“约”是指在使用不同仪器、样品和样品制备进行的测量中可能看到的变化。“被保护的”、“被保护的形式”、“保护基团”和“保护性基团”是指存在防止或阻止分子中特定的化学反应性官能团在某些反应条件下反应的基团(即，保护基团)。保护基团根据被保护的化学反应性基团的类型以及将要使用的反应条件和分子中存在其他的反应性或保护基团而变化(如果存在的话)。合适的保护基团包括诸如greene等人,“protectivegroupsinorganicsynthesis,”第三版,johnwiley和sons,inc.,纽约,1999论文中发现的那些。“烷基”是指具有指定碳原子数的直链或支链的、饱和的、脂族基团。例如，c1-c6烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基等。其他烷基包括但不限于庚基、辛基、壬基、癸基等。烷基可以包括任何数量的碳，例如1-2,1-3,1-4,1-5,1-6,1-7,1-8,1-9,1-10,2-3,2-4,2-5,2-6,3-4,3-5,3-6,4-5,4-6和5-6。烷基通常是一价的，但可以是二价的，例如当烷基连接两个部分时其为二价的。上文和下文中与有机基团或化合物有关的术语“低级”分别定义了可以具有多达7个并包括7个，优选多达4个并包括4个和(作为非支链的)一个或两个碳原子的支链或非支链的化合物或基团。“亚烷基”是指如上定义的连接至少两个其他基团的烷基，即二价烃基。与亚烷基连接的两个部分可以连接到亚烷基的相同原子或不同原子。例如，直链亚烷基可以是二价基团(ch2)n，其中n为1、2、3、4、5或6。亚烷基包括但不限于亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚异丙基、亚丁基、亚异丁基、亚仲丁基、亚戊基和亚己基。烷基和杂烷基(包括通常称为亚烷基、烯基、杂亚烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的那些基团)的取代基可以是选自以下的各种基团：-or’、＝o、＝nr’、＝n-or’、-nr’r”、-sr’、-卤素、-sir’r”r”’、-oc(o)r’、-c(o)r’、-co2r’、-conr’r”、-oc(o)nr’r”、-nr”c(o)r’、-nr’-c(o)nr”r”’、-nr”c(o)2r’、-nh-c(nh2)＝nh、-nr’c(nh2)＝nh、-nh-c(nh2)＝nr’、-s(o)r’、-s(o)2r’、-s(o)2nr’r”、-cn和-no2，其数量范围为0至(2m’+1)，其中m'为这种基团中碳原子的总数。r’、r”和r”’各自独立地表示氢、未取代的(c1-c8)烷基和杂烷基、未取代的芳基、被1-3个卤素取代的芳基、未取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基或芳基(c1-c4)烷基。当r’和r”连接到相同的氮原子时，它们可以与氮原子结合形成5元环、6元环或7元环。例如，nr’r”意在包括1-吡咯烷基和4-吗啉基。术语“烷基”包括诸如卤代烷基(例如-cf3和-ch2cf3)和酰基(例如-c(o)ch3、-c(o)cf3、-c(o)ch2och3等)的基团。优选地，取代的烷基和杂烷基具有1-4个取代基，更优选1、2或3个取代基。例外是那些全卤代烷基(例如五氟乙基等)，其也是本发明所优选和预期的。烷基和杂烷基(包括通常称为亚烷基、烯基、杂亚烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的那些基团)的取代基可以是选自以下的多种基团：-or’、＝o、＝nr’、＝n-or’、-nr’r”、-sr’、-卤素、-sir’r”r”’、-oc(o)r’、-c(o)r’、-co2r’、-conr’r”、-oc(o)nr’r”、-nr”c(o)r’、-nr’-c(o)nr”r”’、-nr”c(o)2r’、-nr-c(nr’r”r’”)＝nr””、-nr-c(nr’r”)＝nr’”、-s(o)r’、-s(o)2r’、-s(o)2nr’r”、-nrso2r’、-cn和-no2，其数量范围为0至(2m’+1)，其中m'为这种基团中碳原子的总数。r’、r”、r”’和r””各自独立地表示氢、取代或未取代的杂烷基，取代或未取代的芳基，例如被1-3个卤素取代的芳基，取代或未取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基，或芳基烷基。当本发明的化合物包含多于一个r基团时，例如，当存在这些基团中的多于一个时，每个r基团各自独立地选自r’、r”、r”’和r””基团。当r’和r”连接到相同的氮原子时，它们可以与氮原子结合形成5元环、6元环或7元环。例如，nr’r”意在包括但不限于1-吡咯烷基和4-吗啉基。术语“烷基”包括与氢基以外的基团结合的碳原子，例如卤代烷基(例如-cf3和-ch2cf3)和酰基(例如-c(o)ch3、-c(o)cf3、-c(o)ch2och3等)。“烷氧基”是指具有氧原子的烷基，该氧原子将烷氧基连接到连接点或被连接到烷氧基的两个碳原子。烷氧基包括例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、2-丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、己氧基等。烷氧基可进一步被本文所述的各种取代基取代。例如，烷氧基可被卤素取代以形成“卤代烷氧基”基团。“羧基烷基”是指被羧基取代的烷基(如本文所定义)。术语“羧基环烷基”是指被羧基取代的环烷基(如本文所定义)。术语烷氧基烷基是指被烷氧基取代的烷基(如本文所定义)。本文所用的术语“羧基”是指羧酸及其酯。“卤代烷基”是指如上定义的烷基，其中一些或全部氢原子被卤素原子取代。卤素(卤素)优选表示氯或氟，但也可以是溴或碘。例如，卤代烷基包括三氟甲基、氟甲基、1,2,3,4,5-五氟苯基等。术语“全氟”定义了所有可用氢被氟取代的化合物或基团。例如，全氟苯基是指1,2,3,4,5-五氟苯基，全氟甲基是指1,1,1-三氟甲基，全氟甲氧基是指1,1,1-三氟甲氧基。“氟取代的烷基”是指其中一个、一些或全部氢原子被氟代替的烷基。“环烷基”是指含有约3-12个、3-10个或3-7个环内碳原子的环状烃基。环烷基包括稠合结构、桥环结构和螺环结构。“环内”是指构成部分环状结构的原子或原子团。“环外”是指与环状结构连接但不限定环状结构的原子或原子团。“环烷基醚”是指具有3或4个环内碳原子和1个环内氧原子或硫原子的4元或5元环状烷基(例如氧杂环丁烷、硫杂环丁烷、四氢呋喃、四氢噻吩)；或具有1或2个环内氧原子或硫原子的6-7元环状烷基(例如，四氢吡喃、1,3-二噁烷、1,4-二噁烷、四氢噻喃、1,3-二噻烷、1,4-二噻烷、1,4-氧硫杂环戊烷)。“烯基”是指具有至少一个双键的2-6个碳原子的直链或支链烃。烯基的实例包括但不限于乙烯基、丙烯基、异丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丁烯基、丁二烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、异戊烯基、1,3-戊二烯基、1,4-戊二烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、1,3-己二烯基、1,4-己二烯基、1,5-己二烯基、2,4-己二烯基或1,3,5-己三烯基。烯基也可以具有2-3、2-4、2-5、3-4、3-5、3-6、4-5、4-6和5-6个碳。烯基通常是一价的，但可以是二价的，例如当烯基将两个部分连接在一起时，其为二价的。“亚烯基”是指连接至少两个其他基团的如上定义的烯基，即二价烃基。与亚烯基连接的两个部分可以连接到亚烯基的相同原子或不同的原子。亚烯基包括但不限于亚乙烯基、亚丙烯基、亚异丙烯基、亚丁烯基、亚异丁烯基、亚仲丁烯基、亚戊烯基和亚己烯基。“炔基”是指具有至少一个三键的、2-6个碳原子的直链或支链烃基。炔基的实例包括但不限于乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、异丁炔基、仲丁炔基、丁二炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、异戊炔基、1,3-戊二炔、1,4-戊二炔基、1-己炔基、2-己炔基、3-己炔基、1,3-己二炔基、1,4-己二炔基、1,5-己二炔基、2,4-己二炔基或1,3,5-己三炔。炔基也可以具有2-3、2-4、2-5、3-4、3-5、3-6、4-5、4-6和5-6个碳。炔基通常是一价的，但可以是二价的，例如当炔基将两个部分连接在一起时，其为二价的。“亚炔基”是指连接至少两个其他基团的如上所定义的炔基，即二价烃基。与亚炔基连接的两个部分可以连接到亚炔基的相同原子或不同的原子。亚炔基包括但不限于亚乙炔基、亚丙炔基、亚丁炔基、亚仲丁炔基、亚戊炔基和亚己炔基。“环烷基”是指含有3-12个环原子或指定数目的原子的饱和或部分不饱和的单环、稠合双环或桥连多环组合。单环包括例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环辛基。双环和多环包括例如降冰片烷、十氢萘和金刚烷。例如，c3-8环烷基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环辛基和降冰片烷。“亚环烷基”是指连接至少两个其他基团的如上所定义的环烷基，即二价烃基。与亚环烷基连接的两个部分可以连接到亚环烷基的相同原子或不同原子。亚环烷基包括但不限于亚环丙基、亚环丁基、亚环戊基、亚环己基和亚环辛基。“杂环烷基”是指具有3个环成员至约20个环成员和1至约5个诸如n、o和s杂原子的环系。也可以使用其他杂原子，包括但不限于，b、al、si和p。这些杂原子也可被氧化，例如但不限于-s(o)-和-s(o)2-。例如，杂环包括但不限于四氢呋喃基、四氢噻吩基、吗啉基、吡咯烷基、吡咯啉基、咪唑烷基、咪唑啉基、吡唑烷基、吡唑啉基、哌嗪基、哌啶基、二氢吲哚基、奎宁环基和1,4-二氧杂-8-氮杂螺[4.5]-8-癸基。“亚杂环烷基”是指连接至少两个其他基团的如上所定义的杂环烷基。连接到亚杂环烷基的两个部分可以连接到亚杂环烷基的相同原子或不同原子。“芳基”是指含有6-16个环碳原子的单环或稠合双环、三环或更大的芳族环组合。例如，芳基可以是苯基、苄基或萘基，优选苯基。“亚芳基”是指衍生自芳基的二价基团。芳基可以是被一个、两个或三个下述基团单取代、二取代或三取代的芳基：烷基、烷氧基、芳基、羟基、卤素、氰基、氨基、氨基烷基、三氟甲基、亚烷基二氧和氧-c2-c3亚烷基。所有这些都可以任选地进一步被取代，例如如上所定义；或1-萘基或2-萘基；或1-菲基或2-菲基。亚烷基二氧基是连接到苯基的两个相邻碳原子的二价取代基，例如亚甲二氧或亚乙二氧。氧-c2-c3-亚烷基也是连接到苯基的两个相邻碳原子的二价取代基，例如，氧亚乙基或氧亚丙基。氧-c2-c3亚烷基苯基的实例是2,3-二氢苯并呋喃-5-基。优选芳基为萘基、苯基或被下述基团单取代或二取代的苯基：烷氧基、苯基、卤素、烷基或三氟甲基，特别为苯基或被烷氧基、卤素或三氟甲基单取代或二取代的苯基，尤其为苯基。作为r的、取代的苯基的实例是例如4-氯苯-1-基、3,4-二氯苯-1-基、4-甲氧基苯-1-基、4-甲基苯-1-基、4-氨基甲基苯-1-基、4-甲氧基乙基氨基甲基苯-1-基、4-羟乙基氨基甲基苯-1-基、4-羟乙基-(甲基)-氨基甲基苯-1-基、3-氨基甲基苯-1-基、4-n-乙酰氨基甲基苯-1-基、4-氨基苯-1-基、3氨基苯-1-基、2-氨基苯-1-基、4-苯基苯-1-基、4(咪唑-1-基)苯基、4-(咪唑-1-基甲基)苯-1-基、4(吗啉-1-基)苯-1-基、4-(吗啉-1-基甲基)苯-1-基、4-(2-甲氧基乙基氨基甲基)苯-1-基和4-(吡咯烷-1-基甲基)苯-1-基、4-(噻吩基)苯-1-基、4-(3-噻吩基)苯-1-基、4(4-甲基哌嗪-1-基)苯-1-基和4-(哌啶基)苯基和4-(吡啶基)苯基，上述基团任选地在杂环上取代。“亚芳基”是指连接至少两个其他基团的如上所定义的芳基。与亚芳基连接的两个部分连接到亚芳基的不同原子上。亚芳基包括但不限于亚苯基。“亚芳基氧”是指如上定义的亚芳基，其中与亚芳基连接的部分之一通过氧原子连接。亚芳基氧包括但不限于亚苯基基。类似地，芳基和杂芳基的取代基是变化的并且选自：-卤素、-or’、-oc(o)r’、-nr’r”、-sr’、-r’、-cn、-no2、-co2r’、-conr’r”、-c(o)r’、-oc(o)nr’r”、-nr”c(o)r’、-nr”c(o)2r’、,-nr’-c(o)nr”r”’、-nh-c(nh2)＝nh、-nr’c(nh2)＝nh、-nh-c(nh2)＝nr’、-s(o)r’、-s(o)2r’、-s(o)2nr’r”、-n3、-ch(苯基)2、全氟(c1-c4)烷氧基和全氟(c1-c4)烷基，其数量范围为0至芳族环系上的开放化合价总数；并且其中r’、r”和r”’独立地选自氢、(c1-c8)烷基和杂烷基、未取代的芳基和杂芳基、(未取代的芳基)(c1-c4)烷基和(未取代的芳基)氧(c1-c4)烷基。芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可任选地被式-t-c(o)(ch2)q-u-的取代基取代，其中t和u独立地是-nh-、-o-、-ch2或单键，并且q是0-2的整数。或者，芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可以任选地被式-a-(ch2)rb的取代基取代，其中a和b独立地是-ch2-、-o-、-nh-、-s-、-s(o)-、-s(o)2-、-s(o)2nr’-或单键，r是1-3的整数。如此形成的环的单键之一可任选地被双键替代。或者，芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可任选地被式-(ch2)s-x-(ch2)t-的取代基取代，其中s和t独立地为0-3的整数，x是-o-、-nr’-、-s-、-s(o)-、-s(o)2-、or-s(o)2nr’-。nr'和s(o)2nr'中的取代基r'选自氢或未取代的(c1-c6)烷基。“杂芳基”是指含有5-16个环原子的单环或稠合双环或三环芳环，其中1-4个环原子是n、o或s的杂原子。例如，杂芳基包括吡啶基、吲哚基、吲唑基、喹喔啉基、喹啉基、异喹啉基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、呋喃基、吡咯基、噻唑基、苯并噻唑基、噁唑基、异唑基、三唑基、四唑基、吡唑基、咪唑基、噻吩基，或被烷基、硝基或卤素取代的，特别是单取代或二取代的，任意其他基团。吡啶基表示2-吡啶基、3-吡啶基或4-吡啶基，有利的是2-吡啶基或3-吡啶基。噻吩基表示2-噻吩基或3-噻吩基。喹啉基优选表示2-喹啉基、3-喹啉基或4-喹啉基。异喹啉基优选表示1-异喹啉基、3-异喹啉基或4-异喹啉基。苯并吡喃基、苯并噻喃基优选分别表示3-苯并吡喃基或3-苯并噻喃基。噻唑基优选表示2-噻唑基或4-噻唑基，最优选4-噻唑基。三唑基优选为1-(1,2,4-三唑基)、2-(1,2,4-三唑基)或5-(1,2,4-三唑基)。四唑基优选为5-四唑基。优选地，杂芳基是吡啶基、吲哚基、喹啉基、吡咯基、噻唑基、异噁唑基、三唑基、四唑基、吡唑基、咪唑基、噻吩基、呋喃基、苯并噻唑基、苯并呋喃基、异喹啉基、苯并噻吩基、噁唑基、吲唑基，或取代的(特别是单取代或二取代)的任意所述基团。如本文所用，术语“杂烷基”是指具有1-3个诸如n、o和s杂原子的烷基。也可以使用其他杂原子，包括但不限于b、al、si和p。杂原子也可以被氧化，例如但不限于-s(o)-和-s(o)2-。例如，杂烷基可以包括醚、硫醚、烷基胺和烷基硫醇。如本文所用，术语“杂亚烷基”是指连接至少两个其他基团的如上所定义的杂烷基。与杂亚烷基连接的两个部分可以连接到杂亚烷基的相同原子或不同原子。“亲电体”是指具有亲电中心(即寻找电子的、能够与亲核体反应的中心)的离子或原子或可以是离子性的原子集合。亲电体(或亲电试剂)是通过接受来自反应配偶体(亲核体)的两个成键电子而与反应配偶体形成键的试剂。“亲核体”是指具有亲核中心(即寻找亲电中心的或能够与亲电体反应的中心)的离子或原子或可以是离子性的原子集合。亲核体(或亲核试剂)是通过供给两个成键电子而与其反应配偶体(亲电体)形成键的试剂。“亲核基团”是指与反应性基团反应后的亲核体。非限制性实例包括氨基、羟基、烷氧基、卤代烷氧基等。“马来酰亚胺基”是指具有以下结构的吡咯-2,5-二酮-1-基：其与巯基(例如硫代烷基)反应时形成具有以下结构的-s-马来酰亚胺基，其中“·”表示马来酰亚胺基团的连接点，表示硫醇的硫原子与原始的具有巯基的基团的剩余部分的连接点。对于本发明的目的，蛋白质和多肽中发现的“天然存在的氨基酸”是l-丙氨酸、l-精氨酸、l-天冬酰胺、l-天冬氨酸、l-半胱氨酸、l-谷氨酰胺、l-谷氨酸、l-甘氨酸、l-组氨酸、l-异亮氨酸、l-亮氨酸、l-赖氨酸、l-甲硫氨酸、l-苯丙氨酸、l-脯氨酸、l-丝氨酸、l-苏氨酸、l-色氨酸、l-酪氨酸和/或l-缬氨酸。在蛋白质中发现的“非天然存在的氨基酸”是除了作为天然存在的氨基酸所记载的氨基酸之外的任何氨基酸。非天然存在的氨基酸包括但不限于天然存在的氨基酸的d异构体(混合物会被更准确地描述为一些天然氨基酸和一些非天然氨基酸)。虽然在天然存在的蛋白质中发现了其他氨基酸，如4-羟脯氨酸、锁链素、异锁链素、5-羟基赖氨酸、ε-n-甲基赖氨酸、3-甲基组氨酸，但为了本发明的目的，将其认为是蛋白质中发现的非天然存在的氨基酸，因为它们通常通过mrna的核糖体翻译之外的方式引入。“线性”与聚合物的几何结构、架构或整体结构有关，其是指具有单个聚合物臂的聚合物。“支链的”与聚合物的几何结构、架构或整体结构有关，其是指具有从引发剂延伸的2个或更多个聚合物“臂”的聚合物。引发剂可以用于原子转移自由基聚合(atrp)反应。支链聚合物可以具有2个聚合物链(臂)、3个聚合物臂、4个聚合物臂、5个聚合物臂、6个聚合物臂、7个聚合物臂、8个聚合物臂、9个聚合物臂、10个聚合物臂、11个聚合物臂、12个聚合物臂或更多。每个聚合物臂从聚合物引发位点延伸。每个聚合物引发位点都能够作为通过添加单体实现聚合物链生长的位点。例如但不限于使用atrp，引发剂上的每个聚合物引发位点通常是经历由过渡金属化合物(如卤化亚铜)催化的可逆的氧化还原过程的有机卤化物。优选地，卤化物是溴化物。“药学上可接受的”组合物或“药物组合物”是指包含本发明化合物和一种或多种药学上可接受的赋形剂的组合物。“药学上可接受的赋形剂”和“药学上可接受的载体”是指可以包括在本发明的组合物中的、对患者没有引起显著的不良毒理作用的并被fda批准或可批准用于治疗用途(特别是对人的治疗用途)的赋形剂。药学上可接受的赋形剂的非限制性实例包括水、nacl、生理盐水溶液、乳酸林格氏素、标准蔗糖、标准葡萄糖等。“患者”或“有需要的个体”是指患有或易于患有可通过施用本文提供的药物组合物预防或治疗的病症的活生物体。非限制性实例包括人、其他哺乳动物和其他非哺乳动物。缀合物优选以分离形式提供。分离意味着目标物质至少部分地从与其天然相关污染物或在其制造中使用的污染物分离，但不一定排除旨在与分离的物质联合起作用的其他成分的存在，例如药用赋形剂。优选地，缀合物是存在于组合物样品中的主要大分子物质(即以摩尔为基准)，并且通常包含存在的所有大分子物质的至少约50％(基于摩尔数)。通常，分离的缀合物包含存在于组合物中的所有大分子物质的80％、90％、95％或99％。最优选地，缀合物被纯化至基本均匀(即，通过常规检测方法不能在组合物中检测到污染物质)，使得组合物基本上由单一大分子物质组成。尽管在蛋白质部分上的糖基化以及与缀合物的不同分子连接的聚合物部分中的单体数目可能存在差异，但具有相同的重链和轻链的缀合物被认为是相同的物质。“有效量”是指用于治疗、改善或预防确定的疾病或病症或用于表现出可检测的治疗或抑制作用的药物组合物或缀合的功能剂的量。可以在单个患者中相对于治疗前的基线测量检测该作用或通过确定治疗组和对照组之间的结果的统计学上的显著性差异检测该作用。同样地，有效的方案是指有效减少、抑制或延迟疾病的至少一种病征或症状的本文所述的任何缀合物、融合蛋白或其他药剂的给药量、给药频率和给药途径的组合。物质的“生物半衰期”是药代动力学参数，其规定了在将物质引入生物体后将一半物质从生物体中除去所需的时间。序列同一性可以通过使用默认间隙参数并使用在wisconsingeneticssoftwarepackagerelease7.0，geneticscomputergroup，575sciencedr.，madison，wi中的诸如bestfit、fasta和tfasta的算法进行序列比对来确定，或者通过检查和最佳比对(即，导致比较窗口中序列相似度的最高百分比)来确定。通过以下步骤计算序列同一性的百分比：比较两个比较窗口中的两个最佳比对序列，确定两个序列中存在的相同残基的位置数以产生匹配位置数，将匹配位置数除以在比较窗口中的位置总数(即窗口尺寸)，并将结果乘以100以产生序列同一性的百分比。如果为全长成熟蛋白质提供具体的seqidno.，从成熟蛋白质的第一残基(即，不考虑任何信号肽的残基)的1位开始对残基进行连续编号。seqidno.的变体或片段中的残基通过与seqidno.进行最大比对并为对齐的残基分配相同的数字来编号。术语“蛋白质”以其最广泛的含义用于指两个或多个亚单位，即氨基酸、氨基酸类似物或模拟肽。亚单位可以通过肽键连接。在另一个实施方案中，亚基可以通过其他键(例如酯，醚等)连接。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对氨基酸的最大数量没有限制，其可以包含蛋白质或肽的序列。如果肽链短，则三个或更多个氨基酸的肽通常称为寡肽。如果肽链长，则肽通常称为多肽或蛋白质。蛋白质的非限制性实例包括酶、细胞因子、神经营养因子、抗体、肽、激素、dna结合蛋白、适体、疫苗、毒素、白细胞介素-1(il-1α)、il-1β、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-11、il-7、il-8、il-9、il-10、il-11、il-12、il-13、il-14、il-15、il-16、il-17、il-18、il-19、il-20、il-21、il-22、il-23、il-24、il-31、il-32、il-33、集落刺激因子-1(csf-1)、巨噬细胞集落刺激因子、葡糖脑苷脂酶(glucocerobrosidase)、促甲状腺激素、干细胞因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子(g-csf)、epo、干扰素-α(ifn-α)、复合干扰素(consensusinterferon)-β(ifn-β)、干扰素-(ifn-)、干扰素-ω(ifn-ω)、血小板生成素(tpo)、血管生成素-1(ang-1)、ang-2、ang-4、ang-y、血管生成素样多肽1(angptl1)、血管生成素样多肽2(angptl2)、血管生成素样多肽3(angptl3)、血管生成素样多肽4(angptl4)、血管生成素样多肽5(angptl5)、血管生成素样多肽6(angptl6)、血管生成素样多肽7(angptl7)、玻连蛋白、血管内皮生长因子(vegf)、血管生成素、激活素a、激活素b、激活素c、骨形态发生蛋白-1、骨形态发生蛋白-2、骨形态发生蛋白-3、骨形态发生蛋白-4、骨形态发生蛋白-5、骨形态发生蛋白-6、骨形态发生蛋白-7、骨形态发生蛋白-8、骨形态发生蛋白-9、骨形态发生蛋白-10、骨形态发生蛋白-11、骨形态发生蛋白-12、骨形态发生蛋白-13、骨形态发生蛋白14、骨形态发生蛋白-15、骨形态发生蛋白受体ia、骨形态发生蛋白受体ib、骨形态发生蛋白受体ii、脑源性神经营养因子、心肌营养素-1、睫状中性白细胞因子、睫状中性白细胞因子受体、cripto、隐性细胞因子诱导的嗜中性粒细胞趋化因子1、细胞因子诱导的嗜中性粒细胞、趋化因子2α、乙型肝炎疫苗、丙型肝炎疫苗、drotrecoginalfa、细胞因子诱导的嗜中性粒细胞趋化因子2β、内皮细胞生长因子、内皮素1、表皮生长因子(egf)、epigen、上皮调节蛋白、上皮衍生的嗜中性粒细胞引诱剂、成纤维细胞生长因子4、成纤维细胞生长因子5、成纤维细胞生长因子6、成纤维细胞生长因子7、成纤维细胞生长因子8、成纤维细胞生长因子8b、成纤维细胞生长因子8c、成纤维细胞生长因子9、成纤维细胞生长因子10、成纤维细胞生长因子11、成纤维细胞生长因子12、成纤维细胞生长因子13、成纤维细胞生长因子16、成纤维细胞生长因子17、成纤维细胞生长因子19、成纤维细胞生长因子20、成纤维细胞生长因子21、酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、神经胶质细胞系衍生的中性粒细胞因子受体α1、神经胶质细胞系衍生的中性粒细胞因子受体、生长相关蛋白、生长相关蛋白a、igg、ige、igm、iga和igd、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、dnase、胎球蛋白、促黄体激素、阿替普酶、雌激素、胰岛素、白蛋白、脂蛋白、胎蛋白、转铁蛋白、血小板生成素、尿激酶、整联蛋白、凝血酶因子ix(fix)、因子viii(fviii)、因子viia(fviia)、血管性血友病因子(vwf)、因子fv(fv)、因子x(fx)、因子xi(fxi)、因子xii(fxii)、因子xiii(fxiii)、凝血酶(fii)、蛋白c、蛋白s、tpa、pai-1、组织因子(tf)、adamts13蛋白酶、生长相关蛋白β、生长相关蛋白、肝素结合表皮生长因子、肝细胞生长因子、肝细胞生长因子受体、肝细胞源性生长因子、胰岛素样生长因子i、胰岛素样生长因子受体、胰岛素样生长因子ii、胰岛素样生长因子结合蛋白、角质细胞生长因子、白血病抑制因子、生长激素、抗血友病因子、培门冬酶(pegaspargase)、orthocloneokt3、腺苷脱氨酶、阿糖脑苷酶(alglucerase)、伊米苷酶(imiglucerase)、白血病抑制因子受体α、神经生长因子受体、neuropoietin、神经营养因子-3、神经营养因子-4、制瘤素m(osm)、胎盘生长因子、胎盘生长因子2、血小板衍生的内皮细胞生长因子、血小板衍生生长因子、血小板衍生生长因子a链、血小板衍生生长因子aa、血小板衍生生长因子ab、血小板衍生生长因子b链、血小板衍生生长因子bb、血小板衍生生长因子受体α、血小板衍生生长因子受体β、前b细胞生长刺激因子、干细胞因子(scf)、干细胞因子受体、tnf、tnf0、tnf1、tnf2、转化生长因子α、胸腺基质淋巴生成素(tslp)、i型肿瘤坏死因子受体、ii型肿瘤坏死因子受体、尿激酶型纤溶酶原激活物受体、磷脂酶活化蛋白(pup)、胰岛素、凝集素蓖麻毒素、催乳素、绒毛膜促性腺激素、促卵泡激素、甲状腺刺激激素、组织纤溶酶原激活物(tpa)、瘦蛋白、enbrel(依那西普、etanercept)。在一些实施方案中，蛋白质是抗体。如本文所用，“抗体”包括但不限于完整抗体和任何抗原结合片段，抗原结合片段包括但不限于fab或其单链。因此，术语“抗体”包括但不限于包含具有与抗原结合的生物学活性的免疫球蛋白分子的至少一部分的、任何含蛋白质或肽的分子。其实例可包括重链或轻链的互补决定区或其配体结合部分、重链可变区或轻链可变区、重链恒定区或轻链恒定区、框架(fr)区，或其任何部分，或结合蛋白的至少一部分。“抗体”还包括单克隆抗体和多克隆抗体。抗体的实例包括但不限于英夫利昔单抗(infliximab)、贝伐珠单抗(infliximab)、兰尼单抗(ranibizumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、兰尼单抗(ranibizumab)、帕利珠单抗(palivizumab)、阿巴伏单抗(abagovomab)、阿昔单抗(abciximab)、阿托续单抗(actoxumab)、阿达木单抗(adalimumab)、阿非莫单抗(afelimomab)、阿夫妥珠单抗(afutuzumab)、阿珠单抗(alacizumab)、培化阿珠单抗(alacizumabpegol)、ald518、阿仑单抗(alemtuzumab)、阿里若库单抗(alirocumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、阿妥莫单抗(altumomab)、阿麦妥昔单抗(amatuximab)、麻安莫单抗(anatumomabmafenatox)、安芦珠单抗(anrukinzumab)、阿泊珠单抗(apolizumab)、阿西莫单抗(arcitumomab)、阿赛珠单抗(aselizumab)、altinumab、阿利珠单抗(atlizumab)、atorolimiumab、托珠单抗(tocilizumab)、巴匹珠单抗(bapineuzumab)、巴利昔单抗(basiliximab)、巴维昔单抗(bavituximab)、贝妥莫单抗(bectumomab)、贝利木单抗(belimumab)、贝那珠单抗(benralizumab)、柏替木单抗(bertilimumab)、贝索单抗(besilesomab)、贝伐单抗(bevacizumab)、贝兹罗图单抗(bezlotoxumab)、比西单抗(biciromab)、比伐单抗(bivatuzumab)、比伐单抗美登素(bivatuzumabmertansine)、博纳吐单抗(blinatumomab)、布索珠单抗(blosozumab)、妥昔单抗维多汀(brentuximabvedotin)、布拉吉单抗(briakinumab)、巴罗达鲁单抗(brodalumab)、康纳单抗(canakinumab)、坎托珠单抗美登素(cantuzumabmertansine)、坎托珠单抗美坦新、卡普拉西珠单抗(caplacizumab)、卡罗单抗喷地肽(capromabpendetide)、卡鲁单抗、卡妥索单抗(catumaxomab)、cc49、西利珠单抗、培化赛托珠单抗(certolizumabpegol)、西妥昔单抗、泊西他土珠单抗(citatuzumabbogatox)、西妥木单抗(cixutumumab)、克拉扎珠单抗(clazakizumab)、克立昔单抗、替坦司可利妥珠单抗(clivatuzumabtetraxetan)、可那妥木单抗(conatumumab)、克雷内珠单抗(crenezumab)、cr6261、达西妥珠单抗(dacetuzumab)、达利珠单抗(daclizumab)、达洛妥珠单抗(dalotuzumab)、达拉妥木单抗(daratumumab)、德美西珠单抗(demcizumab)、地诺单抗(denosumab)、地莫单抗(detumomab)、阿托度单抗(dorlimomabaritox)、卓齐妥单抗(drozitumab)、度利戈妥单抗(duligotumab)、度匹鲁单抗(dupilumab)、依美昔单抗(ecromeximab)、依库珠单抗(eculizumab)、埃巴单抗、依决洛单抗、依法珠单抗、依夫单抗(efungumab)、依洛妥珠单抗(elotuzumab)、艾西莫单抗(elsilimomab)、依纳伐妥珠单抗(enavatuzumab)、培化恩莫单抗、依诺珠单抗(enokizumab)、依诺替库单抗(enoticumab)、恩西妥昔西单抗(ensituximab)、西依匹妥莫单抗(epitumomabcituxetan)、依帕珠单抗、厄利珠单抗(erlizumab)、厄马索单抗(ertumaxomab)、伊瑞西珠单抗(etaracizumab)、依托珠单抗(etroiizumab)、艾韦单抗(exbivirumab)、法索单抗(fanolesomab)、法拉莫单抗、法勒珠单抗(farletuzumab)、法西奴单抗(fasinumab)、fbta05、非维珠单抗、非扎奴单抗(fezakinumab)、芬克拉妥珠单抗(ficlatuzumab)、芬妥木单抗(figitumumab)、弗拉伏妥单抗(flanvotumab)、芳妥珠单抗(fontolizumab)、佛拉鲁单抗(foralumab)、佛拉韦芦单抗(foravirumab)、夫苏木单抗(fresolimumab)、弗拉奴单抗(fulranumab)、弗妥昔单抗(futuximab)、加利昔单抗(galiximab)、甘尼妥单抗(ganitumab)、甘特芦单抗(gantenerumab)、加韦莫单抗(gavilimomab)、吉妥珠单抗-奥佐米星(gemtuzumabozogamicin)、吉沃珠单抗(gevokizumabvedotin)、吉瑞妥昔单抗(girentuximab)、格列姆巴妥木单抗-维多汀(glembatumumab)、戈利木单抗(golimumab)、戈米昔单抗(gomiliximab)、gs6624、伊巴珠单抗(ibalizumab)、伊莫单抗-替坦(ibritumomabtiuxetan)、伊克芦库单抗(icrucumab)、伊戈伏单抗、英西单抗、英加妥珠单抗(imgatuzumab)、英克勒库单抗(inclacumab)、英达妥昔单抗-拉夫坦辛(indatuximabravtansine)、英利昔单抗、英特妥木单抗(intetumumab)、伊诺莫单抗、伊诺妥珠单抗-奥佐米星(inotuzumabozogamicin)、伊匹单抗(ipilimumab)、伊拉妥木单抗(iratumumab)、伊托珠单抗(itolizumab)、伊克塞珠单抗(ixekizumab)、凯利昔单抗、拉贝妥珠单抗(labetuzumab)、来金珠单抗(lebrikizumab)、来马索单抗(lemalesomab)、乐地单抗、来沙妥木单抗(lexatumumab)、利韦单抗(libivirumab)、利格珠单抗(ligelizumab)、林妥珠单抗、利利单抗(lirilumab)、美登素洛妥珠单抗(lorvotuzumabmertansine)、鲁卡妥木单抗(lucatumumab)、鲁米昔单抗(lumiliximab)、马帕妥木单抗(mapatumumab)、马司莫单抗、马利木单抗(mavriiimumab)、马妥珠单抗(matuzumab)、美泊利单抗、美特木单抗(metelimumab)、米拉珠单抗(milatuzumab)、明瑞莫单抗、米妥莫单抗、莫加木珠单抗(mogamulizumab)、莫罗木单抗、莫他韦珠单抗(motavizumab)、莫西妥莫单抗(moxetumomab)-假单胞菌外毒素(pasudotox)、莫罗单抗(muromonab)-0)3、他那可单抗(nacolomabtafenatox)、那米鲁单抗(namilumab)、他那莫单抗(naptumomabestafenatox)、纳那妥单抗(narnatumab)、那他珠单抗、奈巴库单抗、奈昔妥木单抗(necitumumab)、奈瑞莫单抗、耐斯伐库单抗(nesvacumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、尼伏鲁单抗(nivolumab)、诺莫单抗-默喷坦(nofetumomabmerpentan)、奥卡拉妥珠单抗(ocaratuzumab)、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、奥度莫单抗、奥法木单抗(ofatumumab)、奥拉妥单抗(olaratumab)、奥洛珠单抗(olokizumab)、奥马佐单抗、奥纳妥珠单抗(onartuzumab)、莫-奥珠单抗(oportuzumabmonatox)、奥戈伏单抗(oregovomab)、奥替库单抗(orticumab)、奥特利昔珠单抗(otelixizumab)、奥昔鲁单抗(oxelumab)、奥扎尼珠单抗(ozanezumab)、奥左拉珠单抗(ozoralizumab)、帕吉昔单抗(pagibaximab)、帕利珠单抗、帕尼单抗(panitumumab)、帕诺巴库单抗(panobacumab)、巴萨妥珠单抗(parsatuzumab)、帕考珠单抗(pascolizumab)、帕特克珠单抗(pateclizumab)、帕曲妥单抗(patritumab)、培妥莫单抗(pemtumomab)、培拉珠单抗(perakizumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、培克珠单抗(pexelizumab)、皮地珠单抗(pidilizumab)、平妥莫单抗(pintumomab)、普拉库鲁单抗(placulumab)、泊尼珠单抗(ponezumab)、普立昔单抗、普立妥木单抗(pritumumab)、pro140、奎利珠单抗(quilizumab)、雷妥莫单抗(racotumomab)、雷得妥单抗(radretumab)、瑞非韦鲁(rafivirumab)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、兰尼单抗(ranibizumab)、瑞西巴库(raxibacumab)、瑞加韦单抗、瑞利珠单抗(reslizumab)、利妥木单抗(rilotumumab)、利妥昔单抗、罗妥木单抗(robatumumab)、罗度单抗(roledumab)、罗莫索珠单抗(romosozumab)、罗利珠单抗(rontalizumab)、罗维珠单抗、鲁利单抗、沙马珠单抗(samalizumab)、沙里鲁单抗(sarilumab)、沙妥莫单抗-喷地肽(satumomabpendetide)、司库奴单抗(secukinumab)、司韦单抗、西罗珠单抗(sibrotuzumab)、西法木单抗(sifalimumab)、西妥昔单抗(siltuximab)、西妥珠单抗(simtuzumab)、西利珠单抗(siplizumab)、西芦库单抗(sirukumab)、索兰珠单抗(solanezumab)、索利托单抗(solitomab)、索耐珠单抗(sonepcizumab)、松妥珠单抗(sontuzumab)、司他木鲁单抗(stamulumab)、硫索单抗、苏韦珠单抗(suvizumab)、他巴鲁单抗(tabalumab)、替坦司他卡妥珠单抗(tacatuzumabtetraxetan)、他度珠单抗(tadocizumab)、他利珠单抗(talizumab)、他尼珠单抗(tanezumab)、帕-他莫单抗(taplitumomabpaptox)、替非珠单抗(tefibazumab)、阿替莫单抗(telimomabaritox)、替妥莫单抗(tenatumomab)、替奈昔单抗(teneliximab),替利珠单抗(teplizumab)、替妥木单抗(teprotumumab)、tgn1412、曲美木单抗(tremelimumab)、替昔木单抗(ticilimumab)、替拉珠单抗(tildrakizumab)、替加珠单抗(tigatuzumab)、tnx-650、托珠单抗(＝阿利珠单抗)、托拉珠单抗(toralizumab)、托西莫单抗、特拉罗奴单抗(tralokinumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、trbs07、曲加珠单抗(tregalizumab)、曲美木单抗、妥可妥珠单抗(tucotuzumab)-西莫白介素、妥韦单抗、优利妥昔单抗(ublituximab)、优瑞鲁单抗(urelumab)、优托珠单抗(urtoxazumab)、优特克单抗(ustekinumab)、伐利昔单抗(vapaliximab)、伐特珠单抗(vatelizumab)、维多珠单抗(vedolizumab)、维妥珠单抗(veltuzumab)、维帕莫单抗、维森库单抗(vesencumab)、维西珠单抗(visilizumab)、伏洛昔单抗(volociximab)、伏司妥珠单抗(vorsetuzumab)-马佛多汀(mafodotin)、伏妥莫单抗、扎鲁妥木单抗(zalutumumab)、扎诺木单抗(zanolimumab)、扎妥昔单抗(zatuximab)、齐拉木单抗(ziralimumab)和阿左莫单抗(zolimomabaritox)。对于上述每一个，本发明预期使用其fab以及全抗体。iii.生物清除剂缀合物和构建体从人血清中分离的buche是分子量为340kda的球状四聚体分子。haupth,heidek,zwislero和schwickhg.1966.isolierunundphysikalischchemisclecharakterisierungdercholinesteraseaushumanserum.blut.14:65-75。酶的四个亚基中的每一个长度为574个氨基酸。每条链都有九个asn连接的碳水化合物链。lockridgeo,bartelscf,vaughanta,wongck,nortonse,johnsonll.1987.completeaminoacidsequenceofhumanserumcholinesterase.jbiolchem.262:549-557。进行了各种尝试以制备重组型buche。然而，证明在血浆中观察到的主要四聚体形式只是由重组dna技术制备的蛋白质的次要组分。例如，rhbuche在中国仓鼠卵巢(cho)细胞中的表达产生蛋白质的混合物：二聚体(不稳定)(50-55％)、单体(15-40％)和相对小百分比的四聚体(10-30％)。blongrm,bedowse,lockridgeo.1997.tetramerizationdomainofhumanbutyrylcholinesteraseisatthec-terminus.biochemj.327:747-757。已确定hbuche的c末端负责四聚化。c末端缺失的蛋白质的表达导致单体的唯一生产。此外，blong等人报道说可以除去c-末端多达50个氨基酸而不损失酶活性(如上所述，仅能检测到单体形式)。然而，从c-末端缺失51个氨基酸产生保留在细胞中的蛋白质的无活性形式(即不分泌)。人丁酰胆碱酯酶(p06276.1)的602氨基酸序列示于seqidno.1。前28个氨基酸(mhskvtiicirflfwflllcmligksht(seqidno.27))构成hbuche的天然前导序列。因此，成熟酶以序列eddiii(seqidno.28)开始。根据本发明的一个方面，提供了丁酰胆碱酯酶(buche)酶。优选地，丁酰胆碱酯酶为人类酶(hbuche)。更优选地，酶为重组人类酶(rhbuche)。在本发明的优选实施方案中，丁酰胆碱酯酶具有一个或多个缺失和/或氨基酸取代。优选地，将66位的半胱氨酸残基(从成熟体的n末端开始)变为其他天然或非天然氨基酸，更优选，将c66变换为酪氨酸或异亮氨酸，最优选c66变换为酪氨酸(c66y)。根据本发明的一个方面，提供了rhbuche的c末端缺失。优选从rhbuche的c末端缺失不多于50个的氨基酸。更优选地，从rhbuche的c末端缺失50个氨基酸，得到构建体rhbuche524(指524n末端保留的氨基酸)。更优选地，从rhbuche的c末端缺失40个氨基酸，得到构建体rhbuche534。优选地，缺失突变具有上述c66突变中的一个或多个。更优选地，缺失突变具有c66y突变。在本发明的最优选方面，具有c66y突变的524缺失的蛋白质序列(rhbche524(c66y))示于seqidno.11。在本发明的另一个最优选的方面，具有c66y突变的534缺失的蛋白质序列(rhbche534(c66y))示于seqidno.10。根据本发明的一个方面，聚合物可以与buche缀合。优选地，使用马来酰亚胺将聚合物与cys残基缀合。cys残基可能是一个天然存在的半胱氨酸。在本发明的其他优选实施方案中，半胱氨酸残基可以加入到rhbuche的c末端缺失体之一中，使得蛋白质可以与聚合物缀合。优选地，将半胱氨酸加入到缺失后的rhbuche的c末端。在更优选的实施方案中，通过ggc或gggc(seqidno.20)肽向c末端添加半胱氨酸。在更优选的实施方案之一中，将肽gggc(seqidno.20)加入到rhbuche524(c66y)酶的c末端(见seqidno.12)。在另一个更优选的实施方案中，将肽ggc加入到rhbuche534(c66y)的c末端(见seqidno.13)。根据本发明的一个方面，提供了具有丁酰胆碱酯酶片段和非丁酰胆碱酯酶蛋白片段的丁酰胆碱酯酶融合蛋白。在本发明的优选方面，丁酰胆碱酯酶蛋白片段是非丁酰胆碱酯酶片段的n-末端。优选地，非丁酰胆碱酯酶蛋白是免疫球蛋白(ig)结构域。更优选ig结构域选自igg-fc、igg-ch和igg-cl。更优选地，ig结构域来自igg1(seqidno.8)。在本发明的其他优选实施方案中，igg1fc序列可以以各种方式进行修饰，例如调节补体结合和效应子功能。任选地，igg1fc结构域具有一个或多个突变以降低效应子功能。任选地，突变是以下氨基酸位置中的一个或多个(eu编号)：e233、l234、l235、g236、g237、a327、a330和p331。在这方面，优选地，igg1fc具有以下取代：l234a、l235e、g237a、a330s和p331s。fc结构域c末端的赖氨酸残基有时可以通过翻译后处理来使其缺失。因此，当fc结构域的seqid以赖氨酸终止时，赖氨酸可以省略也可以不省略。根据本发明的一个方面，可以引入fc区的修饰以提供聚合物缀合的位点。例如，可以加入半胱氨酸残基，该半胱氨酸残基可以是聚合物缀合位点。优选地，fc结构域具有选自q347c和l443c的突变。更优选地，突变为q347c。根据本发明的一个方面，融合蛋白优选在丁酰胆碱酯酶和非丁酰胆碱酯酶蛋白之间含有多肽接头。优选地，接头为g、gg、ggggs(seqidno.22)、gggs(seqidno.23)和ggges(seqidno.24)以及前述接头的低聚物。更优选地，接头选自gggsgggsgggs(seqidno.21)和ggsgggsgggs(seqidno.25)。在本发明的优选实施方案中，融合蛋白的丁酰胆碱酯酶为融合物n末端的、具有优选的c66y突变的上述c末端截短体之一(rhbuche524(c66y)或rhbuche534(c66y))，接着是接头以及c末端的非丁酰胆碱酯酶蛋白序列。在本发明的更优选方面，从n末端开始，融合蛋白由上述的具有c66y突变的524或534c-末端截短体、与其融合的接头gggsgggsgggs(seqidno.21)以及随后的具有以下突变的igg1fc序列组成：l234a、l235e、g237a、a330s和p331s。在本发明最优选的实施方案中，融合蛋白的丁酰胆碱酯酶截短体为rhbuche534(c66y)。该构建体的蛋白质序列示于seqidno.15。在本发明的另一个非常优选的实施方案中，融合物的fc区具有q347c或l443c突变。最优选地，融合物的fc区具有q347c突变和l234a、l235e、g237a、a330s和p331s。该优选实施方案的蛋白质序列示于seqidno.2。根据本发明的另一方面，提供了具有共价结合至聚合物的op生物清除剂(即催化op生物清除剂或化学计量的op生物清除剂)的蛋白质-聚合物缀合物。优选地，聚合物为两性离子聚合物，该聚合物具有一个或多个单体单元，其中至少一个单体单元具有两性离子。催化op生物清除剂通常为选自芳基二烷基磷酸酶、有机磷酸酯水解酶(oph)、羧酸酯酶、三酯酶(triesterase)、磷酸三酯酶、芳基酯酶、对氧磷酶(pon)、有机磷酸酐酶和二异丙基氟磷酸酶(dfpases)的酶。在本发明的一个方面，op生物清除剂是化学计量的op生物清除剂。优选地，化学计量的op清除剂是选自乙酰胆碱酯酶(ache)和丁酰胆碱酯酶的胆碱酯酶。优选地，胆碱酯酶是buche。根据本发明的一个方面，胆碱酯酶(包括丁酰胆碱酯酶)可以根据已知技术从血清中纯化而来。因此，如果希望根据本发明的一个方面制备用于施用于人的缀合物，则人血清可以用作胆碱酯酶的来源。或者，根据本发明的另一方面，使用重组dna技术制备胆碱酯酶以及与催化op生物清除剂相关的各种酶。根据本发明的某些方面，胆碱酯酶(或与催化op生物清除剂相关的酶)的生产包括本领域已知的任何用于以下操作的方法：(i)通过基因工程生产重组dna，(ii)通过例如但不限于转染、电穿孔或显微注射将重组dna引入原核或真核细胞，(iii)培养所述转化细胞，(iv)表达蛋白质，例如组成型表达或诱导型表达，和(v)分离蛋白质，例如从培养基中或通过收获转化的细胞分离蛋白，以(vi)获得纯化的蛋白质。在本发明的优选方面，通过在合适的原核或真核宿主系统中表达产生蛋白质，其特征在于产生药理学上可接受的蛋白质分子。真核细胞的实例是哺乳动物细胞，例如cho、cos、hek293、bhk、sk-hip和hepg2。在另外的方面，多种载体用于制备蛋白质，其选自真核和原核表达载体。用于原核表达的载体的实例包括质粒，例如但不限于preset、pet和pad，其中用于原核表达载体的启动子包括lac、trc、trp、reca或arabad中的一个或多个。用于真核表达的载体的实例包括：(i)用于在酵母中表达的载体，例如但不限于pao、ppic、pyes或pmet，其使用例如但不限于aox1、gap、gal1或aug1的启动子；(ii)用于在昆虫细胞中表达的载体，例如但不限于pmt、pac5、pib、pmib或pbac，其使用诸如但不限于ph、p10、mt、ac5、opie2、gp64或polh的启动子，以及(iii)用于在哺乳动物细胞中表达的载体，例如但不限于psvl、pcmv、prc/rsv、pcdna3或pbpv，以及一方面来源于病毒系统的载体，例如但不限于牛痘病毒、腺相关病毒、疱疹病毒或逆转录病毒，其使用例如但不限于cmv、sv40、ef-1、ubc、rsv、adv、bpv和β-肌动蛋白的启动子。buche的测定法在本领域中是已知的，buche高效地催化乙酰硫代胆碱(atch)—酶的天然底物的硫类似物的水解。可以使用其他硫醇胆碱底物，包括s-丁酰硫基胆碱(btch)碘化物。在水解时，该底物类似物产生乙酸盐和硫代胆碱。硫代胆碱在高反应性二硫代二硝基苯甲酸(dtnb)离子存在下产生黄色，其是可见的并且可以通过在405nm的分光光度吸收进行定量监测。这些技术在以下文献中描述，所有这些文献都通过引用并入本文：g.l.ellman,k.d.courtney,v.andres和r.m.featherstone,“anewandrapidcolorimetricdeterminationofacetylcholinesteraseactivity,”biochemicalpharmacology,vol.7,no.2,pp.8895,1961；m.a.gordon,d.e.carpenter,h.w.barrett和i.b.wilson,“determinationofthenormalityofcholinesterasesolutions,”analyticalbiochemistry,vol.85,no.2,pp.519527,1978；以及v.gorun,i.proinov,v.baltescu,g.balaban,和o.barzu,“modifiedellmanprocedureforassayofcholinesterasesincrudeenzymaticpreparations,”analyticalbiochemistry,vol.86,no.1,pp.324326,1978。根据本发明的一个方面，hbuche的内源性前导肽可用于蛋白质的重组表达。然而，更优选地，应选择前导肽以最大化蛋白质表达的水平。在优选实施方案中，使用ctla4前导肽。最优选地，优选seqidno.18所示的前导肽。根据本发明的优选方面，两性离子聚合物由具有磷酸胆碱基团的单体形成。优选单体是2-(丙烯酰氧基乙基)-2'-(三甲基铵乙基)磷酸酯。更优选地，单体是2-(甲基丙烯酰氧基乙基)-2'-(三甲基铵乙基)磷酸酯(hema-pc)。缀合于生物清除剂的聚合物优选具有至少2个聚合物臂，更优选3个或更多个臂。一些聚合物具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个臂。更优选地，聚合物具有3、6或9个臂。最优选地，聚合物具有9个臂。优选地，聚合物具有300,000-1,750,000da的峰值分子量。更优选地，聚合物具有500,000-1,000,000da的峰值分子量。更优选地，聚合物具有600,000-800,000da的峰值分子量。除非另有说明，支链聚合物的分子量是指所有臂的总分子量。根据本发明的一个方面，可用于缀合聚合物的、蛋白质上的亲核基团(包括抗体)包括但不限于：(i)n-末端胺基，(ii)侧链胺基，例如赖氨酸，(iii)侧链巯基，例如半胱氨酸，和(iv)糖羟基或氨基，在此处蛋白被糖基化。胺、硫醇和羟基是亲核的并且能够与接头部分和接头试剂上的亲电子基团反应形成共价键，该连接到聚合物上的接头部分和接头试剂包括：(i)活性酯如nhs酯、hobt酯、卤代甲酸酯和酰卤；(ii)烷基和苄基卤化物，例如卤代乙酰胺；(iii)醛、酮、羧基和马来酰亚胺基团。许多包括抗体在内的蛋白质都具有潜在地用于缀合的半胱氨酸硫醇基团。优选地，通过重组dna技术加入半胱氨酸残基用于缀合。许多半胱氨酸残基是可还原的链间二硫键，即半胱氨酸桥的形式。通常不能获得二硫化物形式的半胱氨酸残基以与诸如马来酰亚胺的试剂反应。半胱氨酸残基也可以是游离的或未配对的。然而，经常发现游离半胱氨酸残基被各种培养基中的一种或多种试剂“封端(capped)”，并且也不可用于缀合。可以通过用诸如dtt(二硫苏糖醇)或三羰基乙基膦(tcep)的还原剂处理使半胱氨酸残基具有与诸如马来酰亚胺的接头试剂缀合的反应性，使得蛋白质被完全或部分还原。因此，每个半胱氨酸桥理论上将形成两个反应性硫醇亲核试剂。在游离半胱氨酸的情况下，通过还原形成一种硫醇亲核试剂。根据所使用的条件，被tcep或dtt还原可导致适当的蛋白质折叠的丧失并伴随着活性的丧失。然而，通过允许在适当条件下的蛋白质重折叠可以恢复活性。可以通过赖氨酸残基的修饰将另外的亲核基团引入抗体，例如通过使赖氨酸残基与2-亚氨基四氢噻吩(traut's试剂)反应，使得胺转化为硫醇。通过引入一个、两个、三个、四个或更多个半胱氨酸残基(例如通过制备包含一个或多个非天然半胱氨酸氨基酸残基的变体)，可将反应性硫醇基团引入蛋白质。根据本发明的优选方面，丁酰胆碱酯酶融合物对应于seqidno.2，用于与聚合物缀合的cys残基是在氨基酸672处的cys残基。根据本发明的一个方面，提出了一种用于治疗或预防op中毒的方法，其中在有效的方案中将本发明的缀合物或融合蛋白施用于有需要的患者。关于预防，与从普通公众中随机选择的个体的对照群相比，将要或可能以统计学上显著较高的频率暴露于op化合物(op农药或op神经毒剂)的个体会需要本发明。例如，在战场或犯罪背景下可能暴露于op神经毒剂的士兵或执法办公室人员可能需要本发明。类似地，参与向农作物施用op农药的工人可能需要本发明，负责处理农药或神经毒剂意外泄漏的工作人员也可能需要本发明。虽然可能有防护服和防毒面具来防止暴露，但这种保护措施可能无法提供保护。在这种情况下，可以采用本预防方法。在本发明的优选方面，缀合物或融合蛋白通过静脉内给药、皮下给药、肌内给药、病灶内给药或皮内给药来施用。优选地，通过肌内给药施用。在本发明的另一方面，提出了一种针对op中毒进行长期预防的方法，其中在预期暴露于op化合物前至少7天施用缀合物，所述缀合物具有选自化学计量的有机磷(op)生物清除剂和与两性离子聚合物共价结合的催化op生物清除剂的有机磷生物清除剂，其中所述聚合物具有一种或多种类型的单体单元，并且其中至少一种类型的单体单元具有两性离子基团。换句话说，这种预防性施用的缀合物对可能的暴露于op中毒保持至少七天有效。在本发明的优选方面，缀合物在预期暴露于op神经毒剂前至少14天施用。更优选地，缀合物在预期暴露于op神经毒剂前至少21天施用。更优选地，缀合物在预期暴露于op神经毒剂之前至少30天施用。或者换句话说，针对可能的暴露于op，缀合物提供至少14、21或30天的有效保护。在本发明的另一方面，提出了一种用于快速预防op中毒的方法，其中在预期暴露于op化合物之前至少12小时施用缀合物，所述缀合物具有选自化学计量的有机磷(op)生物清除剂和与两性离子聚合物共价结合的催化op生物清除剂的有机磷生物清除剂，其中所述聚合物具有一种或多种类型的单体单元，并且其中至少一种类型的单体单元具有两性离子基团。更优选地，缀合物在预期暴露于op化合物之前至少24小时施用。换句话说，缀合物保持至少12或24小时的有效保护。本发明的药物组合物还可以包含药学上可接受的稀释剂、佐剂或载体。适于口服给药的药物组合物可以作为离散单元例如胶囊、溶液、糖浆或悬浮液(在水性或非水性液体中)提供，或作为可食用泡沫或泡沫状物提供，或作为乳剂提供。用于片剂或硬胶囊的合适的赋形剂包括乳糖、玉米淀粉或其衍生物、硬脂酸或其盐。与软明胶胶囊一起使用的合适的赋形剂包括例如植物油、蜡、脂肪、半固体或液体多元醇等。为了制备溶液和糖浆，可以使用的赋形剂包括例如水、多元醇和糖。为了制备悬浮液，可以使用油(例如植物油)来提供水包油或油包水悬浮液。其中载体是固体的适于鼻腔给药的药物组合物包括具有例如20-500微米范围内的粒度的粗粉末，其以摄取鼻烟的方式施用，即通过从被保持靠近鼻子的粉末容器经由鼻通道快速吸入。其中载体为液体的、作为鼻喷雾剂或鼻滴剂给药的合适的组合物包括活性成分的水溶液或油溶液。适于通过吸入给药的药物组合物包括可以通过各种类型的剂量计量加压气喷器、喷雾器或吹入器产生的细颗粒粉末或雾。适于肠胃外给药的药物组合物包括水性和非水性无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质，其使制剂基本上与预期接受者的血液等渗；以及可以包含悬浮剂和增稠剂的水性和非水性无菌悬浮液。可用于可注射溶液的赋形剂包括例如水、醇、多元醇、甘油和植物油。组合物可以在单位剂量或多剂量容器中提供，例如密封的安瓿瓶和小瓶中，并且可以在冷冻干燥(冻干)条件下储存，其仅需在使用前加入无菌液体载体，例如用于注射液的水即可。临场注射溶液和悬浮液可以由无菌粉剂、颗粒剂和片剂制备。药物组合物可以是基本上等渗的，意味着约250-350mosm/kg水的重量摩尔渗透压浓度(osmolality)。通常，药物组合物可以含有防腐剂、增溶剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、甜味剂、着色剂、气味剂、盐(本发明的物质本身可以以药学上可接受的盐的形式提供)、缓冲剂、包衣剂或抗氧化剂。除了本发明的物质之外，它们还可以含有治疗活性剂。本发明的药物组合物可以与药学上可接受的稀释剂、佐剂或载体组合使用。这样的赋形剂可以包括但不限于盐水、缓冲盐水(例如磷酸盐缓冲盐水)、葡萄糖、脂质体、水、甘油、乙醇及其组合。药物组合物可以以对治疗患者疾病有效的任何有效方便的方式施用，包括例如通过口服、静脉内、皮下、肌内、骨内、鼻内途径等施用。在治疗中或作为预防剂，活性剂可作为可注射组合物施用于个体，例如作为无菌水性分散体，优选等渗无菌水性分散体。对于施用于哺乳动物，特别是人，预期活性剂的日剂量为0.01mg/kg体重，通常为约1mg/kg。无论如何，医生将根据包括个体的年龄、体重、性别和反应在内的因素确定最适合个体的实际剂量。上述剂量是平均情况的示例。当然，可以存在使用更高或更低剂量的实例，并且这些在本发明的范围内。根据待治疗的疾病或病症、待治疗的个体的年龄和状况等，本发明物质的剂量可以在宽的范围内变化，并且医师将最终确定适当的剂量。该剂量可以按适当的频率重复。如果发生副作用，可以根据正常的临床实践减少剂量的量和/或频率。在一个实施方案中，药物组合物可以每1-3天施用一次。本发明的药物组合物可以单独使用或与其他化合物结合使用，其他化合物例如治疗性化合物或分子，例如氨基甲酸酯、抗毒蕈碱、胆碱酯酶活化剂和抗惊厥药。可以与其他化合物同时地、分开地或顺序地施用。组分可以以试剂盒的形式制备，试剂盒可以视情况包括说明书。优选地，将本发明的药物组合物和其他治疗性化合物直接(相对于什么？)施用于有需要的患者。本发明还提供了包含本发明的药物组合物和包含但不限于用于口服给药的胶囊、用于肺部给药的吸入剂和用于肠胃外给药的可注射溶液的给药载体的成套试剂盒。如本文所用，术语“治疗”包括可以使人或非人动物受益的任何方案。“非人动物”的治疗延伸到对家畜的治疗，家畜包括马和宠物(例如猫和狗)以及农场/农业动物，农场/农业动物包括绵羊、犬、猪、牛和马家族的成员。治疗可以是针对任何现有的病症或疾病，或者可以是预防性的(预防性治疗)。治疗可以针对遗传疾病或后天疾病。治疗可以针对急性或慢性疾病。根据本发明的一个方面，提供了一种制备缀合物的方法，其具有在合适的条件下使聚合物试剂与包含游离巯基残基的生物活性剂接触从而提供缀合物的步骤，其中聚合物试剂具有以下结构：其中p为支链或非支链的水溶性聚合物；l1为第一接头，l2为第二接头，l3为第三接头，其中l1、l2和l3相同或不同，并且各自选自-c1-c12烷基-、-c3-c12环烷基-、(-(ch2)1-6-o-(ch2)1-6-)1-12-、(-(ch2)1-4-nh-(ch2)1-4)1-12-、-(ch2)1-12o-、(-(ch2)1-4-o-(ch2)1-4)1-12-o-、-(ch2)1-12-(co)-o-、-(ch2)1-12-(co)-nh-、-(ch2)1-12-o-(co)-、-(ch2)1-12-nh-(co)-、(-(ch2)1-4-o-(ch2)1-4)1-12-o-(ch2)1-12-、-(ch2)1-12-(co)-o-(ch2)1-12-、-(ch2)1-12-(co)-nh-(ch2)1-12-、-(ch2)1-12-o-(co)-(ch2)1-12-、-(ch2)1-12-nh-(co)-(ch2)1-12-、-(c3-c12环烷基)-、-(c1-c8烷基)-(c3-c12环烷基)-、-(c3-c12环烷基)-(c1-8烷基)-、-(c1-8烷基)-(c3-c12环烷基)-(c1-8烷基)-、-nh-(ch2ch2-o-)1-20-nh-(ch2ch2-o-)1-20-和-(ch2)0-3-芳基-(ch2)0-3-，键以及以上的任意组合；x选自f、cl、br和i；r1和r2相同或不同，并且选自h(条件为r1和r2不都是h)和一个或多个碱性基团，其中碱性基团选自其中r3、r4、r5、r6和r7相同或不同，并且选自键、h、氨基、芳基6-12和烷基1-6；其中r8和r9相同或不同，并且选自键、h、芳基6-12和烷基1-6；其中r10、r11、r12、r13和r14相同或不同，并且选自键、h、氨基、芳基6-12和烷基1-6以及一个或多个精氨酸残基。优选地，生物活性剂选自治疗性蛋白质和适体。更优选地，生物活性剂是治疗性蛋白质。治疗性蛋白质优选为细胞因子、酶、抗体和抗体片段。更优选地，治疗性蛋白质是fab。最优选地，fab是igg1。当生物活性剂是治疗性蛋白质时，游离巯基优选由蛋白质的半胱氨酸残基贡献。在本发明的某些方面，半胱氨酸残基是天然存在的半胱氨酸残基。或者，通过重组dna技术引入半胱氨酸残基。p优选为聚(环氧烷)、聚(mpc)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉或聚(n-丙烯酰基吗啉)。更优选地，p是聚(环氧烷)。更优选地，p是聚(环氧乙烷)，其更常被称为聚乙二醇或peg。其中p是peg，peg优选是支链的。优选地，分支peg具有两个臂。每个臂优选在约5kda至约40kda之间。更优选地，每个臂具有约20kda的peg的分子量。对于水溶性聚合物，本发明的聚合物试剂还包含至少一种水溶性聚合物片段。具有2至约2000个单体单元的、非肽的且水溶性的水溶性聚合物在本发明中特别有利。合适的水溶性聚合物的实例包括但不限于聚(亚烷基二醇)，例如聚(乙二醇)(“peg”)、具有水溶性的乙二醇和丙二醇的共聚物、聚(烯醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(羟烷基甲基丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酸羟烷基酯)、聚(糖)、聚(α-羟基酸)、聚(乙烯醇)、聚磷腈、聚噁唑啉、聚(mpc)和聚(n-丙烯酰基吗啉)，例如第5,629,384号美国专利中所述，该文献通过引用并入本文。在需要相对高的水溶性的一些应用中，水溶性聚合物不是聚(环氧丙烷)。在本发明的另一方面，p是聚(mpc)。聚(mpc)优选具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个臂。更优选地，聚(mpc)具有3、6或9个臂。最优选地，聚(mpc)具有9个臂。根据本发明的一个方面，聚(mpc)优选具有300,000-1,750,000道尔顿，更优选500,000-1,000,000道尔顿，更加优选600,000-800,000道尔顿的峰值分子量。根据本发明的优选方面，l3为键，r2为h，r1为优选的，l2为-(ch2)1-6-。更优选地，l2为-(ch2)3-。在本发明的另一方面，提供了用于聚合物合成的引发剂，其具有以下结构：其中l1为第一接头，l2为第二接头，l3为第三接头，其中l1、l2和l3相同或不同，并且各自选自-c1-c12烷基-、-c3-c12环烷基-、(-(ch2)1-6-o-(ch2)1-6-)1-12-、(-(ch2)1-4-nh-(ch2)1-4)1-12-、-(ch2)1-12o-、(-(ch2)1-4-o-(ch2)1-4)1-12-o-、-(ch2)1-12-(co)-o-、-(ch2)1-12-(co)-nh-、-(ch2)1-12-o-(co)-、-(ch2)1-12-nh-(co)-、(-(ch2)1-4-o-(ch2)1-4)1-12-o-(ch2)1-12-、-(ch2)1-12-(co)-o-(ch2)1-12-、-(ch2)1-12-(co)-nh-(ch2)1-12-、-(ch2)1-12-o-(co)-(ch2)1-12-、-(ch2)1-12-nh-(co)-(ch2)1-12-、-(c3-c12环烷基)-、-(c1-c8烷基)-(c3-c12环烷基)-、-(c3-c12环烷基)-(c1-8烷基)-、-(c1-8烷基)-(c3-c12环烷基)-(c1-8烷基)-、-nh-(ch2ch2-o-)1-20-nh-(ch2ch2-o-)1-20-和-(ch2)0-3-芳基-(ch2)0-3-，键以及以上的任意组合；r1和r2相同或不同，并且选自h(条件为r1和r2不都是h)，和一个或多个碱性基团，其中碱性基团选自其中r17和r18是c1-6烷基，优选其中r17和r18都是甲基，其中r6、r7、r8、r9和r10相同或不同，并且选自键、h、氨基、芳基6-12和烷基1-6；其中r11和r12相同或不同，并且选自键、h、芳基6-12和烷基1-6；其中r13、r14、r15、r16和r17相同或不同，并且选自键、h、氨基、芳基6-12和烷基1-6以及一个或多个精氨酸残基；且r3、r4和r5相同或不同，并且选自：其中y为ncs、f、cl、br或i。优选地，y为br。r3、r4和r5优选各自为更优选地，r3、r4和r5各自为更加优选地，r4、r5和r6各自为在本发明的一个方面，l3为键，r2为h，r1为l2优选为-(ch2)1-6-。更优选的，l2为-(ch2)3-。iv.实施例实施例1.rbuche截短物通过在524位(指成熟蛋白)上截短hbuche酶来制备op生物清除剂(rhbuche524)。此外，引入突变c66y。rhbuche524(c66y)的蛋白质序列示于seqidno.10。如果希望将聚合物与rhbuche524(c66y)缀合，则可以在末端加入ggc或gggc序列(seqidno.20)。rhbuche524gggc(c66y)的蛋白质序列示于seqidno.12(公开的“gggc”示于seqidno.20)。另一种生物清除剂是通过在位置534(指成熟蛋白)上截短hbuche来制备的。rhbuche534(c66y)的序列示于seqidno.10。对于使用半胱氨酸与聚合物的缀合，任选地将ggc加入到末端。rhbuche534ggc(c66y)的蛋白质序列为seqidno.13。实施例2.rbuche融合蛋白借助重组基因工程，通使用上述534截短物并将其融合到igg1的fc区来制备rhbuche融合蛋白，其中在两个蛋白质片段之间具有gs接头(gggsgggsgggs)(seqidno.21)。rhbuche534-fc序列显示于seqidno.16。具有c66y突变的融合构建体(rhbuche534(c66y)-fc)显示于seqidno.17。在另一个形式中，引入了各种效应子功能突变：l234a、l235e、g237a、a330s和p331s。hbuche534(c66y)-fc(l234a、l235e、g237a、a330s和p331s)融合物显示于seqidno.15。可以工程化进入蛋白质的fc部分的另一个突变是q347c，其可用于将诸如poly(mpc)的聚合物与蛋白质缀合。rhbuche534(c66y)-fc(l234a、l235e、g237a、a330s、p331s和q347c)的蛋白质序列示于seqidno.2。使用用于真核基因表达的合适的dna构建体在cho-k1细胞中表达各种蛋白质构建体。尽管内源性hbuche前导序列可用于构建体(参见seqidno.1)的重组表达，但优选ctla4前导序列，其序列示于seqidno.18。用于表达rhbuche534(c66y)-fc(l234a、l235e、g237a、a330s、p331s和q347c)的dna序列示于seqidno.9。实施例3.构建体的瞬时表达在expi293表达系统(gibco)中进行瞬时表达分析。检查了许多rhbuche524截短物的表达。一般来说，rhbuche524构建体未被表达或与相应的rhbuche534构建体一样未被表达。关于rhbuche534构建体，发现c66y构建体通常比没有这种改变的构建体更好地被表达。534构建体的瞬时表达数据总结于下表：表1实施例4.稳定的转染子基于瞬时表达分析的结果，由rhbuche534ggc(c66y)和rhbuche534(c66y)-fc(l234a、l235e、g237a、a330s、p331s和q347c)制备稳定的转化体。用于fc融合的稳定转染子使用seqidno.18所示的ctla4前导序列，该前导序列在seqidno.2所示的蛋白质的n-末端融合。该构建体的dna序列示于seqidno.9。实施例5.buche-fc融合蛋白与mpc聚合物的缀合seqidno.2的人buche-fc融合蛋白用tcep变性(如以下实施例6中所述)，以在fc链的347位提供游离半胱氨酸硫醇，然后进行有限的复性。然后将经tcep处理的buche-fc与750kda的聚合物缀合，其中使用相对于蛋白质过量15-50倍的聚合物，从而生成如下所示的缀合物。实施例6.buche-fc的脱帽和重折叠在室温下，在edta的存在下，用30倍摩尔过量的tcep将buche-fc融合物还原数小时。在该还原之后，对蛋白质进行通过uf/df洗涤tcep的步骤以将tcep浓度降低至约8倍摩尔过量。进一步进行uf/df和稀释以将tcep降低至小于1μm。然后使还原的buche-fc复性，在复性过程(通过单体buche-fc的消失和二聚体buche-fc的出现观察)后进行sds-page。复性后，如上所述进行蛋白质与聚合物的缀合。实施例7.聚合物r5743的合成对下面所示的聚合物r5743进行如下合成：按照如下步骤合成具有以下结构的tfa/胺盐引发剂(化合物l)。化合物l首先，合成具有以下结构的化合物k：化合物k在氮气下向200ml圆底烧瓶中加入化合物j(1.9g，2.67mmol，3.3当量)化合物j和化合物e(0.525g，0.81mmol，1.0当量)(参见以下结构)，化合物e接着加入二甲基甲酰胺(10ml)，然后加入二异丙基乙胺(2.5ml，14.6mmol，18当量)。将烧瓶用冰浴冷却至0℃。在约6分钟内向其中加入丙基膦酸酐溶液(50wt.％的乙酸乙酯溶液，2.5ml，4.04mmol，5当量)。将反应物升温至室温并搅拌15分钟。通过加入水(20ml)、饱和碳酸氢钠水溶液(20ml)和乙酸乙酯(100ml)淬灭反应。分离有机层，用乙酸乙酯(75ml)萃取水层。将合并的有机层用饱和碳酸氢钠水溶液(30ml)、0.5m柠檬酸水溶液(40ml)、水(25ml)和饱和氯化钠水溶液(40ml)洗涤，然后干燥(硫酸钠)、过滤并在真空下浓缩。得到无需进一步纯化即可使用的残余物，即2.0g(0.80mmol，99％)化合物k。1hnmr(400mhzdmso-d6):δ＝1.36(s,9h,occh3),1.90(s,54h,cc(ch3)2br),2.31(t,j＝7.2hz,6h,cch2ch2nh),2.98(d,j＝5.6hz,6h,cch2nh),3.04(q,j＝6.0hz,2h,och2ch2nh),3.18(s,2h,och2c),3.3-3.37(m,8h,ch2),3.47-3.55(m,12h,ch2),3.58(s,6h,och2c),3.87(s,6h,d)。在室温下进行30分钟，将反应物在真空下浓缩，用二氯甲烷(10ml)稀释，并真空浓缩。使用乙腈(10ml)溶解残余物，通过针筒式过滤器(acrodisccr25，pn4225t)过滤，并上样至制备hplc柱，用60％乙腈水溶液(含0.1％三氟乙酸)至98％乙腈(含0.1％三氟乙酸)洗脱。合并含有产物的试管，真空浓缩，冷冻并置于冷冻干燥器上，得到990mg(0.4mmol，两步产率50％)化合物l，其为白色粉末。1hnmr(400mhzdmso-d6):＝1.90(s,54h,cc(ch3)2br),2.31(t,j＝7.2hz,6h,cch2ch2nh),2.97-3.0(m,8h,cch2nh和och2ch2nh),3.17(s,2h,och2c),3.3(q,6h,ch2ch2nhc＝o),3.4-3.59(m,20h,ch2),3.87(s,6h,o＝cch2o),4.27(s,18h,cch2oc＝o),7.69-7.84(m,9h,ch2nhc＝o和nh3+)。lc-ms(es,m/z):[(m+2h)/2]+(c84h136br9n7o33+2h)/2的计算值＝1196.6；实验值1197.4。按照如下步骤合成具有以下结构的tfa/胺盐引发剂(化合物p)：化合物p向20ml的小瓶中加入化合物l(430mg，0.172mmol，1.0当量)(见上文)和α-叔丁氧基羰基氨基-ω-羧基十二(乙二醇)(154mg，0.215mmol，1.25当量)，然后加入n,n-二甲基甲酰胺(2ml)，然后加入n,n-二异丙基乙胺(0.18ml，1.03mmol，6当量)。将烧瓶用冰浴冷却至0℃。在1分钟内向其中加入丙基膦酸酐溶液(50wt.％的乙酸乙酯溶液，0.215ml，0.343mmol，2当量)。将反应物升温至室温并搅拌30分钟。通过加入水、饱和碳酸氢钠水溶液和乙酸乙酯淬灭反应。分离有机层，用乙酸乙酯萃取水层。合并的有机层用饱和碳酸氢钠水溶液、0.5m柠檬酸水溶液、水和饱和氯化钠水溶液洗涤，然后干燥(硫酸钠)、过滤并真空浓缩。得到无需进一步纯化即可使用的残余物，即0.6g(0.194mmol)如下所示的化合物n。lc-ms(es,m/z):[(m+2h-boc)/2]+(c111h189br9n8o46+2h-boc)/2计算值＝1496.3；实验值1497.2。化合物n在氮气下向100ml圆底中加入化合物n(0.6g)和二氯甲烷(4ml)然后加入三氟乙酸(3ml)。将反应物在室温下搅拌15分钟。将反应物在真空下浓缩。残余物用乙腈(3ml)溶解，通过针筒式过滤器(acrodisccr25，pn4225t)过滤，并上样至制备hplc柱，用50％乙腈(含0.1％三氟乙酸)在50％水(含0.1％三氟乙酸)中的溶液至90％乙腈(含0.1％三氟乙酸)洗脱。合并含有产物的试管，真空浓缩，冷冻并置于冷冻干燥器上，得到200mg(0.064mmol，两步产率37％)化合物p。1hnmr(400mhzdmso-d6):＝1.90(s,54h,cc(ch3)2br),2.3(brt,8h,cch2ch2nh和ch2ch2c＝o),3.0(m,8h,cch2nh和och2ch2nh),3.1-3.6(m,84h,och2c),3.87(s,6h,o＝cch2o),4.27(s,18h,cch2oc＝o),7.6-7.8(m,10h,ch2nhc＝o和nh3+)。lc-ms(es,m/z):[(m+2h)/2]+(c106h181br9n8o44+2h)/2计算值＝1496.3；实验值1496.6。实施例8.两性离子聚合物的制备通常将引发剂制备为约100mg/ml的dmf中的储备溶液。将引发剂和配体(2,2'-联吡啶)引入schlenk管中。使用干冰/丙酮混合物将所得溶液冷却至-78℃，并在真空下脱气10分钟。将管在氩气下再填充，并将保持在氩气下的催化剂(cubr，除非另有说明)引入到schlenck管中(引发剂/催化剂(cubr)/配体上的溴原子的摩尔比保持在1/1/2)。溶液立即变成深棕色。将schlenk管密封并立即通过施加短循环真空/氩气净化。通过将限定量的单体与200美制酒精度(proof)的脱气乙醇混合来制备hema-pc溶液，其中所述单体是在保持在氮气下的手套箱中制备的。将单体溶液逐滴加入schlenk管(经由套管)。温度保持在-78℃。对反应混合物施加彻底的真空至少10-15分钟直到溶液不再冒泡。然后将管用氩气再次填充并加热至室温。搅拌溶液，随着聚合反应的进行，溶液变粘。3-8小时后或过夜后，通过直接暴露于空气以将cu(i)氧化为cu(ii)使反应猝灭，混合物变成蓝绿色，使混合物通过硅胶柱以除去铜催化剂。通过旋转蒸发浓缩收集的溶液，将所得混合物用四氢呋喃沉淀或用水透析，然后冷冻干燥，得到自由流动的白色粉末。表2列出了根据本发明制备的示例性聚合物。表2表3实施例9.马来酰亚胺9-臂可缀合聚合物的制备按照如下步骤合成具有以下结构的马来酰亚胺可缀合的9-臂聚合物(q)：聚合物q可缀合聚合物q的制备如下：向20ml小瓶中加入编号160(表2)的聚合物(540mg，0.0007mmol，1.0当量)，并用水(4ml)溶解。向其中加入0.5m磷酸氢二钠水溶液(0.4ml)。在单独的小瓶中将3-马来酰亚胺基丙酸nhs酯(0.93mg，0.0035mmol，5当量)溶解在四氢呋喃(1ml)中。在室温下约2分钟内将nhs酯溶液加入到聚合物溶液中，将所得溶液搅拌30分钟。将反应物用水(约15ml)稀释，通过针筒式过滤器(acrodiscsupor，pn4612)过滤，并均匀地放入3个amicon离心膜透析管(30,000mwco)中。将管中物料稀释并与水(各约5ml)混合，置于离心机(rpm3000)中离心30分钟。移除滤液并对滤液进行分析，同时将保留物稀释并与水(约10ml/管)混合。将离心程序再重复5次，之后取出保留物并置于小瓶中。将amicon膜管用水冲洗(每个管2×约2ml)，并与保留物合并。通过针筒式过滤器(acrodiscsupor，pn4612)过滤保留物溶液，冷冻并置于冷冻干燥器上，得到508mg(94％)聚合物q，其为白色粉末。实施例10.马来酰亚胺9-臂共轭聚合物的制备使用与所述的可缀合聚合物q相同的技术合成具有以下结构的马来酰亚胺可缀合9-臂聚合物(r)：聚合物r实施例11.缀合物的活性测量如下表1所示的缀合的蛋白质和未缀合的蛋白质的buche酶活性。在表1中，rbuche534(c66y)为rhbuche534ggc，rbuche534fc为rhbuche534(c66y)-fc(l234a、l235e、g237a、a330s、p331s和q347c)：表4样品酶活性(eu/mg)s.d.(％)δ活性rbuche534(cho-k1)7244-rbuche534fc(cho-k1)7885-rbuche534-9a750khema-pc620414％rbuche534fc-9a750khema-pc74835％buche(人血浆)(对照)6404-rbuche(山羊乳)(对照)4235-rbuche(山羊乳)是指在转基因山羊中产生的rhbuche。总之，buche-fc融合蛋白保持良好的活性。此外，在与聚合物缀合之后，活性保持良好。对于fc构建体，与mpc聚合物缀合后的活性损失仅为5％。实施例12.buche的血浆稳定性为了确定rbuche534ggc(c66y)(seqidno.13)和rhbuche534(c66y)-fc(l234a、l235e、g237a、a330s、p331s和q347c)(seqidno.2)是否克服了与转基因山羊rbuche相关的稳定性问题，我们测试了在食蟹猴(cyno)血浆中这些构建体相比于人血浆来源的buche和转基因山羊rhbuche(全长)的稳定性。将样品引入市售的食蟹猴血浆中，随着时间推移取等量试样并通过埃尔曼氏测定法测定酶活性。图1显示在cyno血浆中于37℃下保存近35天后，rbuche534ggc(c66y))和rhbuche534(c66y)-fc(l234a、l235e、g237a、a330s、p331s和q347c)的活性都能很好的保持。这两种构建体都比金标准人血浆纯化而得的buche表现更好。相比之下，转基因山羊酶的活性随着时间的推移迅速下降，在研究结束时接近小于5％。还测定了与聚合物的缀合是否影响酶的稳定性。图2显示了活性-时间曲线，其中在4℃和37℃的条件下将与9臂750kda的hema-pc聚合物缀合的蛋白质rhbuche534(c66y)-fc(l234a、l235e、g237a、a330s、p331s和q347c)与来源于人血浆的buche进行对比。尽管与聚合物缀合的蛋白质的活性随时间有所下降，但其下降幅度不超过所观察到的来源于人血浆的酶。实施例13.神经毒剂对buche的体外抑制为了确定本发明的rbuches是否对神经毒剂具有活性，使用上述的埃尔曼氏测定法在下述op试剂存在下测定了缀合的和未缀合的不同buche批次：ga(塔崩(二甲氨基氰磷酸乙酯))、gb(沙林(甲氟膦酸异丙酯))、gd(梭曼(甲氟磷酸3,3-二甲基-2-丁基酯))、gf(环沙林(甲氟膦酸环己酯))、vx(v系神经毒剂(({2-[双(2-丙基)胺基]乙基}磺酰基)(甲基)膦酸乙酯)和vr(v系列神经毒剂(n,n-二乙基-2-(甲基-(2-甲基丙氧基)磷酰基)磺酰乙胺)。表2显示了人血浆rbuche、rbuche534＝rbuche534ggc(c66y)、rbuche534-fc＝rhbuche534(c66y)-fc(l234a、l235e、g237a、a330s、p331s和q347c)和rbuche534-fc-聚合物＝rhbuche534(c66y)-fc(l234a、l235e、g237a、a330s、p331s和q347c)-9臂750kda的hema-pc聚合物对各种神经毒剂的抑制常数ki。表5神经毒剂的ki(m-1min-1)从表中可以看出，包括缀合物在内的每个构建体非常接近标准人血浆buche。实施例14.buche构建体的体内药代动力学为了确定本发明的rhbuche534(c66y)-fc(l234a、l235e、g237a、a330s、p331s和q347c)(和相应的缀合物)的体内药代动力学性质，将构建体注射给药至c57bl/6背景的、羧酸酯酶es1敲除的纯合子小鼠(-/-)。duysen,e.g.,等人，productionofes1plasmacarboxylesteraseknockoutmicefortoxicitystudies(2011)chem.res.toxicol.24(11)1891-1898。这些es1ko小鼠完全缺乏血浆羧酸酯酶活性。据报道，相对于人，血浆羧酸酯酶升高小鼠中神经毒剂的ld50。duysen等人。按照上述的测试猴血清中血清稳定性的方法，在小鼠血清(c57bl/6)中测试下述各种构建体和缀合物的血清稳定性。结果相似(数据未显示)。在时间0(零)点将各种构建体和缀合物静脉内注射到4-6只小鼠的组中。然后在注射后的不同时间从动物中取出血液等份试样，并如上所述测量buche的活性。以下是注射入ko小鼠的试验物质的总结。表6在ko小鼠中体内pk研究的设计在取出的血液样品中监测buche酶活性，并根据上述活性数据进行归一化。表1中列出的各种构建体的pk数据示于图3中。实施例15.37℃下buche缀合物的缓冲液稳定性比较使用马来酰胺或碘乙酰胺将从转基因山羊的乳中纯化的全长rhbuche经由天然半胱氨酸与聚合物缀合。在图4中比较了这两种不同缀合物的稳定性。为了评估缀合物稳定性，将基于马来酰亚胺和碘乙酰胺的缀合物在磷酸盐缓冲盐水中在37℃、ph7.0的条件下孵育30天。取出等份试样，并通过sdspage分析游离蛋白质。结果见图1。碘代乙酰胺缀合物在30天内非常稳定，其曲线保持在时间零点设定的基线附近。相比之下，基于马来酰亚胺的缀合物迅速地从时间零点设定的基线跳离。因此，根据本发明，可以看出对于一些蛋白质基于碘乙酰胺的缀合物比马来酰亚胺缀合物在本质上更稳定。马来酰亚胺缀合物的不稳定性取决于蛋白质。许多马来酰亚胺缀合物相当稳定。实施例16.与来源于山羊的rhbuche缀合的马来酰亚胺750kda的mpc聚合物对于马来酰亚胺缀合，使用可热去保护的马来酰亚胺引发剂将mpc聚合物与buche缀合。如pct/us2012/060301所述合成具有上述结构的引发剂，即化合物aa(参见实施例6)：如pct/us2012/060301的实施例11所述进行mpc聚合物的合成以产生约750kda的6臂mpc聚合物。如第us61/875,099号美国临时申请所述，通过热去保护制备聚合物以用于缀合。将所得经热去保护的聚合物在tris缓冲盐水中在ph7.5、4℃的条件下与经tcep处理的buche缀合过夜。通过sdspage测定缀合。通过deae色谱从游离蛋白质和聚合物中纯化缀合物。实施例17.与山羊来源的rhbuche缀合的碘乙酰胺3臂250kda的mpc聚合物对具有以下结构的tfa/胺盐引发剂(化合物b)进行如下合成。首先，对具有以下结构的boc保护的3臂引发剂，即化合物a：进行如下制备：在氮气下向25ml圆底烧瓶中加入2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基氨基甲酸叔丁酯(66mg，0.26mmol，1.2当量)和(2,2,2-三(2-溴-2-甲基-丙酰氧基甲基)-乙氧基)-乙酸(按照pct/us2012/060301中所述的制备产品4.5的方法制备，该文献通过引用并入本文)(142mg，0.22mmol，1.0当量)，随后加入n,n-二甲基甲酰胺(2ml)，然后加入n,n-二异丙基乙胺(0.19ml，1.1mmol，5.0当量)。将烧瓶用冰浴冷却至0℃。在1分钟内向其中加入丙基膦酸酐溶液(50wt％的乙酸乙酯溶液，0.16ml，0.26mmol，1.2当量)。将反应物升温至室温并搅拌1.5小时。通过加水淬灭反应，然后用水和乙酸乙酯对其进行分配。分离有机层，水层用乙酸乙酯萃取。合并的有机层用水、饱和碳酸氢钠水溶液、水、0.5m柠檬酸水溶液、水洗涤，然后干燥(硫酸钠)、过滤并真空浓缩。将残余物加到硅胶柱(60ml)上，用70％乙酸乙酯和30％己烷洗脱。合并含有产物的试管，真空浓缩，得到150mg(0.17mmol，77％)化合物a。化合物a被去保护以生成化合物b，操作如下：在氮气下向20ml圆底中加入化合物a(120mg，0.14mmol，1当量)、二氯甲烷(2ml)，然后加入三氟乙酸(2ml，26.9mmol，192当量)。将反应物在室温下搅拌30分钟。将反应物用己烷二氯甲烷(20ml)稀释并在真空下浓缩。将反应物用己烷(50ml)稀释并真空浓缩(两次)，得到2.2g(2.73mmol，(含有残余二氯甲烷))化合物b。对具有以下结构的聚合物b2进行如下制备。将聚合物103(280mg，0.00123mmol，1.0当量)放入20ml小瓶中，并用水(2ml)溶解。向其中加入0.5m磷酸氢二钠(0.2ml)。在单独的小瓶中溶解碘乙酸n-羟基琥珀酰亚胺酯(1.6mg，0.00548mmol，4.5当量)的四氢呋喃(0.5ml)溶液。将nhs酯溶液在室温下在约2分钟内加入到聚合物溶液中，将所得溶液搅拌75分钟。将反应物用4:1的水:四氢呋喃(4ml)稀释，并置于amicon离心膜透析管(30,000mwco)中，将管置于离心机(rpm3000)中处理30分钟。移出滤液进行分析，同时将保留物稀释并与4:1的水:四氢呋喃(6ml)混合，并将管置于离心机(rpm3000)中处理30分钟。移出滤液进行分析，同时将保留物物稀释并与水(8ml)混合，置于离心机(rpm3000)中处理30分钟。移出滤液用于分析，同时将保留物稀释并与水(8ml)混合。重复3次以上该离心程序，然后取出保留物并置于小瓶中。用水(2×约2ml)冲洗amicon膜管，将冲洗液与保留物合并，将所得混合物冷冻并置于冷冻干燥机上，得到270mg(96％)聚合物b2，其为白色粉末。将聚合物b2与按照以上所述制备的经tcep处理的rhbuche缀合。使用相对于rhbuche约5倍摩尔过量比例的聚合物b2，在室温下在约ph8.5的碳酸钠缓冲液中过夜。通过deae色谱从游离聚合物和蛋白质中纯化缀合物。实施例18.通过碱性基团增强与3臂-250kda的碘乙酰胺mpc聚合物的缀合将各种碱性基团置于碘乙酰胺官能团附近，并测定其增强与rbuche缀合的能力。表7与来自山羊乳的rhbuche的缀合实施例19.聚合物r4341的合成首先，合成具有以下结构的r4163：具有如下所示结构的化合物r3329购自jstarresearch。在室温下将6gr3329与2.8gn-boc-2,2'-(亚乙二氧基)二乙胺在thf中混合。向其中加入8.2ml二异丙基乙胺，然后加入7.7ml丙基膦酸酐溶液(1.6m)。在室温下孵育30分钟后，用etoacmbe和水对反应混合物进行分配。然后用0.5m柠檬酸×1、饱和碳酸氢钠和饱和nacl洗涤。产物用硫酸镁干燥。r4163通过lcms被证实。接下来，从r4613中除去boc基团。将9.4gr4163溶于60ml二氯甲烷中。向其中加入60ml三氟乙酸。在室温下孵育10分钟。将溶液干燥。将固体物质溶于水/乙腈中，并通过rp-hplc纯化如下所示的r4180。接下来，制备具有以下结构的化合物r4203：将200mgr4180与43mgboc-l-ala-oh在2ml乙腈中混合。向其中加入200μl二异丙基乙胺，然后加入175μl丙基膦酸酐溶液(1.6m)。在室温下孵育20分钟后，加入水，将溶液搅拌5分钟。然后将溶液用乙酸酸化并在甲醇中稀释。通过rv-hplc纯化r4203。通过使用三氟乙酸除去boc官能团以制备tfa盐来制备用于聚合物合成的引发剂。将171mgr4203溶解在500μl三氟乙酸中，并在室温下孵育几分钟。通过rv-hplc纯化如下所示的r4235，r4235通过lcms和nmr被证实。然后使用r4235引发mpc聚合物合成以产生如下所示的化合物r4258：在25mlschlenk管中加入4.8mg的2,2'-联吡啶，然后加入47.7μl的引发剂(r4235)在dmf中的储备溶液(6.3mg的引发剂在63ul的dmf中)。将储备溶液脱气，然后加入2.8mgcubr，脱气，然后逐滴加入单体(甲基丙烯酸2-羟乙酯(hema)磷酰胆碱(pc))在乙醇中的溶液(1g单体在4ml乙醇中)。至少将反应混合物脱气1小时，并在3psi的ar下密封。使反应在室温下进行20小时。棕色显色(browncoloration)：猝灭，取样以进行转化和mw分析。通过透析(mwco为1kda)纯化，洗涤4次，之后冷冻干燥。最后，通过将碘乙酸酯基团放在单一伯胺上合成r4341。将聚合物r4258(100mg)溶于添加有磷酸盐缓冲液的水中。向其中加入100μl的6.5mg/ml碘乙酸n-羟基琥珀酰亚胺酯的thf溶液。5分钟后，再加入100μl酯，反应混合物在室温下孵育30分钟。用水稀释至约10ml，过滤，离心，透析(截留分子量为30kda)。再透析4次。用水稀释至约10ml，过滤并冷冻干燥：产品：mp：221.9kda，pdi1.10。实施例20.聚合物r4118的合成聚合物r4118如下所示：首先，按照上述步骤合成r4180。然后将r4180用于以下反应以制备rxxx1：将200mgr4180和107mgrxxx1溶于乙腈(2ml)中。向其中加入200微升n,n'-二异丙基乙胺和175微升丙基丙酸酐(50％乙酸乙酯溶液)。将该反应混合物在室温下孵育约3小时。加入3ml水，将溶液搅拌5分钟。将溶液用乙酸酸化并用1ml甲醇稀释。通过rv-hplc纯化rxxx1。用tfa除去boc保护基，得到tfa盐。将140mgrxxx1溶于1.5ml二氯甲烷中。向其中加入1.5ml的tfa。将该溶液在室温下孵育约2小时45分钟。真空除去tfa和二氯甲烷，将固体物质溶于水/乙腈。如下所示的化合物r4037通过rv-hplc纯化，并通过lcms得到证实。接下来，使用r4037作为引发剂制备mpc聚合物。向10mlschlenk管中加入4.8mg的2,2'-联吡啶，然后加入57.7μl的引发剂(r4037)于dmf中的储备溶液(6.2mg的引发剂在62ul的dmf中)中。将储备溶液脱气，然后加入2.9mgcu(i)br，脱气，然后逐滴加入单体(甲基丙烯酸2-羟乙酯(hema)磷酰胆碱(pc))在乙醇中的溶液(1g单体在4ml乙醇中)。至少将反应混合物脱气1小时，并在3psi的ar下密封。使反应在室温下过夜(20小时)。然后对如下所示的聚合物r4053进行sec/mals，发现其pdi为1.073，mp为213.7kda。然后通过使r4053与碘乙酸n-羟基琥珀酰亚胺酯反应制备化合物r4118。将150mg的聚合物在水中搅拌直到溶解并加入磷酸盐缓冲液。将3mg碘乙酸n-羟基琥珀酰亚胺酯溶于450μl的thf中。加入两份150μl的等份的nhs酯溶液，两次加入相隔5分钟。在室温下搅拌30分钟。用水稀释至约10ml，离心并透析(截留分子量为30kda)。用约10ml水重新透析5次。将上清液溶解在约10ml水中，过滤并冷冻干燥：sec/mals：mp215.3kda，pdi1.1。实施例21.聚合物r4440的合成首先，使r4180(如下)按照以下所示进行反应以产生boc保护的引发剂：将r4180(200mg)和r4247(111mg)溶于2ml乙腈中。加入200μln,n'-二异丙基乙胺，然后加入175μl丙基膦酸酐。将该溶液在室温下孵育25分钟。加水，接着加入乙酸，然后加入甲醇。通过rp-hplc纯化r4302。通过lcms证实产物身份。接下来，通过tfa从r4302中除去boc基团以产生如下所示的r4315。将173mgr4302溶于500μltfa中，并在室温下孵育80分钟。将溶液用水/乙腈稀释，产物通过rp-hplc纯化。用lcms和nmr证实产物身份。将化合物4315作为引发剂用于聚合物合成以制备mpc聚合物(r4367，如下所示)。在25mlschlenk管中加入4.8mg的2,2'-联吡啶，然后加入56.2μl引发剂(r4315)在dmf中的储备溶液(6.8mg的引发剂在63ul的dmf中)。将储备溶液脱气，加入2.8mgcu(i)br，脱气，然后逐滴加入单体({2-[(2-甲基-2-丙烯酰基)氧基]乙氧基}[2-(三甲基氨基)乙氧基]次膦酸)在乙醇中的溶液(1g单体在4ml乙醇中)。至少将反应混合物脱气1小时，并在3psi的ar下密封。使反应在室温下进行20小时。棕色显色：猝灭，取样以进行转化和mw分析。通过透析(mwco为1kda)纯化，洗涤4次，之后冷冻干燥。通过sec/mals分析所得聚合物，结果为：pdi1.1和mp200.7kda。最后，通过将碘乙酸n-羟基琥珀酰亚胺酯偶联至r4367制备如下所示的化合物r4440。将100mgr4367溶于800μl水中。向其中加入80μl的0.5m、ph7.4磷酸钠缓冲液。向缓冲溶液中加入100μl的6.5mg/ml碘乙酸n-羟基琥珀酰亚胺酯溶液。在室温下孵育5分钟，然后再加入100μl，并在室温下再孵育30分钟。用水稀释至约10ml，过滤，离心，透析(截留分子量为30kda)。从水中再透析4次。稀释至约10ml，过滤并冷冻干燥。sec/mals分析：mp206kda，pdi1.1。实施例22.聚合物r4342的合成首先，将r4180(参见上文)与boc-his(3-me)-oh反应以制备r4176，如下面的反应方案所示：将165mgr4180和50mgboc-his(3-me)-oh悬浮于乙腈中。r4180溶解但boc-his(3-me)-oh未溶解。加入165μl的n,n-二异丙基乙胺，酸溶解。随后，加入144μl多聚膦酸酐溶液，将反应混合物孵育约1小时。再加入80μl多膦酸酐溶液，将反应混合物静置45分钟。然后将反应混合物用乙酸酸化并用甲醇稀释。r4176通过rp-hplc纯化。接下来，通过tfa除去r4176的boc基团，得到如下所示的化合物r4182。将117mgr4176溶于500μl的tfa中，并在室温下孵育10分钟。然后将反应混合物用水/乙腈稀释，通过rv-hplc纯化r4182。将化合物r4182用作mpc聚合物合成的底物以制备化合物r4259。在25mlschlenk管中加入4.8mg的2,2'-联吡啶，然后加入57.1μl的引发剂(r4182)在dmf中的储备溶液(6.8mg的引发剂在68ul的dmf中)。将储备溶液脱气，然后加入2.8mgcubr，脱气，然后滴加单体甲基丙烯酸2-羟乙酯(hema)磷酰胆碱(pc)在乙醇中的溶液(1g单体在4ml乙醇中)。至少将反应混合物脱气1小时，并在3psi的ar下密封。使反应在室温下进行20小时。棕色显色：猝灭，取样以进行转化和mw分析。通过透析(mwco为1kda)纯化，洗涤4次，之后冷冻干燥。sec/mals：pdi＝1.1和mp＝225.7kda。最后，使化合物r4259与碘乙酸n-羟基琥珀酰亚胺酯反应，得到如下所示的化合物r4342。将100mg聚合物r4259溶解800μl水。向其中加入50μl的0.5m、ph7.4磷酸钠缓冲液中加入。加入100μl的6.5mg/ml的碘乙酸n-羟基琥珀酰亚胺酯的thf溶液。将该溶液在室温下孵育5分钟。再加入100μl的6.5mg/mlnhs酯/thf溶液。在室温下再孵育30分钟。用水稀释至约10ml，过滤，离心并透析(截留分子量为30kda)。再透析4次。用水稀释至约10ml，过滤并冷冻干燥。sec/mals：mp227.7kda，pdi1.1。实施例23.聚合物r4439的合成首先，将r4180(如上所示)与2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-5-(二甲基氨基)戊酸三氟乙酸盐进行如下所示的反应，得到化合物r4301。将200mgr4180溶于2ml乙腈中。将该溶液加入130mg溶解的2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-5-(二甲基氨基)戊酸三氟乙酸盐。加入300μl的n,n-二异丙基乙胺(dipea)，然后加入175μl丙基膦酸酐(t3p溶液)。将反应混合物在室温下静置约30分钟。再加入200μl的dipea和100μl的t3p，将反应混合物静置15分钟。混合物用水、乙酸和甲醇稀释。r4301通过rp-hplc纯化，并通过lcms证实。接下来，通过tfa从r4301中除去boc保护部分，得到化合物r4314。将93mg的r4301溶于500μl的tfa中。将反应混合物在室温下静置20分钟。此后，将反应混合物用水/乙腈稀释，通过rv-hplc对r4314进行纯化。然后将r4314用作mpc聚合物制备的底物以制备r4366。在25mlschlenk管中加入4.8mg2,2'-联吡啶基，然后加入56.9μl的引发剂(r4314)在dmf中的储备溶液(9.2mg的引发剂在92ul的dmf中)。将储备溶液脱气，然后加入2.8mgcubr，脱气，然后逐滴加入单体的乙醇溶液(1g在4ml乙醇中)。至少将反应混合物脱气1小时，并在3psi的ar下密封。使反应在室温下进行20小时。棕色显色：猝灭，取样以进行转化和mw分析。通过透析(mwco为1kda)纯化，洗涤4次，之后冷冻干燥。sec/mals：pdi＝1.1，mp＝233.4kda。最后，r4366与碘乙酸n-羟基琥珀酰亚胺酯反应生成r4439(如下所示)。将100mg聚合物r4366溶于800μl水中。向其中加入80μl的0.5m、ph7.4的磷酸钠缓冲液。向其中加入100μl6.5mg/ml的碘乙酸n-羟基琥珀酰亚胺酯的thf溶液。将反应混合物在室温下静置5分钟，此时再加入100μl的酯。将反应混合物在室温下静置30分钟。用水稀释至～10ml，过滤，离心并透析(截留分子量为30kda)。从水中再透析4次。稀释至～10ml，过滤并冷冻干燥：sec/mals：mp233.4kda，pdi1.1。实施例24.r4441的合成首先，将r4108(参见上文)与boc-dab(me2)-oh，tfa盐反应以制备r4308，如下方案所示：将200mg的r4180溶解在2ml乙腈中。然后将该溶液用于溶解106mg的boc-dab(me2)-oh，tfa盐。加入200μl的n,n-二异丙基乙胺(dipea)和265μl的丙基膦酸酐(t3p)。在室温下孵育15分钟。加入200μl的dipea和175μl的t3p，再孵育15分钟。加水，然后加乙酸。用甲醇稀释，通过rv-hplc纯化r4308。通过lcms进行证实。接下来，通过tfa除去boc保护基以提供r4331。将135mg的r4308溶于500μl的tfa中。将反应混合物静置15分钟。r4331通过rv-hplc纯化。然后将r4331用作聚合物合成的引发剂以提供聚合物r4368。在25mlschlenk管中加入4.8mg2,2'-联吡啶，然后加入56.2μl的引发剂在dmf中的储备溶液(7.1g的引发剂在71μl的dmf中)。将储备溶液脱气，然后加入2.8mg的cubr，脱气，然后逐滴加入单体的乙醇溶液(1g单体在4ml乙醇中)。将反应混合物至少放置1小时，在3psi的ar下密封，并使反应在室温下进行20小时。当进行棕色显色时，将反应淬灭，进行取样、转化和mw分析。通过透析(mwco为1kda)进行纯化，洗涤4次，之后冷冻干燥。sec/mals分析：pdi1.1，mp256.6kda。最后，r4368与碘乙酸n-羟基琥珀酰亚胺酯反应，得到如下所示的r4441。将100mgr4368溶于800μl水中。加入80μl的0.5m、ph7.4的磷酸钠缓冲液。加入100μl的6.5mg/ml的nhs酯溶液。在室温下放置5分钟，再加入100μl。静置(sit)30分钟。用水稀释至约10ml，过滤，离心，透析(截留分子量为30kda)。再透析4次。用水稀释至约10ml，过滤并冷冻干燥。sec/malsr4441mp256.6kda，pdi1.1。实施例25.聚合物r4320的合成首先，将r4108(参见上文)与boc-lys(me2)-oh反应以制备r4196。将200mg的r4180和74mg的boc-l-lys(me2)-oh溶于2ml乙腈中。向其中加入200μl的n,n-二异丙基乙胺(dipea)和204μl的丙基膦酸酐(t3p)。使反应混合物在室温下静置15分钟。然后将反应混合物用水稀释并搅拌5分钟。最后，将反应混合物用乙酸酸化并用甲醇稀释。r4196通过rv-hplc纯化，产物通过lcms证实。接下来，通过tfa除去r4196上的boc基团，得到如下所示的化合物r4211。将153mg的r4196溶于500μl的tfa中。溶液在室温下静置15分钟。用水/乙腈稀释。通过rv-hplc进行纯化。通过lcms和nmr对结构进行证实。接下来，r4211用作mpc聚合物制备的底物以制备聚合物r4255。在25ml的schlenk管中加入4.8mg的2,2'-联吡啶，然后加入57.7μl的引发剂在dmf中的储备溶液(8mg引发剂在80ul的dmf中)。将储备溶液脱气，然后加入2.8mg的cubr，脱气，然后逐滴加入单体的乙醇溶液(1g单体在4ml乙醇中)。至少将反应混合物脱气1小时，并在3psi的ar下密封。使反应在室温下进行20小时。棕色显色：猝灭，取样以进行转化和mw分析。通过透析(截留分子量为1kda)纯化，洗涤4次，之后冷冻干燥。sec/mals：pdi1.076，mp205.3。最后，通过将聚合物r4255偶联到碘乙酸n-羟基琥珀酰亚胺酯来制备聚合物r4320(如下所示)。将100mg的r4255溶于800μl的水中。向其中加入80μl的0.5m、ph7.4的磷酸钠缓冲液。加入100μl的6.5mg/mlnhs酯的thf溶液。搅拌5分钟，再加入100μl的nhs酯溶液。在室温下放置30分钟。用水稀释至约10ml，过滤，离心并透析(截留分子量为30kda)。稀释至～10ml，再透析4次。稀释至约10ml，过滤并冷冻干燥。sec/mals：mp：225.7kda，pdi：1.1。实施例26.聚合物r4438的合成首先，将r4180(如上所示)与boc-dap(me2)-ohtfa盐反应以制备如下所示的化合物r4300。将200mg的r4180和86mg的boc-dap(me2)-ohtfa盐溶解在2ml乙腈中。加入200μl的n,n-二异丙基乙胺(dipea)和175μl丙基膦酸酐溶液(t3p)，将溶液在室温下孵育约15分钟。加入40mg或更多的boc-dap(me2)-ohtfa盐，再加入200μl的dipea和100μl的t3p，然后在室温下再孵育10分钟。用水稀释，用乙酸酸化，然后用甲醇稀释。r4300通过rv-hplc纯化并通过lcms得到证实。接下来，通过tfa除去r4300上的boc基团，得到如下所示的r4307：将118mg的r4300溶于500μl的tfa中，将反应混合物静置20分钟。加入水/乙腈，化合物4307通过rf-hplc纯化并通过lcms得到证实。接下来，将r4307用作mpc聚合物合成的引发剂。在25ml的schlenk管中加入4.8mg的2,2'-联吡啶基，然后加入55.5μl的引发剂在dmf中的储备溶液(6.8mg的引发剂在68ul的dmf中)。将储备溶液脱气，然后加入2.8mgcubr，脱气，然后逐滴加入单体的乙醇溶液(1g单体在4ml乙醇中)。至少将反应混合物脱气1小时，并在3psi的ar下密封。使反应在室温下进行20小时。棕色显色：猝灭，取样以进行转化和mw分析。通过透析(mwco为1kda)纯化，洗涤4次，之后冷冻干燥。sec/mals：mp230.8kda，pdi1.1。最后，向r4307中加入碘乙酰胺官能团以制备化合物r4438(如下所示)。将100mg的r4307溶于800μl的水中。向其中加入80μl的0.5m、ph7.4的磷酸钠缓冲液。然后加入100μl的6.5mg/ml的nhs酯溶液，然后在室温下孵育5分钟。再加入100μl的6.5mg/ml的nhs酯溶液，并在室温下孵育约40分钟。用水稀释至约10ml，过滤，离心并透析(截留分子量为30kda)。再透析4次。用水稀释至约10ml，过滤并冷冻干燥。sec/mals：mp230.8kda，pdi1.1。实施例27.聚合物r4451的合成首先，将r4180(参见上文)与boc-高精氨酸·hcl(boc-homoarg-oh·hcl)反应以产生如下所示的r4366：将200mg的r4180溶于2ml乙腈中。将该溶液加入到80mg的可部分溶解的boc-高精氨酸·hcl中。加入175μl二异丙基乙胺(dipea)，似乎全部boc-高精氨酸·hcl都沉淀出来。然而，当加入200μl的丙基膦酸酐溶液(t3p)时，所有固体都溶解。将该反应混合物在室温下孵育40分钟。再加入81mg的boc-高精氨酸·hcl，然后加入200μl或更多的dipea和175μl的t3p。将反应混合物再孵育50分钟。将反应混合物用水稀释，r4366通过rv-hplc进行纯化，并通过lcms证实。接下来，除去boc基团以制备如图所示的化合物r4354：将90mg的r4366溶于500μl的tfa中。在室温下反应30分钟。加入水/乙腈。通过rv-hplc纯化，并通过lcms和nmr证实。接下来，将r4354用作mpc聚合物合成的底物以制备r4386。在25ml的schlenk管中加入4.8mg的2,2'-联吡啶，然后加入58.3μl的引发剂(r4354)在dmf中的储备溶液(7.4mg的引发剂在74ul的dmf中)。将储备溶液脱气，然后加入2.8mg的cubr，脱气，然后逐滴加入单体的乙醇溶液(1g单体在4ml乙醇中)。至少将反应混合物脱气1小时，并在3psi的ar下密封。使反应在室温下进行20小时。棕色显色：猝灭，取样以进行转化和mw分析。通过透析(mwco为3.5kda)进行纯化，之后进行冷冻干燥的步骤。sec/malspdi1.1，mp258.4kda。最后，向r4386中加入碘乙酰胺官能团以制备r4551(如下所示)。将100mg的r4386溶于800μl的水中。向其中加入80μl的0.5m、ph7.4的磷酸钠缓冲液。加入100μl的6.5mg/ml的碘乙酸n-羟基琥珀酰亚胺酯溶液。在室温下孵育5分钟，再加入100μl的nhs酯。在室温下孵育30分钟。用水稀释至约10ml，过滤，离心并透析(截留分子量为30kda)。从水中再透析4次。稀释至约10ml，过滤并冷冻干燥。sec/mals：mp258.4kda，pdi1.1。实施例28.peg试剂的合成peg试剂通过nhs酯与胺的偶合方便地制备。以胺官能团结尾的分支peg是可商购获得的。例如，根据本发明可以使用以下peg碘乙酰胺试剂：其中n为peg单元的数量。peg试剂r500通过以下反应方便地合成：实施例29rhbuche534(c66y)-fc(l234a、l235e、g237a、a330s、p331s、q347c)的哺乳动物表达载体、细胞系和表达优化。将含有rhbuche534(c66y)-fc(l234a、l235e、g237a、a330s、p331s、q347c)构建体的dna片段克隆到编码嘌呤霉素抗性基因的哺乳动物表达载体中。插入的序列示于seqidno.9。将具有插入的buche-fc融合物的表达载体称为构建体14。将构建体14转染到cho细胞中并构建稳定的转染池。将稳定池进行细胞系发育，分离稳定转染的克隆，称为c98。进行摇瓶研究以确定使用什么培养基和条件来最大化产生的蛋白质的量。每个烧瓶的接种密度为0.4×106个细胞/ml。结果列于下表2中：表8摇瓶实验实施例30.单分子引发剂共价连接到先前的atrp引发剂的碱性基团(例如，胍或叔胺)的引入导致了当添加配体(2,2'-联吡啶，bpy)时在atrp聚合过程中由于卤化铜物质(cubr)与这些碱性基团可能络合而引起的可能的干扰。该实施例测试本发明所要求保护的这种碱性基团是否也可以作为atrp方法中的配体，并且当旨在使用这种引发剂获得定制的聚合物时能够不使用这些化合物。已在苯乙烯聚合中报道了含有共价连接的叔胺基团的单分子atrp引发剂(polym.printrint201243(2)，第245页)。在乙烯基单体(苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯)的atrp系统中使用这种引发剂的目的仅仅是通过将胺共价连接到引发剂上以抑制外部试剂的使用，而不是为了与生物活性化合物有关的缀合目的。单分子引发剂的研究仅在需要加热的苯乙烯和mma上在有机溶剂(甲苯)中进行。根据作者所述，分子量得到适度控制。在更广泛的分布范围内实现了高分子量。报道了在atrp方法中使用胍分子作为配体，胍分子是作为胍-吡啶衍生物(二甲基亚乙基胍)亚甲基吡啶(dmegpy)或(四甲基胍)亚甲基吡啶(tmgpy)使用的。不使用这些结构作为苯乙烯和甲基丙烯酸甲酯控制聚合的atrp方法中的配体。仅获得低分子量聚合物(低于10,000da)。该实施例测试新引入引发剂的基团是否不干扰上述传统的atrp方法，并检查其在atrp聚合方法中用作配体的能力。在不引入任何bpy的条件下合成第一嵌段聚(hema-pc)(步骤1)，以检查聚合物的形成和分子量的控制。此步骤之后为引入bpy并逐渐添加单体(步骤2)，以检查根据以下图式的扩链反应和系统活性。化合物r4235用作参照。使用的所有其他化合物的结构如下所述：对于所有的引发剂，使用的方案都是相同的：未使用bpy作为配体的聚合方案。新鲜制备100mg/ml的引发剂的dmf溶液作为储备溶液。分配溶液以在schlenk管中引入5×10-6mol的引发剂。将溶液脱气，然后加入2.48mg的cubr(1.7×10-5mol)(未变色)。滴加hema-pc的乙醇溶液(1g，4ml)。将反应混合物置于3psi，并在室温下聚合20小时反应保持无色，并在每种情况下取等份试样以分析转化率和分子量(参见下表第1步)。在步骤2中，将bpy加入到步骤1的粗混合物中，随后向反应混合物中逐渐加入溶液形式的单体(hema-pc)(1g单体在2ml乙醇中)和4.8mg的bpy(3.1×10-5mol)(立即呈现棕色)。将反应密封，彻底脱气，均化，并使其在室温下进行直到变粘，然后进行最后猝灭。结果显示在下表9中：表9在参照物(化合物r4235)不存在bpy的情况下，在bpy存在下无聚合物形成。仅当将联吡啶作为配体引入反应混合物内时聚合反应才得以进行从而达到所需分子量和高转化率。对于表中列出的所有其他引发剂(化合物r4315、r4334、r4037、r4354、r4314、r4211和r4182)，在未向步骤1的反应中引入任何bpy配体的条件下，所有实例都进行了聚合反应。获得受控分子量和低pdi(1.2以下)。当在步骤2加入bpy并逐渐添加的hema-pc单体时，立即呈现棕色，表明铜物质与bpy的重新络合。在所有情况下，通过步骤1中获得的聚合物的扩链，聚合反应继续进行，得到所需的分子量和窄的多分散性。新引入的基团不仅参与中性ph下的缀合，而且还可以作为atrp中的有效配体。对于这种聚合，不需要使用外部配体(例如bpy)。上述或下文引用的所有专利申请、网站、其他出版物、登录号等的全部内容通过引用并入本文用于所有目的，其程度如同明确并单独地指出将每个单独文献如此通过引用并入。如果序列的不同版本与不同时间的登录号码相关联，则意旨与在本申请的有效申请日期的登录号相关联的版本。有效申请日期是指比引用该登录号(如果适用)的优先申请的实际提交日期或提交日期早的时间。同样，如果不同版本的出版物、网站等在不同时间被公开，则意指在申请的有效申请日期内最近公布的版本，除非另有说明。本发明的任何特征、步骤、要素、实施方案或方面可以与任何其他组合使用，除非另有特别说明。尽管出于清楚和理解的目的已经通过说明和示例的方式对本发明进行了详细的描述，但显而易见的是，可以在所附权利要求的范围内实施某些改变和修改。序列表seqidno.1(人丁酰胆碱酯酶p06276.1)天然前导序列，c66y突变和碳末端移除的结构域用下划线表示。seqidno.2(优选的rbuche534(c66y)-gs10-fc(w/突变)融合物)通过使用gs接头与igg1-fc连接(下划线)而结合的buche以及与野生型相比的氨基酸改变用下划线表示。seqidno.3(人acheaaa68151.1)前导肽用下划线表示。seqidno.5(芳基二烷基磷酸酶[巴士脱硫孤菌(desulfarculusbaarsii)dsm2075；adk83762.1])seqidno.6(人pon1,p27169.3)seqidno.7(来自欧洲乌贼(loligovulgaris)的二异丙基氟磷酸酶q7sig4.1)seqidno.8(人igg1)seqidno.9(优选的dna序列buche-gs10-fc(w/突变)融合物)seqidno.10(rbuche534)seqidno.11(rbuche524截短物w/c66y)seqidno.12(rbuche524gggc截短物w/c66y)seqidno.13(rbuche534ggc截短物w/c66y)seqidno.14(rbuche534(c66y)-gs10-fc(wt)融合物)gs接头用下划线表示。seqidno.15(rbuche534(c66y)-gs10-fc(无q347cw/效应子功能突变)融合物)gs接头和效应子功能突变用下划线表示。seqidno.16(rbuche534-gs10-fc(wt)融合物)gs接头用下划线表示。seqidno.17(rbuche534(c66y)-gs10-fc(wt)融合物)gs接头用下划线表示。seqidno.18(前导肽)maclgfqrhkaqlnlatrtwpctllffllfipvfckaseqidno.19(hbuche成熟蛋白质序列)序列表<110>kodiaksciencesinc.<120>丁酰胆碱酯酶两性离子聚合物缀合物<130>057768-470678<150>pct/us2015/056112<151>2015-10-16<150>62/065,471<151>2014-10-17<160>28<170>patentinversion3.5<210>1<211>602<212>prt<213>智人<400>1methisserlysvalthrileilecysileargpheleuphetrpphe151015leuleuleucysmetleuileglylysserhisthrgluaspaspile202530ileilealathrlysasnglylysvalargglymetasnleuthrval354045pheglyglythrvalthralapheleuglyileprotyralaglnpro505560proleuglyargleuargphelyslysproglnserleuthrlystrp65707580seraspiletrpasnalathrlystyralaasnsercyscysglnasn859095ileaspglnserpheproglyphehisglyserglumettrpasnpro100105110asnthraspleusergluaspcysleutyrleuasnvaltrpilepro115120125alaprolysprolysasnalathrvalleuiletrpiletyrglygly130135140glypheglnthrglythrserserleuhisvaltyraspglylysphe145150155160leualaargvalgluargvalilevalvalsermetasntyrargval165170175glyalaleuglypheleualaleuproglyasnproglualaprogly180185190asnmetglyleupheaspglnglnleualaleuglntrpvalglnlys195200205asnilealaalapheglyglyasnprolysservalthrleuphegly210215220gluseralaglyalaalaservalserleuhisleuleuserprogly225230235240serhisserleuphethrargalaileleuglnserglyserpheasn245250255alaprotrpalavalthrserleutyrglualaargasnargthrleu260265270asnleualalysleuthrglycysserarggluasngluthrgluile275280285ilelyscysleuargasnlysaspproglngluileleuleuasnglu290295300alaphevalvalprotyrglythrproleuservalasnpheglypro305310315320thrvalaspglyasppheleuthraspmetproaspileleuleuglu325330335leuglyglnphelyslysthrglnileleuvalglyvalasnlysasp340345350gluglythralapheleuvaltyrglyalaproglypheserlysasp355360365asnasnserileilethrarglysglupheglngluglyleulysile370375380phepheproglyvalserglupheglylysgluserileleuphehis385390395400tyrthrasptrpvalaspaspglnargprogluasntyrarggluala405410415leuglyaspvalvalglyasptyrasnpheilecysproalaleuglu420425430phethrlyslyspheserglutrpglyasnasnalaphephetyrtyr435440445phegluhisargserserlysleuprotrpproglutrpmetglyval450455460methisglytyrgluilegluphevalpheglyleuproleugluarg465470475480argaspasntyrthrlysalaglugluileleuserargserileval485490495lysargtrpalaasnphealalystyrglyasnproasngluthrgln500505510asnasnserthrsertrpprovalphelysserthrgluglnlystyr515520525leuthrleuasnthrgluserthrargilemetthrlysleuargala530535540glnglncysargphetrpthrserphepheprolysvalleuglumet545550555560thrglyasnileaspglualaglutrpglutrplysalaglyphehis565570575argtrpasnasntyrmetmetasptrplysasnglnpheasnasptyr580585590thrserlyslysglusercysvalglyleu595600<210>2<211>772<212>prt<213>人工序列<220><223>人工序列描述:合成多肽<400>2gluaspaspileileilealathrlysasnglylysvalargglymet151015asnleuthrvalpheglyglythrvalthralapheleuglyilepro202530tyralaglnproproleuglyargleuargphelyslysproglnser354045leuthrlystrpseraspiletrpasnalathrlystyralaasnser505560cystyrglnasnileaspglnserpheproglyphehisglyserglu65707580mettrpasnproasnthraspleusergluaspcysleutyrleuasn859095valtrpileproalaprolysprolysasnalathrvalleuiletrp100105110iletyrglyglyglypheglnthrglythrserserleuhisvaltyr115120125aspglylyspheleualaargvalgluargvalilevalvalsermet130135140asntyrargvalglyalaleuglypheleualaleuproglyasnpro145150155160glualaproglyasnmetglyleupheaspglnglnleualaleugln165170175trpvalglnlysasnilealaalapheglyglyasnprolysserval180185190thrleupheglygluseralaglyalaalaservalserleuhisleu195200205leuserproglyserhisserleuphethrargalaileleuglnser210215220glyserpheasnalaprotrpalavalthrserleutyrglualaarg225230235240asnargthrleuasnleualalysleuthrglycysserarggluasn245250255gluthrgluileilelyscysleuargasnlysaspproglngluile260265270leuleuasnglualaphevalvalprotyrglythrproleuserval275280285asnpheglyprothrvalaspglyasppheleuthraspmetproasp290295300ileleuleugluleuglyglnphelyslysthrglnileleuvalgly305310315320valasnlysaspgluglythralapheleuvaltyrglyalaprogly325330335pheserlysaspasnasnserileilethrarglysglupheglnglu340345350glyleulysilephepheproglyvalserglupheglylysgluser355360365ileleuphehistyrthrasptrpvalaspaspglnargprogluasn370375380tyrargglualaleuglyaspvalvalglyasptyrasnpheilecys385390395400proalaleugluphethrlyslyspheserglutrpglyasnasnala405410415phephetyrtyrphegluhisargserserlysleuprotrpproglu420425430trpmetglyvalmethisglytyrgluilegluphevalpheglyleu435440445proleugluargargaspasntyrthrlysalaglugluileleuser450455460argserilevallysargtrpalaasnphealalystyrglyasnpro465470475480asngluthrglnasnasnserthrsertrpprovalphelysserthr485490495gluglnlystyrleuthrleuasnthrgluserthrargilemetthr500505510lysleuargalaglnglncysargphetrpthrserphepheprolys515520525valleuglumetthrglyglyglyserglyglyglyserglyglygly530535540serasplysthrhisthrcysproprocysproalaproglualaglu545550555560glyalaproservalpheleupheproprolysprolysaspthrleu565570575metileserargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalser580585590hisgluaspprogluvallyspheasntrptyrvalaspglyvalglu595600605valhisasnalalysthrlysproargglugluglntyrasnserthr610615620tyrargvalvalservalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasn625630635640glylysglutyrlyscyslysvalserasnlysalaleuproserser645650655ileglulysthrileserlysalalysglyglnproarggluprocys660665670valtyrthrleuproproserargaspgluleuthrlysasnglnval675680685serleuthrcysleuvallysglyphetyrproseraspilealaval690695700glutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrpro705710715720provalleuaspseraspglyserphepheleutyrserlysleuthr725730735valasplysserargtrpglnglnglyasnvalphesercysserval740745750methisglualaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleu755760765serproglylys770<210>3<211>614<212>prt<213>智人<400>3metargproproglncysleuleuhisthrproserleualaserpro151015leuleuleuleuleuleutrpleuleuglyglyglyvalglyalaglu202530glyarggluaspalagluleuleuvalthrvalargglyglyargleu354045argglyileargleulysthrproglyglyprovalseralapheleu505560glyileprophealagluproprometglyproargargpheleupro65707580progluprolysglnprotrpserglyvalvalaspalathrthrphe859095glnservalcystyrglntyrvalaspthrleutyrproglypheglu100105110glythrglumettrpasnproasnarggluleusergluaspcysleu115120125tyrleuasnva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