黄芪丁酰胆碱酯酶抑制活性有效提取物及其组合物的医药用途和制备方法
【专利摘要】本发明属医药技术领域，具体涉及一种黄芪丁酰胆碱酯酶抑制活性提取物及其组合物的制备方法和其在制备预防及治疗阿尔茨海默病(AD)等丁酰胆碱酯酶抑制活性药物中的应用。维吾尔药黄芪经溶剂提取，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱，先用二氯甲烷洗脱，继用100:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂洗脱，100:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂洗脱液干燥，即得丁酰胆碱酯酶抑制活性提取物。
【专利说明】
黄庚τ醜胆碱醋酶抑制活性有效提取物及其组合物的医药 用途和制备方法
技术领域
[0001] 本发明属医药技术领域，具体设及一种黄巧下酷胆碱醋酶抑制活性提取物及其组 合物的制备方法和其制备预防及治疗阿尔茨海默病（AD)等下酷胆碱醋酶抑制活性药物中 的应用。
【背景技术】
[0002] 黄巧为豆科草本植物蒙古黄巧、膜芙黄巧的根，具有补气固表，利尿托毒，排脈，敛 疮生肌的功效。在高通量筛选的过程中，本发明意外地发现黄巧具有很好的抑制下酷胆碱 醋酶的活性，该活性提取物及其组合物有望应用于治疗阿尔茨海默病（AD)等方面的医药 用途。
【发明内容】
[0003] 本发明所解决的技术问题是提供一种黄巧提取物。
[0004] 本发明还提供了 W黄巧提取物为主要活性成分的组合物。
[0005] 本发明同时提供了黄巧提取物及其组合物的制备和在制备下酷胆碱醋酶抑制活 性药物中的应用。
[0006] 本发明是通过如下技术方案实现的： 维吾尔药黄巧经溶剂提取，提取液浓缩后，用硅胶（Si化）柱分离，上样后的硅胶柱，用 二氯甲烧-甲醇混合溶剂梯度洗脱(二氯甲烧-甲醇，比例见表1)，各二氯甲烧-甲醇比例 混合溶剂洗脱液，浓缩，干燥后，利用体外筛选体系测试其下酷胆碱醋酶抑制活性，意外地 发现先用二氯甲烧洗脱，继用二氯甲烧-甲醇混合溶剂仁氯甲烧-甲醇，100:1，体积比)洗 脱得到的二氯甲烧-甲醇混合溶剂(二氯甲烧-甲醇，100:1，体积比）洗脱液经回收有机溶 剂，干燥，即为下酷胆碱醋酶抑制活性提取物。而其他比例的洗脱部位，没有下酷胆碱醋酶 抑制活性的作用。优选的，先用二氯甲烧洗脱，继用二氯甲烧-甲醇混合溶剂(二氯甲烧-甲 醇，100:1，体积比）洗脱得到的二氯甲烧-甲醇混合溶剂仁氯甲烧-甲醇，100:1，体积比） 洗脱液干燥，即得下酷胆碱醋酶抑制活性提取物。即下酷胆碱醋酶抑制活性的提取物，可W 通过W上方法得到富集，从而与其他杂质类成分分离开。该黄巧下酷胆碱醋酶抑制活性提 取物从未见文献报道，其薄层色谱（TLC)分析结果见图1，TLC分析条件：GF254硅胶板，展 开系统：二氯甲烧：乙酸乙醋：甲醇（3:1:1)显色方法：香草醒-硫酸显色。
[0007] 具体，发现过程如下： 1、黄巧经甲醇超声提取物的制备 取维吾尔药黄巧20 g，经100 mL溶剂超声提取15 min,提取液浓缩后，得提取物 SN0210B，样品上柱：1.5569 g，拌样硅胶2.7 g，空白硅胶10 g，二氯甲烧-甲醇系统。
[0008] 2、二氯甲烧-甲醇混合溶剂梯度洗脱方法和结果 取维吾尔药黄巧20 g，经100 mL溶剂超声提取15 min,提取液浓缩后，得提取物 SN0210B，1. 5569 g上柱，甲醇溶解，共用甲醇15血。上硅胶柱色谱，拌样硅胶2.7 g，空白 硅胶10 g，玻璃柱内径2. 0cm，二氯甲烧-甲醇系统梯度洗脱(条件见表1)，柱体积11 1^，每 个梯度洗脱lOOmU得到，各个浓度提取洗脱液的洗脱物，回收溶剂，即得，二氯甲烧：甲醇 梯度洗脱提取物，TLC分析结果见图2, TLC分析条件：GF254硅胶板，展开系统：二氯甲烧： 乙酸乙醋：甲醇（3:1:1)，显色方法：香草醒-硫酸显色。
[0009] 表 1
3、抑制下酷胆碱醋酶活性筛选方法和结果 1) 实验条件 曰、材料：DMS0(二甲基亚讽）（科密欧公司）；KH2P04、K2HP04 '3&0(广东灿头市西晚化 工厂）；BuChE酶（美国Sigma公司）；PNPG(美国Sigma公司） b、实验仪器：多功能酶标仪Bio-Rad Model 680型度i〇-Rad L油oratories Inc.) 2) 实验方法和过程 样品处理：将1 mg待测样品溶于20 二甲基亚讽（DMS0)作为母液，取1 母液 加入249公L蒸馈水配成200 血1的溶液。
[0010] 下酷胆碱醋酶抑制活性测定方法： 在96孔板上测定样品的BuchE抑制活性。具体操作如下：在96孔板中依次加入25 公 L PBS (100 ml, pH 8. 0)，25 公 L BuChE (>0. 04 U/mL, pH 8. 0 PBS 溶解稀释），25 公L 样品溶液（200 · mL 1)。加 25 BuSCHd. 6 ml, pH 8. 0 PBS 溶解稀释）及 25 DTNB (4. 0 ml, pH 8. 0 PBS溶解稀释），37°C解育60 min后，用酶标仪在412 nm下测 定其吸光度值。样品抑制百分率按W下公式计算： 酶活性抑制率％ = [A空白-(?品-A背景）]/ A空白X 100 式中Age :不加样品反应后的吸收值； Afi。。。:加入样品反应后的吸收值； A胃胃:只加样品的吸收值。
[0011] 扣实验结果 表2
结果发现： 本发明的优选方案如下：维吾尔药黄巧经有机溶剂超声提取，提取液浓缩后，用硅胶柱 分离，上样后的硅胶柱，先用二氯甲烧洗脱，继用二氯甲烧-甲醇混合溶剂(二氯甲烧-甲 醇，100:1，体积比）洗脱，用二氯甲烧-甲醇混合溶剂(二氯甲烧-甲醇，100:1，体积比）洗 脱的洗脱液经回收有机溶剂，干燥，即为该下酷胆碱醋酶抑制活性提取物。该下酷胆碱醋酶 抑制活性提取物从未见文献报道，其TLC分析表征如图1。
[0012] 4、下酷胆碱醋酶抑制活性有效提取物的提取方法研究 1)提取溶剂的种类研究 分别用甲醇、丙酬、石油酸、氯仿、乙酸乙醋、甲醇水混合溶剂、乙醇水混合溶剂等有机 溶剂提取，并测试提取物的下酷胆碱醋酶抑制活性，实验结果如下： 表3
研究结果表明：提取用有机溶剂可w为甲醇、石油酸、丙酬、氯仿、乙酸乙醋、甲醇水混 合溶剂、乙醇水混合溶剂。
[0013] 2)提取溶剂的用量研究 分别用1、2、5、10、20、30、40、50倍(重量/体积比)有机溶剂提取，并测试提取物的下酷 胆碱醋酶抑制活性，结果如下： 表4
活性提取物的提取所用有机溶剂用量为药材重量的2-50倍(重量/体积比)。
[0014] 3 )干燥方法的研究 分别用真空干燥法、冷冻干燥法、鼓风干燥、离屯、干燥、旋蒸干燥法等方法，对得到的抑 制下酷胆碱醋酶活性提取物进行干燥，W含水量、化C、活性测试为指标，发现真空干燥法、 冷冻干燥法、鼓风干燥、离屯、干燥、旋蒸干燥法适用于对下酷胆碱醋酶抑制活性提取物进行 干燥，其中，最优为真空干燥法、冷冻干燥法。
[001引 表5
因此，黄巧下酷胆碱醋酶抑制活性提取物的制备方法为： 维吾尔药黄巧经有机溶剂超声提取，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱， 先用二氯甲烧洗脱，洗脱2-50倍柱体积，继用二氯甲烧-甲醇混合溶剂(二氯甲烧-甲醇， 100:1，体积比）洗脱，洗脱2-50倍柱体积，用二氯甲烧-甲醇混合溶剂(二氯甲烧-甲醇， 100:1，体积比）洗脱的洗脱液经回收有机溶剂，干燥，即为该活性提取物。W上条件最优为 先用二氯甲烧洗脱20倍柱体积，继用二氯甲烧-甲醇混合溶剂(二氯甲烧-甲醇，100:1，体 积比）洗脱15倍柱体积。其中， 1)提取物提取用有机溶剂可W为甲醇、石油酸、水、丙酬、氯仿、乙酸乙醋、甲醇水混合 溶剂、乙醇水混合溶剂，最优条件为甲醇和95%乙醇。活性提取物提取用有机溶剂用量为药 材重量的2-50倍(重量/体积比)。
[0016] 2)提取物干燥方法可W为真空干燥法、冷冻干燥法、鼓风干燥、离屯、干燥、旋蒸干 燥法等，最优为真空干燥法、冷冻干燥法。
[0017] 5.黄巧抑制下酷胆碱醋酶活性提取物（先用二氯甲烧洗脱，继用100:1的二氯甲 烧-甲醇混合溶剂洗脱后的提取物）的医药用途研究 按优化的黄巧下酷胆碱醋酶抑制活性提取物制备方法制备的活性提取物，经测试，其 下酷胆碱醋酶抑制活性为ICw=32. 1 μ g/mL。
[0018] 由于下酷胆碱醋酶抑制剂具有治疗阿尔茨海默病等方面的医药用途。因此，我们 发现的黄巧下酷胆碱醋酶抑制活性提取物具有广泛的医药用途。
[0019] 6、黄巧抑制下酷胆碱醋酶活性提取物的组合物及其制备方法研究 1)固体分散体 处方 黄巧提取物 20 g Vc 1邑 聚乙締化咯烧酬 79 g 固体分散lOOg 制备方法： 称取黄巧提取物和载体聚乙締化咯烧酬（PVP)按比例1:2、1:4、1:6的质量比分别放入 烧杯中，加入适量的无水乙醇和Vc，用磁力揽拌器揽拌至黄巧提取物和载体完全溶解，充分 混合均匀后转入旋蒸仪中除去有机溶剂，干燥，粉碎过80目筛，即得黄巧有效提取物PVP包 合物。
[0020] 2)环糊精包合物 处方： 黄巧提取物 20 g Vc 1邑 β -环糊精 79 g 包合物lOOg 制备方法： 将β-环糊精与1~5倍水研匀，加黄巧有效提取物（水难溶性的应先溶于少量有 机溶剂中）继续充分研磨至成糊状物，低溫干燥即得环糊精包合物。
[0021] 3)分散片处方： 黄巧提取物 100 十二烷基硫酸钢 1 Vc 1 预胶化淀粉 10 可溶性淀粉 100 交联聚维酬 10 微晶纤维素 9 微分硅胶 0. 3 滑石粉 1 100片 制备方法： 1. 黄巧有效提取物分散体的制备，精密称取黄巧提取物、Vc，加入处方量的十二烷基硫 酸钢，用适量的浓度为70%乙醇溶解并加入等比例的可溶性淀粉混合均匀后，在70°C的溫 度下蒸干，粉碎，过100目筛； 2. 将第一步中的黄巧有效提取物淀粉分散体与处方量的交联聚维酬，预胶化淀粉，用 适量的浓度为70%乙醇做湿润剂，边加入边揽拌，制成湿颗粒过14目筛，室溫下放置15min 后，60°C烘箱烘干45min，16目筛整粒，加入处方量的滑石粉和微分硅胶，混合均匀后，压 片即得。
[0022] 7、黄巧抑制下酷胆碱醋酶活性提取物的检测方法研究 我们发现，可W用薄层色谱的方法，很好地检测和标示黄巧下酷胆碱醋酶抑制活性提 取物的特征。见图1。
[002引具体条件为：GF254硅胶板，展开系统：二氯甲烧：乙酸乙醋：甲醇（3:1:1)显色方 法：香草醒-硫酸显色。
[0024]
【附图说明】： 图1黄巧下酷胆碱醋酶抑制活性提取物的TLC色谱图； 图2黄巧溶剂提取物的TLC色谱图。
【具体实施方式】
[0025] W下实施例表示本发明的实用性，本发明不受此限制。
[0026] 实施例1 : 取维吾尔药黄巧20 g，经100血甲醇超声提取15 min,提取液浓缩后，用硅胶柱分 离，上样后的硅胶柱（2. 0cm内径小柱)，先用二氯甲烧洗脱，洗脱15倍柱体积，继用二氯 甲烧-甲醇混合溶剂（二氯甲烧-甲醇，100:1，体积比）洗脱，洗脱25倍柱体积，用二氯甲 烧-甲醇混合溶剂(二氯甲烧-甲醇，100:1，体积比)洗脱的洗脱液经回收有机溶剂，真空干 燥，即为该活性提取物。经测试，其下酷胆碱醋酶抑制活性为此5。=86.0 ygAiL。
[0027] 实施例2 : 取维吾尔药黄巧20 g，经100 mL乙醇超声提取15 min,提取液浓缩后，用硅胶柱分 离，上样后的硅胶柱（2. 0cm内径小柱)，先用二氯甲烧洗脱，洗脱15倍柱体积，继用二氯 甲烧-甲醇混合溶剂（二氯甲烧-甲醇，100:1，体积比）洗脱，洗脱25倍柱体积，用二氯甲 烧-甲醇混合溶剂(二氯甲烧-甲醇，100:1，体积比)洗脱的洗脱液经回收有机溶剂，冷冻干 燥，即为该活性提取物。经测试，其下酷胆碱醋酶抑制活性为此5。=90.0 ygAiL。
[002引实施例3 : 取维吾尔药黄巧20 g，经100 mL石油酸超声提取15 min,提取液浓缩后，用硅胶柱分 离，上样后的硅胶柱（2. 0cm内径小柱)，先用二氯甲烧洗脱，洗脱15倍柱体积，继用二氯 甲烧-甲醇混合溶剂（二氯甲烧-甲醇，100:1，体积比）洗脱，洗脱25倍柱体积，用二氯甲 烧-甲醇混合溶剂(二氯甲烧-甲醇，100:1，体积比)洗脱的洗脱液经回收有机溶剂，旋蒸干 燥法，即为该活性提取物。经测试，其下酷胆碱醋酶抑制活性为此5。=79.0 ygAiL。
[002引 实施例4 : 取维吾尔药黄巧20 g，经100 mL丙酬超声提取15 min,提取液浓缩后，用硅胶柱分 离，上样后的硅胶柱（2. 0cm内径小柱)，先用二氯甲烧洗脱，洗脱15倍柱体积，继用二氯 甲烧-甲醇混合溶剂（二氯甲烧-甲醇，100:1，体积比）洗脱，洗脱25倍柱体积，用二氯甲 烧-甲醇混合溶剂(二氯甲烧-甲醇，100:1，体积比)洗脱的洗脱液经回收有机溶剂，鼓风干 燥，即为该活性提取物。经测试，其下酷胆碱醋酶抑制活性为此5。=82.0 ygAiL。
[0030] 实施例5 : 取维吾尔药黄巧20 g，经100 mL氯仿超声提取15 min,提取液浓缩后，用硅胶柱分 离，上样后的硅胶柱（2. 0cm内径小柱)，先用二氯甲烧洗脱，洗脱15倍柱体积，继用二氯 甲烧-甲醇混合溶剂（二氯甲烧-甲醇，100:1，体积比）洗脱，洗脱25倍柱体积，用二氯甲 烧-甲醇混合溶剂(二氯甲烧-甲醇，100: 1，体积比)洗脱的洗脱液经回收有机溶剂，离屯、干 燥，即为该活性提取物。经测试，其下酷胆碱醋酶抑制活性为此5。=80.0 ygAiL。
[003。 实施例6: 取维吾尔药黄巧20 g，经100血乙酸乙醋超声提取15 min,提取液浓缩后，用硅胶柱 分离，上样后的硅胶柱（2. 0cm内径小柱)，先用二氯甲烧洗脱，洗脱15倍柱体积，继用二氯 甲烧-甲醇混合溶剂（二氯甲烧-甲醇，100:1，体积比）洗脱，洗脱25倍柱体积，用二氯甲 烧-甲醇混合溶剂(二氯甲烧-甲醇，100:1，体积比)洗脱的洗脱液经回收有机溶剂，冷冻干 燥，即为该活性提取物。经测试，其下酷胆碱醋酶抑制活性为此5。=76.0 ygAiL。
[003引 实施例7 : 取维吾尔药黄巧20 g，经100血甲醇水混合溶剂（甲醇：水=1:1)超声提取15 min,提 取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱（2. 0cm内径小柱)，先用二氯甲烧洗脱，洗脱 15倍柱体积，继用二氯甲烧-甲醇混合溶剂(二氯甲烧-甲醇，100:1，体积比)洗脱，洗脱25 倍柱体积，用二氯甲烧-甲醇混合溶剂仁氯甲烧-甲醇，100:1，体积比)洗脱的洗脱液经回 收有机溶剂，冷冻干燥，即为该活性提取物。经测试，其下酷胆碱醋酶抑制活性为ICw=88. 0 μ g/mL。
[003引实施例8 : 取维吾尔药黄巧20 g，经100血乙醇水混合溶剂（乙醇：水=1:1)超声提取15 min,提 取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱（2. 0cm内径小柱)，先用二氯甲烧洗脱，洗脱 15倍柱体积，继用二氯甲烧-甲醇混合溶剂(二氯甲烧-甲醇，100:1，体积比)洗脱，洗脱25 倍柱体积，用二氯甲烧-甲醇混合溶剂仁氯甲烧-甲醇，100:1，体积比)洗脱的洗脱液经回 收有机溶剂，冷冻干燥，即为该活性提取物。经测试，其下酷胆碱醋酶抑制活性为ICw=67. 0 μ g/mL。
[0034] 实施例9 : 取维吾尔药黄巧20 g，经100血乙醇-水混合溶剂（乙醇：水=90 :10)超声提取15 min,提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱（2. 0cm内径小柱)，先用二氯甲烧洗 脱，洗脱15倍柱体积，继用二氯甲烧-甲醇混合溶剂（二氯甲烧-甲醇，100:1，体积比）洗 脱，洗脱25倍柱体积，用二氯甲烧-甲醇混合溶剂(二氯甲烧-甲醇，100:1，体积比)洗脱的 洗脱液经回收有机溶剂，冷冻干燥，即为该活性提取物。经测试，其下酷胆碱醋酶抑制活性 为 ICs〇=75. 0 yg/mL。
[003引实施例10:固体分散体 称取黄巧提取物和载体聚乙締化咯烧酬（PVP)按比例1:2、1:4、1:6的质量比分别放入 烧杯中，加入适量的无水乙醇和Vc，用磁力揽拌器揽拌至黄巧提取物和载体完全溶解，充分 混合均匀后转入旋蒸仪中除去有机溶剂，干燥，粉碎过80目筛，即得黄巧有效提取物PVP包 合物。
[0036] 实施例11:环糊精包合物 将β-环糊精与1~5倍水研匀，加黄巧有效提取物（水难溶性的应先溶于少量有 机溶剂中）继续充分研磨至成糊状物，低溫干燥即得环糊精包合物。
[0037] 实施例12 :分散片 1. 黄巧有效提取物分散体的制备，精密称取黄巧提取物、Vc，加入处方量的十二烷基硫 酸钢，用适量的浓度为70%乙醇溶解并加入等比例的可溶性淀粉混合均匀后，在70°C的溫 度下蒸干，粉碎，过100目筛； 2. 将第一步中的黄巧有效提取物淀粉分散体与处方量的交联聚维酬，预胶化淀粉，用 适量的浓度为70%乙醇做湿润剂，边加入边揽拌，制成湿颗粒过14目筛，室溫下放置15min 后，60°C烘箱烘干45min，16目筛整粒，加入处方量的滑石粉和微分硅胶，混合均匀后，压 片即得。
【主权项】
1. 一种黄芪提取物，其特征为，黄芪经溶剂超声提取，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上 样后的硅胶柱，先用二氯甲烷洗脱，继用100:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂洗脱，100:1的二 氯甲烷-甲醇混合溶剂洗脱液干燥，即得丁酰胆碱酯酶抑制活性提取物。2. 如权利要求1所述黄芪提取物，其特征为，先用二氯甲烷洗脱，继用100:1的二氯甲 烷-甲醇混合溶剂洗脱，100:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂洗脱液干燥，即得丁酰胆碱酯酶 抑制活性提取物。3. 如权利要求1或2所述的一种维吾尔药黄芪提取物，其特征为先用二氯甲烷洗脱，继 用100:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂洗脱，100:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂洗脱液干燥， 即得丁酰胆碱酯酶抑制活性提取物。4. 如权利要求1-3任何一项所述的一种维吾尔药黄芪提取物，其特征为，提取用有机 溶剂为甲醇、乙醇、水、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混合溶剂、或乙醇水混合溶剂。5. 如权利要求1-3任何一项所述的一种维吾尔药黄芪提取物，其特征为，用于洗脱的 二氯甲烷-甲醇的洗脱体积为2-50倍柱体积。6. 如权利要求1-4任何一项所述的一种维吾尔药黄芪提取物，其特征为，先用二氯甲 烷洗脱20倍柱体积，继用100:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂洗脱15倍柱体积。7. -种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1-6任何一项所述的黄芪提取物和药 学上可接受的载体。8. -种药物制剂，其特征在于，包含权利要求1-6任何一项所述的黄芪提取物或权利 要求7所述的药物组合物。9. 如权利要求1-6任何一项所述的黄芪提取物或权利要求7所述的组合物或权利要求 8所述的药物制剂在制备抑制丁酰胆碱酯酶活性药物中的应用。10. 如权利要求9所述的应用，其特征为，用于治疗阿尔茨海默病（AD)等。11. 如权利要求1-6任何一项所述的维吾尔药黄芪提取物，其特征为，用TLC法检，其 色谱条件为：GF254硅胶板，展开系统：二氯甲烷：乙酸乙酯：甲醇（3:1:1)显色方法：香草 醛-硫酸显色。
【文档编号】A61K125/00GK105878343SQ201510039164
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2015年1月26日
【发明人】王金辉, 朱芸, 李国玉, 黄健, 张珂, 郑雅鑫, 张彩, 陈娟
【申请人】石河子大学