专利名称：黄芪提取物中糖类成分的含量测定方法
技术领域：
本发明涉及一种中药提取物中有效成分的含量测定方法，特别涉及黄芪提取物中糖类成分的含量测定方法，该提取物为芪参益气滴丸中间体之一。
背景技术：
中药材黄芪为豆科草本植物蒙古黄芪、膜荚黄芪的根，具有补气固表、利水退肿、 托毒排脓、生肌等功效。黄芪的药用迄今已有2000多年的历史，现代研究，黄芪含皂甙、蔗糖、多糖、多种氨基酸、叶酸及硒、锌、铜等多种微量元素。有增强机体免疫功能、保肝、利尿、 抗衰老、抗应激、降压和较广泛的抗菌作用。
黄芪提取物(黄芪提取物)黄芪提取物为黄芪经过乙醇提取得到的黄芪提取物， 其在市场上有售，黄芪提取物可以作为如芪参益气滴丸的制剂的中间体。芪参益气滴丸是天士力集团研制的治疗心血管疾病的现代中药，是提取黄芪、丹参、三七、降香中的有效成分精制而成的滴丸制剂，适用于慢性心功能不全、心肌炎及后遗症、心肌梗塞恢复期、心肌纤维化等病症。芪参益气滴丸在上市七年中，已经建立起了一整套全面地的工艺质量控制体系，并且不断进行完善和补充。
黄苗提取物中含有的主要活性成分为polysaccharides黄苗多糖，另有其他成分如单糖、多糖、皂甙、黄酮、氨基酸、微量元素、蛋白质、核黄素、叶酸、维生素P、有机酸、 香豆素、谷甾醇、胡萝卜甙、羽扁豆醇、正十六醇、胆碱、甜菜碱等多种成分。
中药中的糖类成分糖类成分可分布于植物的各个部位，常常占植物干重的80% 90%，是中药材及中药产品中的主要组成成分，所占含量比例很高。另外，许多糖类成分对于中药活性成分具有辅助药效作用，同时糖类成分本身也具有为机体提供能量的作用，因此糖类成分的测定对于全面掌握中药材及中药产品质量非常重要。测定结果表明，黄芪提取物中主要含有蔗糖和果糖等小分子糖类物质，且含量较高，所以测定它们的含量非常必要。
糖类成分的测定针对糖类成分的常用测定方法有化学分析法、气相色谱法、离子交换色谱法、凝胶色谱法、高效液相色谱法、毛细管电泳法、衍生化气相色谱法等。但这些方法稳定性差，灵敏度不高。
为得到一种新的黄芪提取物中糖类成分的含量测定方法，本发明采用高效液相色谱蒸发光散射检测器(HPLC-EL SD)法，具有稳定性好、灵敏度高、能够进行梯度洗脱等优点。
本发明采用PrevailTM Carbohydrate ES色谱柱,对于各个小分子糖类的分离度大大提高。相对于常用的氨基柱，具有噪音低，色谱柱寿命长的特点，是本专利的最大优势所在。
本发明以最简单的乙腈-水为流动相，能够在20分钟内完成测定，色谱峰分离度均大于3，达到高效、快速分离。
本发明采用固相萃取技术，能够有效去除黄酮、皂苷等干扰成分。
经验证本发明的质量控制方法精密度、灵敏度、稳定性良好，能够有效测定复方丹参浸膏中的糖类物质含量。
本发明针对黄芪提取物中含量较高的糖类成分建立的含量测定方法，目的是进一步提升产品质量控制水平，从而更加准确的把握产品质量。
发明内容
本发明的目的是提供一种专属性强、灵敏度高、稳定准确的糖类成分测定方法，用于黄芪提取物中糖类成分的含量测定，该方法包括以下步骤
I)糖类成分对照品溶液的制备
2)对黄芪提取物进行溶解，上固相萃取小柱，水洗脱，收集洗脱液；
3)采用高效液相色谱法进行样品测定。采用PrevailTM Carbohydrate ES色谱柱，以一定比例的有机溶剂和水为流动相，进行洗脱；
4)以ELSD检测器进行检测；
5)用外标两点法对数方程分别计算果糖和蔗糖的含量。
其中所述糖类成分为果糖和蔗糖。其中所述黄芪提取物为黄芪经过水煮得到的浸膏，或黄芪经过有机溶剂提取得到的浸膏。所述有机溶剂为醇类有机溶剂，醇类有机溶剂， 优选乙醇，优选95 %的食用乙醇。
本发明所述黄芪提取物还可以是经过水煮醇提得到的，也可以是经过醇提水沉得到的，还可以是在以上步骤的基础上进一步经过选自萃取，过柱，酸化，碱化等步骤得到的。
如采用以下方法得到黄芪提取物，提取方法包括以下步骤黄芪药材加水煎煮3 次，每次I. 5h，第I次加水量为5倍量，第2、3次加水量为3倍量，合并煎煮液，浓缩至浸膏， 加95%乙醇至溶液含醇量为70%，冷藏过夜，过滤，滤液浓缩至浸膏。加无水乙醇使浸膏含醇量为85 %，冷藏过夜，滤过，滤液浓缩至浸膏，即可。
优选的本发明的测定方法如下
I)对照品溶液的制备精密称取经五氧化二磷干燥过的果糖对照品、蔗糖对照品适量，加水制得每毫升含果糖和蔗糖分别为O. 5mg和2. 5mg的混合对照溶液。
2)供试品溶液的制备取黄芪提取物约O. 25g，精密称定，加水约20ml，超声溶解，上至已处理好的固相萃取柱(Cleanert PS-SPE, O. 5g/6ml),流速约lml/min,再用水分次洗涤，收集上样液和洗涤流出液约45ml，转移至50ml量瓶中，加水至刻度，混匀，即得。
3)分别精密吸取各对照品溶液5 μ I、10 μ 1，供试品溶液10 μ 1，注入高效液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程分别计算果糖和蔗糖的含量，即得。其中高效液相色谱的色谱条件为采用PrevailTM Carbohydrate ES色谱柱，以乙腈水=75 25为流动相， 流速O. 8ml/min,柱温30°C ;以WATERS 2420 ELSD检测器进行检测，参数设置为增益10，气压25psi,漂移管60°C, Neb heater :60%。理论板数按鹿糖色谱峰计算应不低于2000。
本发明的测定方法，是经过筛选得到的，试验如下
验证项目及验证合格标准
权利要求
1.一种黄芪提取物中糖类成分的含量测定方法，该提取物为芪参益气滴丸中间体之一，其特征在于，该方法包括以下步骤1)糖类成分对照品溶液的制备；2)对黄芪提取物进行溶解，上固相萃取小柱，水洗脱，收集洗脱液；3)采用高效液相色谱法进行样品测定，采用PrevailTMCarbohydrate ES色谱柱，以一定比例的有机溶剂和水为流动相，进行洗脱；4)以ELSD检测器进行检测；5)用外标两点法对数方程分别计算果糖和蔗糖的含量。
2.根据权利要求I所述的测定方法，其特征在于，所述步骤I)中糖类成分对照品溶液为一种混合物，是由果糖、葡萄糖、鹿糖、麦芽糖等单糖、二糖、低聚糖单独、任何两种、三种、四种、五种等更多种混合配制而成。
3.根据权利要求I所述的测定方法，其特征在于，所述步骤2)中黄芪提取物为黄芪经过有机溶媒提取得到，或在以上步骤的基础上进一步经过选自水沉，萃取，过柱，酸化，碱化等步骤得到的。
4.根据权利要求I所述的测定方法，其特征在于，所述步骤2)中黄芪提取物为黄芪经过水煮得到，或在以上步骤的基础上进一步经过选自醇沉，萃取，过柱，酸化，碱化等步骤得到的。
5.根据权利要求I所述的测定方法，其特征在于，所述步骤I)中糖类成分对照品溶液的制备方法为精密称取经五氧化二磷干燥过的果糖对照品和蔗糖对照品适量，加水制得每毫升含上述物质各O. 5mg的混合对照溶液。
6.根据权利要求I所述的测定方法，其特征在于，所述步骤2)中黄芪提取物供试品溶液的制备方法为取黄芪提取物O. 25g，加水适量，超声溶解，上至已处理好的固相萃取柱(Cleanert PS-SPE或其他型号的聚苯乙烯基质型填料)，流速约lml/min,再用水分次洗涤，收集上样液和洗涤流，即得。
7.根据权利要求I所述的测定方法，其特征在于，所述步骤3)中采用高效液相色谱法进行样品测定的方法为采用PrevailTM Carbohydrate ES色谱柱，以乙腈或甲醇为流动相A，水为流动相B，乙腈或甲醇的比例在60-90%之间，水的比例在10-40%之间。
8.根据权利要求I所述的测定方法，其特征在于，所述步骤4)中采用ELSD检测器为WATERS 2420 ELSD检测器或其他品牌ELSD检测器，采用WATERS 2420 ELSD检测器进行检测时，参数设置为增益10，气压25psi，漂移管60°C，Neb heater :60%。
9.根据权利要求I所述的测定方法，其特征在于，所述步骤5)中采用外标两点法对数方程分别计算样品中果糖和蔗糖的含量。
10.根据权利要求I所述的测定方法，其特征在于，所述黄芪提取物中的糖类成分为果糖和蔗糖。
全文摘要
本发明涉及一种中药提取物中有效成分的含量测定方法，特别涉及黄芪提取物中糖类成分的含量测定方法，该方法包括以下步骤1)糖类成分对照品溶液的制备；2)对黄芪提取物进行溶解，上固相萃取小柱，水洗脱，收集洗脱液；3)采用高效液相色谱法进行样品测定。采用PrevailTM Carbohydrate ES色谱柱，以一定比例的有机溶剂和水为流动相，进行洗脱；4)以ELSD检测器进行检测；5)用外标两点法对数方程分别计算果糖和蔗糖的含量。本发明检测方法操作简单、快捷，专属性强、分离度高、准确度和精密度良好，适用于黄芪提取物的质量控制。
文档编号G01N30/02GK102928520SQ20111022729
公开日2013年2月13日 申请日期2011年8月10日 优先权日2011年8月10日
发明者刘岩, 徐波, 牛涛, 陈红, 高阳 申请人:天津天士力现代中药资源有限公司