专利名称：：糖类的制备方法
技术领域：
：本发明涉及获得葡萄糖、麦芽糖、麦芽低聚糖等糖链长固定的高纯度单体糖类的制备方法。获得特定糖链长的高纯度单体糖类的方法迄今已知有下面这些用一种或两种以上适当的淀粉酶类分解淀粉等葡聚糖，用公知的各种柱层析法等将其从其它非目的低聚糖和单糖中分离出来(例如，淀粉科学手册p.452，1987、特开昭57-209000号公报、特开昭62-19210号公报、特公平2-17158号公报)，或将其再结晶，从而从其它微量混入的非目的低聚糖和单糖中分离出来(例如，淀粉科学手册，p456，1987)。然而，上述任何方法本质上均伴有葡萄糖和未切断的糊精、以及其它非目的低聚糖副产品，均未能实际上从反应系中去除这些非目的糖类。此外，人们已知，微量非目的糖类的共存，还明显地妨碍作为目的物的特定糖链长的糖类的结晶化。而且，用上述公知的方法，若要获得尽可能高纯度的低聚糖，则制备工序变复杂，收率和成本方面也有问题。因此，本发明者们认为糖类公知的制备方法很有改善余地，特别尝试了建立实质上不含非医药用目的糖类而仅含葡萄糖、麦芽糖、麦芽低聚糖等特定糖链长的糖类单体的制备方法。本发明的要点在于连续进行以下一系列操作。即在糖链转移酶的作用下，直接地或经中间体介导，将糖链从其它的糖链供给源转移到对于作为目的物的特定糖链长的糖类实质上可分离的物质(以下称作“可分离物质”)上，使所得到的低聚糖受将低聚糖特定长度的糖链切成exo型的酶(以下称作“exo型切断酶”)的作用，从而分离作为目的物的特定糖链长的糖类的方法。下面对本发明加以详述。在本发明中所用的可分离物质为壳聚糖珠、离子交换树脂、合成高分子树脂、或作为其他固定化载体被使用的载体或以下面的通式(Ⅰ)(式中R为氢、低级烷基、羟烷基、苯基烷基、苯基链烯基、苯基炔基、苯氧基烷基、苯氧基链烯基或苯氧基炔基，此处苯基中也包含被取代的苯基)表示的化合物(以下称作“脱二氧亚胺基葡糖醇类”)、野尻霉素、氨基环醇、氨基环醇衍生物、或葡糖醛酸或其葡糖基或低聚葡糖基体等能吸附在离子交换树脂上的有极性的糖类(以下称作“极性糖”)等。载体不管是珠状、膜状、纤维状等均可。脱二氧亚胺基葡糖醇类可从桑白皮和放线菌等获得(如，特願昭54-159417号、特願昭55-76838号、特公昭56-9919号公报、特願昭57-93997号、特公昭59-27337号公报)。脱二氧亚胺基葡糖醇类的葡糖基和低聚葡糖基体可用已公开的方法制备(如，AgricultralandBiologicalChemistry49，2159(1985))。从有效霉素类获得氨基环醇的方法已被揭示(如，特願昭55-128157号)，也可从市售的有效霉素制剂制得氨基环醇。为了将糖链转移到载体上，此载体上不具有末端葡糖基或极性糖等可被糖链转移酶转移糖链的残基，必须预先在载体上直接地或通过间隔物结合上具有可被糖链转移酶转移糖链的残基的中间体。此处，中间体可为极性糖、葡萄糖等单糖、麦芽糖、麦芽三糖等低聚糖。为了将中间体结合到载体上，可有例如在氰基硼氢化钠(NaBH3CN)这样的还原剂作用下将中间体麦芽糖结合到已结合了具有末端氨基的间隔物的壳聚糖珠载体上的方法等。其中，间隔物可为环氧乙烷、戊二醛(GLA)等用于固定化技术的单功能团和双功能团物质。为使糖链从其它糖链供给源转移过来所用的糖链转移酶可为，例如，环糊精葡糖基转移酶(CGTase)、α-淀酚酶等。CGTase，迄今已有由若干种菌株产生的报告，例如，芽胞杆菌属Bacillusmcaaelins、Bacillusmagtelium、Bacillussaculins、嗜碱性芽胞杆菌、耐热性芽胞杆菌等。这些菌株产生的环糊精各自具有特征，而本发明中所用的CGTase，无论是它们中任何一型的CGTase，都能完全达到其目的。已知除酶以外，也有某种菌株直接形成糖转移生成物(如，日本农业化学会大会讲演摘要集4N-2，1981.3.10发行)，即便象那样的情况也可达到作为本发明的糖链转移酶的目的。在糖链转移反应中的pH、反应温度，因所用糖链转移酶的不同而各有所不同，例如在用CGTase时，pH为4.0-11.5范围，以pH5.5-10.5范围为佳;反应温度在20-85℃的范围，以45-65℃的范围为佳。糖链转移反应需要的时间，在使用CGTase转移酶时，因pH、反应温度、酶浓度、糖链供给源的浓度不同而有相当大的差异，通常为数小时至四天。CGTase的用量以在可被糖链转移酶转移糖链的残基上使尽可能多的糖链转移为好，因此对应于糖链供给源的淀粉系多糖，酶的比例越多，越能得到良好的结果，具体地因所用糖链供给源淀粉系多糖、pH、反应时间而异，一般来说，每1g淀粉系多糖用500-5000单位(B.V法)酶，较好地为1000-2000单位。此外，糖源供给源可为淀粉，淀粉系糖质或环糊精。淀粉可用任何一种市场上流通的商业用淀粉。而淀粉系糖质可用各种糊精、直链淀粉、支链淀粉这样的中间加水分解物或高聚合度、中等程度或低聚合度的任何一种物质。淀粉系多糖的浓度按制备上要求的时间，转移酶的量的不同而不同，以5-60%(较好为10-20%)为宜。若为糊精，以30-50%为实用。用高浓度淀粉作为糖源供给源时，其粘度显著升高，所以一般在进行糖链转移反应前，用CGTase和α-淀粉酶等先将淀粉液化。为了提高添加的淀粉系多糖的利用率，使淀粉系多糖相对于转移酶量的添加量以较低的浓度为好，例如，每1g淀粉系多糖2000-3000单位糖链酶量为好。作为可分离物质使用极性糖时，例如脱二氧亚胺基葡糖醇，其浓度可上升至15%。然而，糖链供给源对脱二氧亚胺基葡糖醇的重量比以2-20倍为有效。作为可分离物质使用载体时，通过在糖链转移反应完成后，将糖链被延长的载体充妥洗净。洗净后，例如在100℃下加热5分钟使残存的糖链转移酶失活，也可更充分地洗净。所用的糖链转移酶用超滤法(以下称作“UF”)等可容易地加以回收。作为可分离物质使用极性糖时，在糖链转移反应完成后，将极性糖及该糖上转移了葡萄糖低聚糖的物质吸附在离子交换树脂上。此时所用的糖链转移酶可用UF法等容易地加以回收，因此在不回收糖链转移酶的情况下将反应液直接用离子交换树脂处理，在回收糖链转移酶的情况下用UF膜处理后，将滤液用离子交换树脂处理。此处，离子交换树脂可为Dowex50W-X2(注册商标)、DiaionSA-11A(注册商标)、苯酚甲醛离子交换树脂IR-120(注册商标)等，按极性糖的极性作适当的选择。离子交换树脂的量当然必须按反应所用极性糖的量作增减。极性糖及该糖上转移了葡萄糖低聚糖的物质吸附在离子交换树脂上以后，通常进行充分洗涤。而且，在洗净后一般将其从离子交换树脂上洗脱下来，例如，用1N氨水等洗脱。接着，在对exo型切断酶适合的pH条件下，通常在30-55℃反应温度下，使exo型切断酶作用数小时-2天，exo型切断酶可为葡萄糖淀粉酶、β-淀粉酶、麦芽糖低聚糖生成酶等。例如，制备麦芽糖时，可采用β-淀粉酶，将反应液调节到适合于β-淀粉酶的pH4.5-6.0，如pH4.8，在反应液中加入β-淀粉酶，在30-60℃反应温度下反应1-2天为宜。exo型切断酶的添加量根据所用的exo切断酶和可分离物质的种类而定，在可分离物质为载体时，每ml载体加20-100单位酶，可在工业上1天工作时间内切断完毕。使用极性糖作为可分离物质，在用前面的操作从离子交换树脂上使其洗脱的情况下，在exo型切断酶作用后直接，或用适当的UF膜法等分离方法分离exo型切断酶后，再次加到吸附所用的极性糖的离子交换树脂上，这样实际上可分离单纯的目的物-特定糖链长的糖类。使用极性糖作为可分离物质，在不用前面的操作从离子交换树脂上洗脱下来而直接受exo型切断酶作用的情况下，或使用载体作为可分离物质的情况下，在exo切断酶作用后，用过滤和UF膜法等适当的分离方法分离exo型切断酶，这样实际上可分离单纯的目的物-特定糖链长的糖类。象上述那样分离出来的exo切断酶也可再利用。在最终得到的液体的浓缩上，可采用旋转式蒸发器减压浓缩法、反渗透压(RO)膜法等通用的浓缩手段。在使用极性糖作为可分离物质时，糖链转移酶和exo型切断酶也可以溶液状态使用，也可以固定化酶的形式使用，此固定化酶是用制备通用的公知的固定化酶的方法制成的。特别是在使用粗酶时，用固定化酶可减少夹杂物，在精制工序上有利。按本发明涉及的制备法制备麦芽糖的反应式图解如下。(式中，A为可分离物质，G为葡萄糖，B为β-淀粉酶。但全部A不限于同一种。为β-淀粉酶的切断部位。)如上式，β-淀粉酶按其特性不切断二糖或三糖而保留下来(上式中G-G、A-G及A-G-G)。从而可以通过过滤或离子交换树脂等，从固体状态或极性糖的其它物质(A、A-G及A-G-G)中，容易地分离单一的溶液状态中性糖-麦芽糖(G-G)。而且，在分离麦芽糖后，糖链转移酶可再在其它残渣上延长糖链，结果，通过反复的糖链转移反应、切断反应、分离，可连续生产麦芽糖。从以上所述，可以说，本发明制备法兼备连续性，是可以在实际上得到单体目的物特定糖链长的糖类前所未有的新制备法。而且，按本发明，不仅可得单纯的特定糖链长的糖类这一优点，与以往的方法相比较，它的制备工序非常简单，可大大节减经费，劳力等，收率也可充分提高。用本发明的制备法可制备的糖类，例如麦芽糖，在要求特别高纯度的医药上是有用的，其使用形态可为点滴剂等。当然，这些糖类也作为食品使用。麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖等可用作诊断药物等。此外，将麦芽糖还原制得的甜味剂麦芽糖醇，因原料麦芽糖纯度越高，其结晶化程度越好，因此，用本发明制备法制备的麦芽糖，对于这一点也是非常有效的。将本发明的糖类作医药用，适用的例子可为诸如输液等。适用于输液的情况下，例如，麦芽糖，已知其10%溶液是等渗的，因具有等量葡萄糖2倍的能量值，因此比葡萄糖等还有益。(“麻醉与复苏”)20(3)163，1984)。同样，等渗的15%麦芽三糖溶液具有葡萄糖3倍的能量价，其有效性更高。将本发明的糖类用于医药上时，可使用以下组成的组合物，通常包括单纯的糖(麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖等)，或也可同时含有葡萄糖或麦芽糖，再含有适量氯化钠、氯化钾、醋酸钠等无机盐或有机盐。输液组成例将麦芽三糖15g、氯化钾0.03g、氯化钙0.02g、氯化钠0.6g、乳酸钠0.31g混合，成为100ml输液的组成。下面用参考例和实施例对本发明作更详细且具体的说明，而不是限定本发明。参考例1固定化CGTase珠的调制首先，将软化芽胞杆菌(Bacillusmacerans)CGTase(Contizyme、天野制药社制)200ml对0.01M醋酸缓冲液(pH6.0)作透析。另外，在室温下，将壳聚糖珠BCW-3010(注册商标，富士纺织社制，以下同)50ml在含2.5%戊二醛的0.1M醋酸缓冲液(pH5.0)中缓缓振荡24小时后，充分地用水洗。然后，在此活化的壳聚糖珠中加入上述透析内液离心分离后的上清液，在4℃下缓缓振荡16小时，使酶的结合完成后，充分水洗。这样，获得23.8mg蛋白质/ml珠的本固定化酶。参考例2固定化β-淀粉酶的调制首先，将来源于甘薯的β-淀粉酶(シクマ社制，硫酸铵悬浊液)4.8ml对0.01M醋酸缓冲液(pH5.0)作透析。另外，在室温下，将壳聚糖珠BCW-301010ml(在含2.5%戊二醛的醋酸缓冲液(pH5.0)中缓缓振荡24小时后，充分水洗。然后，在此活化的壳聚糖珠中加入上述透析内液离心分离后的上清液，在4℃下缓缓振荡16小时，使酶的结合完成后，充分水洗。这样，获得6.44mg蛋白质/ml珠的本固定化酶。参考例3在壳聚糖珠上结合了麦芽糖的载体的调制将壳聚糖珠(chitopearl)BCW-30105ml与麦芽糖1.8g溶于甲醇/水＝1/1的混合溶媒20ml中，在麦芽糖溶解后，加入氰基硼氢化钠，用醋酸调节pH为3-4，令反应进行3天。然后，滤取糖珠，充分进行水洗，得本载体。参考例4固定化葡糖淀酚酶的调制在35l葡糖淀粉酶“GluczymeNL-3”(天野制药社制)中加入35l离子交换水进行稀释，在柱中充填的33l壳聚糖株BCW-3010中导入用UF法精制所得的酶浓缩液，使其吸附在糖珠上。即，将此酶浓缩液用终浓度为0.05M的醋酸缓冲液(pH5.0)56l配成溶液，在8℃下经24小时循环，使其吸附，然后用0.05M醋酸缓冲液(pH5.0)150l洗涤，将含2.5%戊二醛的0.05M醋酸缓冲液(pH5.0)120l在柱中循环，完成固定化。剩余的戊二醛通过550l水而除去，从而得到24.4mg蛋白质/ml珠的本固定化酶。实施例1分别取300mg脱二氧亚胺基葡糖醇、N-甲基脱二氧亚胺基葡糖醇、N-苄基脱二氧亚胺基葡糖醇、N-羟乙基脱二氧亚胺基葡糖醇、N-丁基脱二氧亚胺基葡糖醇及葡糖基脱二氧亚胺基葡糖醇到50ml三角烧瓶中，各加入可溶性淀粉1200mg，在10ml水中加热溶解，加入按参考例1的方法调制的固定化CGTase珠5ml，在40℃下振荡3天进行转移反应。然后，从各自这些反应液中取出3ml，加到10ml强酸型离子交换树脂Dowex50W-X2上，进行充分水洗，用1N氨水60ml洗脱，用旋转式蒸发器浓缩至干。此糖链转移物的重量列于表1，各自的薄层色谱(TLC)见图1。(硅胶G60F254、メルク社制;展开溶剂正丙醇/氨水＝6/2/1;显色剂喷雾10%硫酸的乙醇溶液后，在火焰上加热，以下同。)然后，将糖链转移物按50mg/ml溶于水中，用2N盐酸调节pH至5-6，加入按参考例2的方法调制的固定化β-淀粉酶200粒，在37℃下反应5小时。此β-淀粉酶反应液的TLC见图2。从图2很明显可看出，分别生成麦芽糖。接着，将各β-淀粉酶反应液加到10ml强酸型离子交换树脂Dowex50W-X2上，通过液用2N苛性纳中和后，用旋转式蒸发器浓缩至干。各自所得的麦芽糖重量列于表1。表1</tables>这些麦芽糖部分的TLC见图3。从图3可知生成的仅仅为麦芽糖。实施例2在50ml三角烧瓶中加入Validamine60mg和可溶性淀粉1200mg，加10ml水，加热溶解，在其中加入按参考例1的方法调制的固定化CGTase珠5ml，在40℃下振荡3天进行转移反应。然后，从此反应液中取出3ml，加到10ml强酸型离子交换树脂Dowex50W-X2上，充分水洗，用1N氨水60ml洗脱，在旋转式蒸发器中浓缩至干。此糖链转移物的重量为274mg，糖链转移物的TLC见图4。在此糖链转移物中加水5.5ml，用2N盐酸调节pH至5-6，加入按参考例2的的方法调制的固定化β-淀粉酶200粒，在37℃下反应5小时。此β-淀粉酶反应液的TLC见图5。从图5很明显可看出生成的仅仅为麦芽糖。接着，将此β-淀粉酶反应液加到10ml强酸型离子交换树脂Dowex50W-X2上，通过液用2N苛性钠中和后，用旋转式蒸发器浓缩至干。所得的麦芽糖重量为113mg。此麦芽糖部分的TLC见图6。从图6表明生成的仅仅为麦芽糖。实施例3在螺口试管内加入N-(1，3-二羟基-2-丙基)valiolamine60mg和酶糊精“Amycol”(注册商标，日本淀粉社制)240mg，再加入CGTase“Contizyme”(天野制药社制)1ml，加水至约2ml，在50℃下振荡48小时，使发生转移反应。将全部反应液通过约10ml强酸型离子交换树脂Dowex50W-X2，充分水洗，用1N氨水60ml洗脱，将洗脱部分用旋转式蒸发器浓缩至干。所得糖链转移物的重量为118.6mg。在此糖链转移物中加入0.1M醋酸缓冲液(pH4.8)10ml，使其溶解，接着加入100μlβ-淀粉酶(来源于甘薯、硫酸铵悬浊液，生化学工业社制)，于37℃下反应16小时。然后，将此β-淀粉酶反应液加到10ml强酸型离子交换树脂Dowex50W-X2上，通过的流分和洗液一起，用2N氢氧化钠中和，用旋转式蒸发器浓缩至干，得129.8mg麦芽糖。实施例4将低聚葡糖基脱二氧亚胺基葡糖醇4.7g溶于170ml水中，用1N盐酸调节至pH4.9后，加入1mlβ-淀粉酶(SERVA社制，来源于甘薯，848U/mg蛋白，三次重结晶品，5mg/ml)，于37℃下反应20小时。令反应液通过30ml强碱型离子交换树脂DiaionSA-11A，用离子交换水充分洗净。然后，将通过液和洗液合并，通过50ml强酸型离子交换树脂Dowex50W-X2，用离子交换水充分洗净。接着，将通过液和和洗液合并，浓缩至干，得粉末1.4g。用高速液相色谱法(柱Nucleosil5NH2、5μm、4mmi.d.×25;移动相乙腈/水＝70/30;检测示差折射计)分析的结果，此麦芽糖的含量为98.3%。实施例5将可溶性淀粉15g在100ml水中加热溶解后，溶解脱二氧亚胺基葡糖醇5g。然后，加水使全容积为170ml，加入按参考例1的方法调制的固定化CGTase珠20ml，于55℃下反应42小时。接着，过滤去除固定化CGTase珠，水洗后，将滤液和洗液合并，令其通过50ml强酸型离子交换树脂Dowex50W-X2。将此充分水洗后，用1N氨水洗脱，将洗脱液冻结干燥，得11.3g。将此粉末溶于250ml水中，用2N盐酸调节pH至5.0后，加入按参考例2的方法调制的固定化β-淀粉酶10ml，于37℃下反应3小时。然后，将此反应液过滤除去固定化β-淀粉酶，水洗后，将滤液与洗液合并，令其通过30ml强碱型离子交换树脂DiaionSA-11A，进行充分水洗。接着，将通过液与洗液合并，减压浓缩至约20ml，令其通过100ml强碱型离子交换树脂Dowex50W-X2。轻轻地水洗后，将通过液与洗液合并，冻结干燥，得麦芽糖粉末800mg。将本品麦芽糖85mg/ml浓度的样品10μl按与实施例4同样的高速液相色谱条件进行分析的结果，本品如图7所示，为100%麦芽糖。实施例6在按参考例3调制的5ml麦芽糖结合壳聚糖珠中加入酶糊精“Amycol”(注册商标，日淀化学社制)3g、水10ml，用2N盐酸调至pH6.0后，加入CGTase(Contizyme，天野制药社制)5ml，于50℃下缓缓振荡24小时。在滤去载体珠后，充分水洗，于100℃沸水中加热5分钟，进一步作充分水洗。另外，将未处理的壳聚糖珠代替麦芽糖结合壳聚糖珠同样地进行反应以作对照。在这样得到的载体珠5ml中，加入0.2M醋酸缓冲液10ml，再加β-淀粉酶(SERVA社制)50μl，于37℃缓缓振荡。将反应液经时地取样500μl，加入1ml3，5-二硝基水杨酸试剂，于100℃沸水中加热10分钟后，用水冷却，加5ml水，以535nm处的吸光度来测定游离的麦芽糖。结果见图8-A。与未处理的壳聚糖珠比较，经麦芽糖结合处理的壳聚糖珠明显地显示麦芽糖的游离。将此β-淀粉酶处理后的上清液浓缩，用TLC检测，只检出麦芽糖，未见其它小糖类的混入。实施例7将实施例6所用的β-淀粉酶切断后的麦芽糖结合壳聚糖珠与对照的壳聚糖珠于100℃加热处理5分钟，充分水洗，在50ml三角烧瓶中，加入该水洗后的样品5ml和酶糊精“Amycol”(注册商标，日本淀粉社制)3g、水10ml、CGTase“Contizyme”(天野制药社制)5ml，于50℃下振荡24小时，再次进行反应。然后，将糖珠过滤洗净，再于100℃加热处理5分钟，进一步地充分水洗。将此糖珠5ml加到0.2M醋酸缓冲液(pH4.8)10ml中，再加入50μlβ-淀粉酶(来源于甘薯，硫酸铵悬浊液，生化学工业社制)，于37℃下孵育，经时地取样0.5ml，加入3，5-二硝基水杨酸试剂1ml，于100℃沸水中加热5分钟后，用水冷却，加5ml水，以535nm处的吸光度来测定游离的麦芽糖，吸光度的变化见图8-B。如图8-B所示，与实施例6第1节的反应同样，与对照比较，可充分确认麦芽糖的生成。由此，用麦芽糖结合珠也能反复进行麦芽糖的制备，即提示了连续生产的可能性。实施例8将与实施例1同样获得的脱二氧亚胺基葡糖醇糖链转移物149mg溶于3ml水中，用2N盐酸调至pH5.0，加入按参考例4调制的固定化葡糖淀粉酶珠200粒，于40℃下振荡4小时使葡萄糖游离出来。将此反应液加到Dowex50W-X210ml上，未被吸附流出的部分用2.5N苛性钠中和后，用旋转式蒸发器浓缩至干，得纯净的葡萄糖58.3mg。图9为其TLC。实施例9将与实施例1同样得到的N-丙基脱二氧亚胺基葡糖醇和N-苄基脱二氧亚胺基葡糖醇的糖链转移物各12.5mg溶于250μl水中，用2N盐酸调至pH6.0，在其中加入由灰色链霉菌(streptomycesgriseus)NA-468(FERMP-2227)调制的生成麦芽三糖的淀粉酶溶液250μl(95单位/0.25mg蛋白;1单位在1小时内生成相当于1mg麦芽三糖的还原糖的酶量)，于40℃下缓缓振荡2小时，生成麦芽三糖。图10所示为此反应液的TLC。再将此反应液放到Dowex50W-X2上，未被吸附而流出的部分用2.5N苛性钠中和。图11所示为此麦芽三糖部分的TLC。图11表明仅产生麦芽三糖。进一步用3，5-二硝基水杨酸法以麦芽三糖标准品为基准进行定量，测得麦芽三糖分别为5.2mg和5.7mg。实施例10在与实施例1同样得到的N-丙基脱二氧亚胺基葡糖醇和N-苄基脱二氧亚胺基葡糖醇的糖链转移物各12.5mg中，加入由施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)IFO-3773株调制的生成麦芽四糖的淀粉酶溶液250μl(26.25单位/0.24mg蛋白;1单位1小时内生成相当于1mg麦芽四糖的还原糖的酶量)，于40℃下缓缓振荡2小时，生成麦芽四糖。再将此反应液加到Dowex50W-X2上，收集未被吸附而流出的部分。此麦芽四糖部分反应第20分钟的TLC见图12。图12表明仅产生麦芽四糖。进一步用3，5-二硝基水杨酸法以麦芽四糖标准品为基准进行定量，测得麦芽四糖分别为2.0mg和1.6mg。实施例11在与实施例1同样得到的N-丙基脱二氧亚胺基葡糖醇和N-苄基脱二氧亚胺基葡糖醇的糖链转移物各12.5mg中，加入由假单胞菌属Pseudomonssp.kO-8940(FERMP-7456)调制的生成麦芽五糖的淀粉酶溶液250μl(10.13单位/1.85mg蛋白;1单位在1小时内生成相当于1mg麦芽五糖的还原糖的酶量)，于40℃下缓缓振荡2小时，生成麦芽五糖。再将此反应液加到Dowex50W-X2上，收集未被吸附而流出的部分。图13所示为从N-苄基脱二氧亚胺基葡糖醇制麦芽五糖部分的反应第90分钟的TLC图。图13表明仅产生麦芽五糖。进一步用3，5-二硝基水杨酸法以麦芽五糖标准品为基准进行定量，测得麦芽五糖分别为0.6mg和0.8mg。图1为实施例1中的糖链转移物的TLC。图1中，1-6分别表示脱二氧亚胺基葡糖醇、N-甲基脱二氧亚胺基葡糖醇、N-苄基脱二氧亚胺基葡糖醇、N-羟乙基脱二氧亚胺基葡糖醇、N-丁基脱二氧亚胺基葡糖醇及葡糖基脱二氧亚胺基葡糖醇的各糖链转移物，a、b、c、d、e、f为作为标准品的上述各脱二氧亚胺基葡糖醇类。图2为实施例1中β-淀粉酶反应液的TLC。图中1、2、3、4、5、6与图1所说明的相同。M为麦芽糖。图3为实施例1中麦芽糖部分的TLC。图中1、2、3、4、5、6与图1所说明的相同。M为麦芽糖。图4为实施例2中糖链转移物的TLC。7和Ba分别表示validamine糖链转移物和validamine。图5为实施例2中β-淀粉酶反应液的TLC.7为validamine糖链转移物，M为麦芽糖。图6为实施例2中麦芽糖部分的TLC。7为validamine糖链转移物，M为麦芽糖。图7为实施例5中所得的麦芽糖粉末的高速液相色谱图。图中A为溶剂峰，B为麦芽糖峰。图8-A是实施例6的结果。●为采用麦芽糖结合壳聚糖珠的情形，○为采用未处理的壳聚糖珠的情形，纵轴为溶液的吸光度，横轴为时间(小时)。图8-B是实施例7的结果。●为采用麦芽糖结合壳聚糖珠的情形，○为采用未处理的壳聚糖珠的情形。纵轴为溶液的吸光度，横轴为时间(小时)。图9为实施例8中葡萄糖部分的TLC。图中8为葡萄糖部分，G为葡萄糖。图10为实施例9中生成麦芽三糖的淀粉酶反应液的TLC。图中9、10分别为N-丙基脱二氧亚胺基葡糖醇和N-苄基脱二氧亚胺基葡糖醇的糖链转移物，T为麦芽三糖。图11为实施例9中麦芽三糖部分的TLC。图中9为从N-丙基脱二氧亚胺基葡糖醇而来的麦芽三糖部分，10为从N-苄基脱二氧亚胺基葡糖醇而来的麦芽三糖部分，T为麦芽三糖。图12为实施例10中麦芽四糖部分的TLC。图中11为从N-丙基脱二氧亚胺基葡糖醇而来的麦芽四糖部分，图中12为从N-苄基脱二氧亚胺基葡糖醇而来的麦芽四糖部分，Te为麦芽四糖。图13为实施例11中麦芽五糖部分的TLC。图中13为从N-苄基脱二氧亚胺基葡糖醇而来的麦芽五糖部分，Pe为麦芽五糖。权利要求1.糖类的制备方法，其特征在于在糖链转移酶的作用下，直接地或经中间体介导地，将糖链从其它的糖链供给源转移到对于作为目的物的特定链长的糖类实质上可分离的物质上，使所得到的低聚糖受将低聚糖特定长度的糖链切成exo型的酶的作用，从而分离作为目的物的特定糖链长的糖类。2.按权利要求1所述的糖类的制备方法，其特征在于对于作为目的物的特定糖链长的糖类实质上可分离的物质为载体或以下面的通式[Ⅰ]表示的化合物(式中R为氢、低级烷基、羟烷基、苯基烷基、苯基链烯基、苯基炔基、苯氧基烷基、苯氧基链烯基或苯氧基炔基，其中苯基上也含有取代基)、野尻霉素、氨基环醇、氨基环醇衍生物、或葡糖醛酸或其葡糖基或低聚葡糖基体。3.一种输液，其特征在于以下面的通式[Ⅱ](式中，n为从2-5的整数)表示的麦芽低聚糖为主成分。全文摘要提供可获得高纯葡萄糖、麦芽糖、麦芽低聚糖等固定糖链长的糖类单体的简便制备方法。本制备法系采用糖链转移酶将糖链从糖链供给源转移到对于上述糖类实质上可分离的物质上，使所得的低聚糖受将特定的糖链切成exo型的酶的作用。文档编号C12P17/12GK1063897SQ9110801公开日1992年8月26日申请日期1991年12月12日优先权日1991年2月5日发明者江连洋治,丸尾重昭,宫崎克宪,山田直义申请人:日本新药株式会社