贝母丁酰胆碱酯酶抑制活性提取物及其组合物的医药用途和制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属医药技术领域，具体涉及一种贝母丁酰胆碱酯酶抑制活性提取物及其组 合物的制备方法以及它在治疗阿尔茨海默病（AD)等方面的医药用途。
【背景技术】
[0002] 贝母，因其形状得名，《本草经集注》说："形似聚贝子"，故名贝母，能止咳化痰、清 热散结之功。别名：勤母、苦菜、苦花、空草、药实。产于四川、云南、陕西秦巴山区，甘肃等地。 新疆贝母，是一种与川贝.浙贝齐名的贵重中药材。其中包括：伊犁贝母。费尔干贝母.滩 贝母等几个品种，统称为新疆贝母。除滩贝喜生于沙滩涯地外，其它三种贝母多生于草原山 地及灌木丛下。伊贝主产于伊宁。霍城；费尔干贝母新疆许多地方都有分布；轮叶贝母主产 于塔城地区；滩贝母生产于霍城.察布查尔。早在清代，新疆贝母便已开发利用。当时以北 疆地区的昌吉.齐台县为集散市场，通过古丝绸之路的北线，用骆驼运。马驮，远销天津等 口岸，通称"古贝"。由于数量极少，价格昂贵。
[0003]贝母为多年生草本植物，其鳞茎供药用，有止咳化痰、清热散结之功。苦、甘，微 寒。归肺、心经。清热润肺，化痰止咳。用于肺热咳嗽，干咳少痰，阴虚劳嗽，咯痰带血。
[0004] 在高通量筛选的过程中，本发明意外地发现大叶贝母具有很好的抑制丁酰胆碱酯 酶的活性，该活性提取物及其组合物有望应用于治疗阿尔茨海默病（AD)等方面的医药用 途。
【发明内容】
[0005] 本发明所解决的技术问题是提供一种贝母提取物。
[0006] 本发明还提供了以贝母提取物为主要活性成分的组合物。
[0007] 本发明同时提供了贝母提取物及其组合物的制备和应用。
[0008] 本发明是通过如下技术方案实现的： 维吾尔药贝母经甲醇和水超声提取，提取液浓缩后，用硅胶（SiO2)柱分离，上样后的硅 胶柱，用氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱(氯仿-甲醇，比例见表1)，各氯仿-甲醇比例混合 溶剂洗脱液，浓缩，干燥后，利用体外筛选体系测试其丁酰胆碱酯酶抑制活性，意外地发现 先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿_甲醇，1〇〇: 4,体积比）洗脱，继用氯仿-甲醇混合溶剂(氯 仿-甲醇，1〇〇: 12,体积比）洗脱得到的氯仿-甲醇混合溶剂（氯仿_甲醇，100:12,体积比） 洗脱液经回收有机溶剂，干燥，即为丁酰胆碱酯酶抑制活性提取物。而其他比例的洗脱部 位，没有丁酰胆碱酯酶抑制活性的作用。特别地，优选为先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲 醇，100:4,体积比）洗脱25倍柱体积，继用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:12,体积 比）洗脱20倍柱体积，洗脱液干燥后所得提取物即为本发明丁酰胆碱酯酶抑制活性的提取 物。丁酰胆碱酯酶抑制活性的提取物，可以通过以上方法得到富集，从而与其他杂质类成分 分离开。该贝母丁酰胆碱酯酶抑制活性提取物从未见文献报道，其薄层色谱（TLC)分析结果 见图1，TLC分析条件：GF254硅胶板，展开系统：氯仿：乙酸乙酯：甲醇（3:1:1)显色方法： 香草醛-硫酸显色。
[0009] 具体，发现过程如下： 1、贝母经甲醇超声提取物的制备 取维吾尔药贝母20g，经100mL甲醇超声提取15min，再经100mL水超声提取15min提取液浓缩后，得提取物SN0169,样品上柱：1. 9963g，拌样硅胶2. 0g，空白硅胶10g， 氯仿-甲醇系统。
[0010] 2、氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱方法和结果 取维吾尔药贝母20g，经100mL甲醇超声提取15min，提取液浓缩后，得提取物SN0169，1.9963g上柱，甲醇溶解，共用甲醇15mL。上硅胶柱色谱，拌样硅胶2.0g，空白 硅胶10g，玻璃柱内径2. 0cm，氯仿-甲醇系统梯度洗脱(条件见表1)，柱体积25mL，每个 梯度洗脱200mL，得到，各个浓度提取洗脱液的洗脱物，回收溶剂，即得，氯仿：甲醇梯度洗 脱提取物，TLC分析结果见图2,图3,TLC分析条件：GF254硅胶板，展开系统：氯仿：乙酸乙 酯：甲醇（3:1:1)，氯仿：乙酸乙酯：甲醇（1:1:1)显色方法：香草醛-硫酸显色。
[0011] 表 1
3、抑制丁酰胆碱酯酶活性筛选方法和结果 1) 实验条件 a、 材料：DMSO(二甲基亚砜）（科密欧公司）；KH2P04、K2HP04WH2CK广东汕头市西陇化 工厂）；BuChE酶（美国Sigma公司）；PNPG(美国Sigma公司） b、 实验仪器：多功能酶标仪Bio-RadModel680 型（Bio-RadLaboratoriesInc.) 2) 实验方法和过程 样品处理：将Img待测样品溶于20 二甲基亚砜（DMSO)作为母液，取I 母液 加入249 蒸馏水配成200 .mr1的溶液。
[0012] 丁酰胆碱酯酶抑制活性测定方法： 在96孔板上测定样品的BuchE抑制活性。具体操作如下：在96孔板中依次加入25PBS(100mM，pH8.0)，25BuChE(彡 0.04U/mL，pH8.0PBS溶解稀释），25 样品溶液（200 ?ml/1)。加 25BuSCH(l. 6mM,pH8. 0PBS溶解稀释）及 25 DTNB(4.0mM，pH8.0PBS溶解稀释），37°C孵育60min后，用酶标仪在412nm下测 定其吸光度值。样品抑制百分率按以下公式计算： 酶活性抑制率％=[A空白_(A样品-A背景）]/A空白X 100 式中Aee :不加样品反应后的吸收值； :加入样品反应后的吸收值； Awft :只加样品的吸收值。
[0013] 3)实验结果 表2
结果发现： 本发明最优方案为：维吾尔药贝母经有机溶剂超声提取，提取液浓缩后，用硅胶柱分 离，上样后的硅胶柱，先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:4,体积比）洗脱，继用氯 仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:12,体积比）洗脱，用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲 醇，100:12,体积比）洗脱的洗脱液经回收有机溶剂，干燥，即为该丁酰胆碱酯酶抑制活性提 取物。该丁酰胆碱酯酶抑制活性提取物从未见文献报道，其TLC分析表征如图1。
[0014] 4、丁酰胆碱酯酶抑制活性有效提取物的提取方法研宄 1)提取溶剂的种类研宄 分别用甲醇、丙酮、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混合溶剂、乙醇水混合溶剂等有机 溶剂提取，并测试提取物的丁酰胆碱酯酶抑制活性，实验结果如下： 表3
研宄结果表明：提取用有机溶剂可以为甲醇、石油醚、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混 合溶剂、乙醇水混合溶剂。
[0015] 2)提取溶剂的用量研宄 分别用1、2、5、10、20、30、40、50倍(重量/体积比)有机溶剂提取，并测试提取物的丁酰 胆碱酯酶抑制活性，结果如下： 表4
活性提取物的提取所用有机溶剂用量为药材重量的2-50倍(重量/体积比)。
[0016] 3)干燥方法的研宄 分别用真空干燥法、冷冻干燥法、鼓风干燥、离心干燥、旋蒸干燥法等方法，对得到的抑 制丁酰胆碱酯酶活性提取物进行干燥，以含水量、TLC、活性测试为指标，发现真空干燥法、 冷冻干燥法、鼓风干燥、离心干燥、旋蒸干燥法适用于对丁酰胆碱酯酶抑制活性提取物进行 干燥，其中，最优为真空干燥法、冷冻干燥法。
[0017]表 5
优选地，贝母丁酰胆碱酯酶抑制活性提取物的制备方法为： 维吾尔药贝母经有机溶剂超声提取，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱， 先用氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:4,体积比）洗脱，洗脱2-50倍柱体积，继用氯 仿-甲醇混合溶剂(氯仿-甲醇，100:12,体积比）洗脱，洗脱2-50倍柱体积，用氯仿-甲醇 混合溶剂(氯仿-甲醇，100:12,体积比)洗脱的洗脱液经回收有机溶剂，干燥，即为该活性提 取物。以上条件最优为先用氯仿：甲醇混合溶剂(氯仿：甲醇，100:4,体积比）洗脱20倍柱 体积，继氯仿：甲醇混合溶剂(氯仿：甲醇，100:12,体积比）洗脱15倍柱体积。
[0018]其中， 1)提取物提取用有机溶剂可以为甲醇、石油醚、水、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混合 溶剂、乙醇水混合溶剂，最优条件为甲醇和95%乙醇。活性提取物提取用有机溶剂用量为药 材重量的2-50倍(重量/体积比)。
[0019] 2)提取物干燥方法可以为真空干燥法、冷冻干燥法、鼓风干燥、离心干燥、旋蒸干 燥法等，最优为真空干燥法、冷冻干燥法。
[0020] 5.贝母抑制丁酰胆碱酯酶活性提取物(洗脱液为100 :12时干燥所得提取物）的 医药用途研宄 按优化的贝母丁酰胆碱酯酶抑制活性提取物制备方法制备的活性提取物，经测试，其 丁酰胆碱醋酶抑制活性为IC5(I=16. 5yg/mL。
[0021] 由于丁酰胆碱酯酶抑制剂具有治疗阿尔茨海默病等方面的医药用途。因此，我们 发现的贝母丁酰胆碱酯酶抑制活性提取物具有广泛的医药用途。
[0022] 6、贝母抑制丁酰胆碱酯酶活性提取物的组合物及其制备方法研宄 1)固体分散体 处方 贝母提取物 20 g Vc Ig 聚乙烯吡咯烷酮 79 g 固体分散100g制备方法： 称取贝母提取物和载体聚乙烯吡咯烷酮（PVP)按比例1:2、1:4、1:6的质量比分别放入 烧杯中，加入适量的无水乙醇和Vc，用磁力搅拌器搅拌至贝母提取物和载体完全溶解，充分 混合均匀后转入旋蒸仪中除去有机溶剂，干燥，粉碎过80目筛，即得贝母有效提取物PVP包 合物。
[0023] 2)环糊精包合物 处方： 贝母提取物 20 g Vc Ig 0 -环糊精 79 g 包合物100g 制备方法： 将e-环糊精与1~5倍水研匀，加贝母有效提取物（水难溶性的应先溶于少量有 机溶剂中）继续充分研磨至成糊状物，低温干燥即得环糊精包合物。
[0024] 3)分散片处方： 贝母提取物 1〇〇 十>烷基硫酸纳 1 Vc 1 预胶化淀粉 10 可溶性淀粉 100 交联聚维酮 10 微晶纤维素 9 微分硅胶 0. 3 滑石粉 1 100片 制备方法： 1. 贝母有效提取物分散体的制备，精密称取贝母提取物、Vc，加入处方量的十二烷基硫 酸钠，用适量的浓度为70%乙醇溶解并加入等比例的可溶性淀粉混合均匀后，在70°C的温 度下蒸干，粉碎，过100目筛； 2. 将第一步中的贝母有效提取物淀粉分散体与处方量的交联聚维酮，预胶化淀粉，用 适量的浓度为70%乙醇做湿润剂，边加入边搅拌，制成湿颗粒过14目筛，室温下放置15min 后，60°C烘箱烘干45min，16目筛整粒，加入处方量的滑石粉和微分硅胶，混合均匀后，压 片即得。
[0025] 7、贝母抑制丁酰胆碱酯酶活性提取物的检测方法研宄 我们发现，可以用薄层色谱的方法，很好地检测和标示贝母丁酰胆碱酯酶抑制活性提 取物的特征。见图1 具体条件为：GF254硅胶板，展开系统：氯仿：乙酸乙酯：甲醇（3:1:1);氯仿：乙酸乙 酯