一种用于检测农药残留的重组家蚕乙酰胆碱酯酶的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及农药残留快速检测技术领域，具体地，设及一种用于检测农药残留的 重组家蚕己酷胆碱醋酶的制备方法，更具体地，设及一种用于检测有机磯和氨基甲酸醋类 农药残留的重组家蚕己酷胆碱醋酶的制备方法。
【背景技术】
[0002] 农药的使用在给农业生产带来巨大经济效益的同时，也对环境与产品造成严重的 污染，给人民身屯、健康带来很大的影响。目前农药残留检测的方法主要有仪器分析法，免 疫分析法和酶抑制法等。仪器分析法检测灵敏度高、选择性好、定性定量可同时进行、结果 准确可靠，是目前检测农药残留的标准方法和仲裁方法，但仪器法需要使用实验室昂贵的 大型分析仪器，依靠专业技术人员完成分析工作，而且样品前处理操作繁琐、时间较长，因 而只能应用于实验室，很难适应现场简单快速和大量样品农药残留分析的要求，不利于在 基层进行推广应用。免疫分析法具有专一性强、灵敏度高、快速、操作简单等优点，但该方法 对试剂的选择性高，容易受到检测样品基质的影响，对结构类似的化合物也有一定的交叉 反应，且具有多残留识别的宽谱特异性抗体的制备尚在研究阶段。当前我国农药残留快速 检测技术中酶抑制法的发展时间比较长，较其他速测方法更为成熟，操作更加简单，成本更 低，具有快速、灵敏、准确的优点，能有效弥补仪器分析方法前处理繁琐、检测费用高，难W 满足高通量、快速和在线检测等方面的不足，更适合我国的国情，能够作为仪器分析方法的 有益补充。但是，市售的农药残留快速检测试剂盒或试纸条其核屯、材料胆碱醋酶多是直接 从家蛹、马血清、鱼肉组织、猪肝、羊血红细胞、植物组织等提取得到的，该些从生物体中直 接分离提取的胆碱醋酶存在提取量低、纯化困难、种类间灵敏度差异大、稳定性差等不足， 因此在实际检测中极易出现假阳性，应用中缺点较多。王栋等将家蛹己酷胆碱醋酶基因分 别构建到原核和真核表达系统中，分别进行原核和真核表达，但是，结果发现原核表达出来 的重组家蛹己酷胆碱醋酶活力很低，而真核表达出来的重组家蛹己酷胆碱醋酶没有活性。
【发明内容】
[0003] 本发明为了克服现有技术的上述不足，提供一种用于检测有机磯和氨基甲酸醋类 农药残留的重组家蚕己酷胆碱醋酶的制备方法。通过该方法制备得到的重组家蚕己酷胆碱 醋酶产量大、灵敏度高且稳定，而且可在家庭、市场、蔬菜生产基地等现场进行快速检测有 机磯和氨基甲酸醋类农药的残留。
[0004] 本发明的另一个目的是提供一种检测有机磯和氨基甲酸醋类农药残留的酶制剂。
[0005] 为了实现上述目的，本发明是通过W下方案予W实现的： 一种用于检测有机磯和氨基甲酸醋类农药残留的重组家蚕己酷胆碱醋酶的制备方法， 包括W下步骤；将家蚕己酷胆碱醋酶基因与错定蛋白基因对目连插入到酵母表达载体 PPIC9K中构建成表面展示载体并转化毕赤酵母GS115,筛选阳性重组子，并利用甲醇对阳 性重组子进行诱导表达，表达结束后离屯、去除上清液，将菌体冷冻干燥即得重组家蚕己酷 胆碱醋酶。
[0006] 现有技术中也有人采用重组表达技术来制备重组己酷胆碱醋酶，如王栋等将家蛹 己酷胆碱醋酶基因分别构建到原核和真核表达系统中，分别进行原核和真核表达，但是，结 果发现原核表达出来的重组家蛹己酷胆碱醋酶活力很低，而真核表达出来的重组家蛹己酷 胆碱醋酶没有活性。本发明将家蚕己酷胆碱醋酶基因与错定蛋白基因对目连构建到表 面展示载体中并转化毕赤酵母，通过固定化展示技术得到的重组酶的活性很好。
[0007] 优选地，所述家蚕己酷胆碱醋酶基因的核巧酸序列如SEQIDNO;1所示。
[000引 由如上方法制备得到的重组家蚕己酷胆碱醋酶。
[0009] 如上方法制备得到的重组家蚕己酷胆碱醋酶在检测有机磯和氨基甲酸醋类农药 残留中的应用。
[0010] 一种用于检测有机磯和氨基甲酸醋类农药残留的酶制剂，包括如上所述的重组 家蚕己酷胆碱醋酶、辅助试剂A、辅助试剂B和辅助试剂C;其中，所述辅助试剂A为己 酸-a-蒙醋，辅助试剂B为固藍B盐，辅助试剂C为抑7. 5的磯酸盐缓冲液粉剂。
[0011] 优选地，所述辅助试剂A使用时溶于丙酬中，配成浓度为0. 03mol/L的溶液。
[0012] 优选地，所述辅助试剂B使用时溶于甲醇中，配成浓度为0. 06mol/L的溶液。
[001引优选地，所述辅助试剂C使用时的浓度为50mM。
[0014] 辅助试剂A的制备：将醋类物质己酸-a-蒙醋溶于有机溶剂，有机溶剂为丙酬，揽 拌均匀使其浓度为0. 03mol/l，溶液于4°C可保存一个月。
[0015] 辅助试剂B的制备；将显色剂固藍B盐溶于有机溶剂，有机溶剂为甲醇，揽拌均匀 使其浓度为0. 06mol/l，稳定性比其水溶液好。
[0016]辅助试剂C的制备：将化2册〇4'12&0与Na&PCV2&0按质量比10:1混合而成，用 时溶于一定量的蒸馈水中，其浓度为50ml，pH为7. 5。
[0017] 本发明的酶制剂在检测过程中还会使用到标准比色卡，标准比色卡根据不同浓度 的农药在检测时所显示的颜色制作而成。
[0018] 本发明的应用原理是：正常情况下，己酷胆碱醋酶能够催化神经传导代谢产物己 酷胆碱的替代物己酸-a-蒙醋水解，其水解产物a-蒙酪可与显色剂固藍B盐反应，生成 紫红色的偶氮化合物。而有机磯和氨基甲酸醋类农药对己酷胆碱醋酶正常功能有抑制作 用，使催化、水解、变色的过程发生改变，有农药存在时，溶液的颜色呈浅红色或固藍B盐原 有的黄色，而非紫红色，根据颜色的变化可判断出样品中是否有高剂量的有机磯或氨基甲 酸醋类农药的存在。
[0019] 一种检测有机磯和氨基甲酸醋类农药残留的方法，包括W下步骤，将重组家蚕己 酷胆碱醋酶与辅助试剂C混匀后得液体酶制剂，将待测样品和适量液体酶制剂混合，2~3分 钟后加入辅助试剂A和辅助试剂B，1~2分钟后观察待测液的颜色，如果出现紫红色，则说明 农药残留未超标，如果出现浅红色或黄色，则说明农药残留超标；另外，将检测结果与标准 比色卡作比较，则可粗略知道农药的残留量。
[0020] 检测时使用的容器可W是离屯、管、玻璃试管、血袋等形式，配W比色计，还可 速测计形式使用。
[0021] 本发明既可W检测蔬菜中有机磯或氨基甲酸醋类农药的残留，也可W检测水果、 地下水、粮食中的有机磯或氨基甲酸醋类农药的残留。<