一种乙酰胆碱酯酶的分泌型表达载体及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种表达载体，具体涉及一种乙酰胆碱酯酶的分泌型表达载体及其构 建方法和应用。
【背景技术】
[0002] 乙酰胆碱醋酶（acetylcholinesterase，AchE)是神经系统的一种重要水解酶，可 快速而高效地水解神经递质乙酰胆碱（Acetylcholine)，从而维持神经信号传导的正常进 行。人AchE基因位于第7条染色体的长臂上，其开放阅读框架（0RF)为一长约2. 2kb的片 段，AchE结构基因全长1845bp，从第157位的起始密码子开始到2001位的终止密码子，共 编码614个氨基酸，除去前导肽（72bp)、信号肽（63bp)与分子内伴侣（18bp)，编码成熟肽 的核苷酸序列全长为1692bp，因此，经表达翻译可产生由563个氨基酸组成人AchE单体。
[0003] 临床上有机磷农药中毒很常见，其中毒机理为有机磷农药与神经系统的乙酰胆碱 酯酶结合，形成磷酰化酶，使其失去水解乙酰胆碱的能力，造成乙酰胆碱的蓄积，引起M样 和N样受体的过度兴奋，最终导致呼吸衰竭而死亡，通常的解毒剂为阿托品和2-PAM，这两 种解毒剂都有较强的副作用，都不是理想的解毒剂，外源人乙酰胆碱酯酶，给与机体后，能 够和血中有机磷结合通过肾脏排出，并可迅速缓解局部乙酰胆碱蓄积，发挥解毒作用，因此 利用生物高技术表达乙酰胆碱酯酶成为目前解毒剂研宄的热点。适量地补充外源性的人 AchE，对中和毒剂、挽救生命具有重要临床价值。同时，AchE还被广泛应用在识别和检测天 然样品中氨基甲酸酯类与有机磷类农药、杀虫剂残留的生物传感器中。近年来的研宄发现， 人脑型AchE在阿尔兹海默氏病即早老性痴呆症的发生中起着重要作用，在体外它可用于 治疗该病的药物筛选。因此，通过基因工程技术来高效生产体内极微量存在的人脑型AchE 以满足上述研宄与应用具有重要意义。
【发明内容】
[0004] 为解决上述技术问题，本发明提供了一种乙酰胆碱酯酶的分泌型表达载体及其构 建方法和应用。
[0005] 本发明通过以下技术方案实现：
[0006] -种乙酰胆碱酯酶的分泌型表达载体，包括启动子、表达标签、结构基因和终止 子，在启动子和表达标签之间连接芽孢杆菌B16中性蛋白酶前体信号肽，所述芽孢杆菌B16 中性蛋白酶前体信号肽的核苷酸序列为SEQ ID No. 1所示。
[0007] 进一步地，所述启动子为17启动子。
[0008] 进一步地，所述表达标签为6Xhis标签。
[0009] 上述表达载体的构建方法，1)合成含有芽孢杆菌B16中性蛋白酶前体信号肽和 6Xhis标签的基因片段；克隆乙酰胆碱酯酶成熟肽的基因片段；2)通过S0E-PCR方法将步 骤1)所述的两个基因片段连接，得到含有芽孢杆菌B16中性蛋白酶前体信号肽、6Xhis标 签和乙酰胆碱酯酶成熟肽基因片段的序列；3)将步骤2)得到的序列经双酶切克隆到表达 质粒上，即得。
[0010] 进一步地，所述表达质粒为pET21_a。
[0011] 上述表达载体在乙酰胆碱酯酶表达中的应用。
[0012] 进一步地，上述的应用方法为：将等量的Kil表达载体和乙酰胆碱酯酶表达载体 共转化宿主细胞，在同时含有氨苄青霉素和卡那霉素双抗性的LB培养基上培养，经诱导、 浓缩、纯化得到表达产物。
[0013] 进一步地，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21 (DE3)。
[0014] 本发明提供的乙酰胆碱酯酶的分泌型表达载体，以芽孢杆菌B16中性蛋白酶前体 信号肽引导蛋白分泌表达，在高效分泌表达乙酰胆碱酯酶基因的同时有效地提高了表达产 物的水溶性，表达产物分泌到培养基中，只需要简单纯化即可。本发明的表达系统不仅仅局 限于乙酰胆碱酯酶基因的表达，也为其他基因表达提供一个技术平台，具有重要的应用价 值。
【具体实施方式】
[0015] 实施例1一种乙酰胆碱酯酶的分泌型表达载体及其构建方法和应用
[0016] (一）AChE成熟肽基因片段的克隆
[0017] 依据实验需要，参考GeneBank中公开发表的人AChE基因序列，设计了1对用于扩 增乙酰胆碱酯酶成熟肽片段的引物，CGCCTGAAGACCC CCG和CAGGTCTGAGCAGCGATCCT;以18 周龄引产的胎儿大脑组织mRNA为模板，经RT-PCR扩增出AChE成熟肽全长，连接到pMD18-T 载体，转化大肠杆菌DH5 a，蓝白斑筛选得到重组子，经酶切鉴定正确后再进行序列测定，最 终得到AChE成熟肽基因片段，如序列2所示。
[0018](二）乙酰胆碱酯酶的分泌型表达载体的构建
[0019] 通过基因合成方式合成含有"芽孢杆菌B16中性蛋白酶前体信号肽、在信号肽序 列3 '端连接6 X Hi s标签、在6 X Hi s标签3 '端连接编码AChE基因成熟肽片段的5 '端的20 个碱基"的序列，然后采用SOE-PCR方法将AChE成熟肽基因片段与其进行连接。方法为将 PCR程序如下：首先在常规PCR反应体系（50yL)中加入等摩尔信号肽和成熟肽基因，94°C 预变性5min，94°C 45s，68°C lmin，72°C 45s，共进行10个循环，72°C延伸lOmin ;以此产物 为模板，以分别含酶切位点EcoR I和Hind III的一对引物引物1和引物2进行二次PCR， 94°C预变性 5min，94°C 45s，60°C lmin，72°C 45s，共进行 30 个循环，最后 72°C延伸 lOmin。 引物 1 :GCTAGAATTCGTGGGTTTAGGTAAGAAATT，引物 2 :GGCCAAGCTTCAGGTCTGAGCAGCGATCT。
[0020] 将回收的目的片段及表达载体pET21a，经限制性内切酶EcoR I和HindIII，在 37°C水浴同时分别酶切4小时，用T4DNA连接酶将酶切后的目的基因与表达载体pET21a按 体积比4:1进行连接，16°C 12小时，将连接产物10 y L与200 y L感受态菌DH5 a混匀，将 转化菌液平铺于含氨苄青霉素100 y g/mL的琼脂板表面，37°C倒置培养12小时以上。得到 AChE表达载体。
[0021] (三）Kil基因表达载体的构建
[0022] 以大肠杆菌基因组序列为模板，设计一对含酶切位点的引物扩增Kil基因编码区 序列，引物序列：A，5' GCCGAAITCTTATAAGGATCGAGATGAGGA AACGITTCTTT 3' 和 B，5' GCCGGAT CCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAG AAGA 3'，该基因和pUC18载体一起同时双酶切，T4DNA连接酶 连接后转化大肠杆菌感受态细胞，挑选克隆鉴定后提取质粒备用。
[0023](四）与Kil表达载体共转化大肠杆菌
[0024] 将等量的Kil表达载体和AChE表达载体共转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞， 在同时含有60mg/L的氨苄青霉素和50mg/L的卡那霉素双抗性的LB培养基上筛选单菌落。 筛选得到的单克隆菌落，37°C过夜培养后，按照1:100的接菌量接入同时含有60mg/L的氨 苄青霉素和50mg/L的卡那霉素双抗性液体LB培养基中，37°C 225rpm培养2. 5小时，加入 适量IPTG进行诱导，在17启动子的启动下，开始表达乙酰胆碱酯酶蛋白。取诱导后的培养 液离心取上清，超滤管浓缩后得到表达产物。
[0025] 乙酰胆碱酯酶在共表达的Kil蛋白的作用下，可以穿透细胞膜和胞外膜，分泌到 培养基中，完成分泌表达。
[0026](五）表达产物纯化
[0027] 将浓缩后的表达产物上镍离子亲和柱纯化，利用亲和层析一步纯化即可以得到具 有生物活性的重组蛋白。具体方法为：用去离子水洗涤，洗去20 %的乙醇、除尽基质中的 空气，5X柱体积的离子缓冲液（50mM NiS04)挂柱，5倍柱体积的去离子水洗涤，去游离的 Ni离子；10X柱体积的结合缓冲液（20mM Tris-HCl，0. 5M NaCl，5mM咪唑，pH8. 0)平衡； 上样：20X柱体积的洗液（20mM Tris-HCl，0. 5M NaCl，20-50mM咪唑，pH8. 0)洗涤，至无蛋 白检出，收集流出液；然后用洗脱缓冲液（20mM Tris-HCl，0. 5M NaCl，500 - lOOOmM咪唑， PH8.0)洗脱，每次lml，检测洗脱液中蛋白浓度并收集洗脱缓冲液。
[0028](六）表达蛋白的检测
[0029] 将洗脱的产物按照下表操作进行酶活性的检测。
[0030] a.乙酰胆碱酯酶测定校正曲线绘制，取试管6支，按表1-1操作。
[0031] 表1-1胆碱酯酶测定校正曲线绘制
[0032]
【主权项】
1. 一种乙酰胆碱酯酶的分泌型表达载体，包括启动子、表达标签、结构基因和终止子， 其特征在于：在启动子和表达标签之间连接芽孢杆菌B16中性蛋白酶前体信号肽，所述芽 孢杆菌B16中性蛋白酶前体信号肽的核苷酸序列为SEQ ID No. 1所示。
2. 如权利要求1所述的表达载体，其特征在于：所述启动子为T7启动子。
3. 如权利要求1所述的表达载体，其特征在于：所述表达标签为6Xhis标签。
4. 一种权利要求1-3任一项表达载体的构建方法，其特征在于：1)合成含有芽孢杆菌 B16中性蛋白酶前体信号肽和6Xhis标签的基因片段；克隆乙酰胆碱酯酶成熟肽的基因片 段；2)通过SOE-PCR方法将步骤1)所述的两个基因片段连接，得到含有芽孢杆菌B16中性 蛋白酶前体信号肽、6Xhis标签和乙酰胆碱酯酶成熟肽基因片段的序列；3)将步骤2)得到 的序列经双酶切克隆到表达质粒上，即得。
5. 如权利要求4所述的构建方法，其特征在于：所述表达质粒为pET21-a。
6. -种权利要求1-3任一项表达载体在乙酰胆碱醋酶表达中的应用。
7. 如权利要求6所述的应用，其特征在于：方法为：将等量的Kil表达载体和乙酰胆碱 酯酶表达载体共转化宿主细胞，在同时含有氨苄青霉素和卡那霉素双抗性的LB培养基上 培养，经诱导、浓缩、纯化得到表达产物。
8. 如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述宿主细胞为大肠杆菌BL21 (DE3)。
【专利摘要】本发明公开了一种乙酰胆碱酯酶的分泌型表达载体，包括启动子、表达标签、结构基因和终止子，在启动子和表达标签之间连接芽孢杆菌B16中性蛋白酶前体信号肽；其构建方法为：1)合成含有芽孢杆菌B16中性蛋白酶前体信号肽和6×his标签的基因片段；克隆乙酰胆碱酯酶成熟肽的基因片段；2)通过SOE-PCR方法将所述的两个基因片段连接，得到含有芽孢杆菌B16中性蛋白酶前体信号肽、6×his标签和乙酰胆碱酯酶成熟肽基因片段的序列；3)将得到的序列经双酶切克隆到表达质粒上，即得。本发明的表达载体可高效分泌表达乙酰胆碱酯酶，表达产物的水溶性高，只需要简单纯化即可。
【IPC分类】C12N9-18, C12N15-70
【公开号】CN104830887
【申请号】CN201510241951
【发明人】沈鹤霄, 华权高, 徐春雷, 马峰
【申请人】武汉华美生物工程有限公司
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2015年5月13日