一种携带IL-15/sIL-15Ra融合基因的微环DNA表达载体的构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程领域，具体涉及一种携带IL-15/sIL-15Ra融合基因的微环 DNA表达载体的构建方法。
【背景技术】
[0002] IL-15是1994年Grabstein等在检测猴肾表皮细胞系CV-1/EBVA上清液时发现的 一种可溶性细胞因子，它能维持CTLL-2细胞的增殖，具有许多与IL-2相似的生物活性，因 而受到广泛关注。研宄发现，IL-15和它的可溶性受体sIL-15Ra形成复合物后，能够更有效 地与IL-15R/IL-2R 0、y亚基结合，并且在血清中的半衰期可以由原来的30分钟延长到 20小时，其生物活性也可以提高至少50倍。体外研宄表明，IL-15/sIL-15Ra复合物可以极 大地促进⑶8+T、NK、NKT的增殖和功能，因此又被称为超级白介素-15 (Hyper-IL-15)。多 项研宄表明，该复合物在多种肿瘤模型中表现出比IL-15更强的抗肿瘤效应，全身性给予 IL-15/sIL-15Ra复合物可以明显消退已建立的胰腺癌和转移性黑色素瘤。
[0003] 微环DNA (minicircle DNA，MC)表达载体是传统质粒在大肠杆菌中通过位点 特异性重组得到的一种新型超螺旋表达框。在携带真核表达框的亲本质粒两侧插入重 组酶识别位点，诱导体内相关重组酶表达，该重组酶将识别位点中的DNA序列切断，亲本 质粒（parental plasmid，PP)被分成2个超螺旋分子，一个是具有复制功能的小质粒 (miniplasmid，MP)，另一个是携带真核表达框的微环DNA。微环DNA表达载体没有复制起 始点和抗性标记等细菌序列，增加了生物安全性，它比传统载体在生物体内的表达时间长， 表达效率高。经实验证明，带有目的基因的微环DNA表达载体可用于体内外各种实验，其在 生物体内的存在时间要比传统质粒要长的多，比如利用传统质粒转入的基因，2周后在体内 就基本检测不到了，而以微环质粒为载体的目的基因在3周的时候还能在体内检测到。
[0004] 但是，现有技术中还没有将IL-15/SIL-15Ra融合基因整合于微环DNA表达载体中 的相关报道。
【发明内容】
[0005] 针对上述情况，本发明的目的在于提供一种携带IL-15/sIL_15Ra融合基因的微 环DNA表达载体的构建方法。
[0006] 具体而言，通过分别克隆小鼠的IL-15和sIL-15Ra基因，利用重组PCR技术将两 个基因融合在一起，构建IL-15/sIL-15Ra融合基因的重组亲本质粒，转化大肠杆菌后，通 过甩环和纯化，获得携带IL-15/sIL-15Ra融合基因的微环DNA表达载体。
[0007] 为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案： 一种携带IL-15/sIL-15Ra融合基因的微环DNA表达载体的构建方法，其包括以下步 骤： 1) IL-15/sIL-15Ra融合基因的获取： 从小鼠组织中提取总RNA，逆转录成cDNA，设计引物并按下法合成IL-15/sIL-15Ra融 合基因：首先以cDNA为模板，利用引物对1和引物对2分别扩增出表达IL-15和sIL-15Ra 的两个基因片段，其次以表达IL-15和sIL-15Ra的两个基因片段为模板，利用引物对3和 引物对4分别扩增出带有重叠序列的表达IL-15和sIL-15Ra的两个基因片段，最后通过重 叠PCR技术将二者采用包含45至90个碱基的软链接连接起来，得到IL-15/sIL-15Ra融合 基因，并以其为模板，利用引物对5扩增出带有酶切位点的IL-15/sIL-15Ra融合基因，通过 纯化、回收及测序，得到序列正确的带有酶切位点的IL-15/sIL-15Ra融合基因； 其中：引物对1中的正向引物为SEQ ID NO:l，反向引物为SEQ ID NO:2;引物对2中 的正向引物为SEQ ID NO:3,反向引物为SEQ ID N0:4;引物对3中的正向引物为SEQ ID NO:5,反向引物为SEQ ID NO:6;引物对4中的正向引物为SEQ ID NO:7,反向引物为SEQ ID NO:8;引物对5中的正向引物为SEQ ID NO:9,反向引物为SEQ ID NO: 10,所述引物的序列 如下所示（以下划线标注的碱基对应扩增后基因片段中的重叠序列，以下划线及斜体标注 的碱基对应扩增后融合基因中酶切位点的序列）： SEQ ID N0:1 ：5'-ATGAAAATTTTGAAA-3'； SEQ ID N0:2:5'-TCAGGACGTGTTGATGAACA-3' ； SEQ ID N0:3:5'-GGCACCACGTGTCCACCTC-3' ； SEQ ID N0:4 ：5'-TCATTTCGTCATTTTGGAACTGTGG-3,； SEQ ID N0:5 ：5'-ATGAAAATTTTGAAA-3'； SEQ ID N0:6 :5'-AGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTCAGGACGTGTTGATGAACA-3' ； SEQ ID N0:7 :5'-GGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGGCACCACGTGTCCACCTC-3' ； SEQ ID N0:8 ：5'-TCATTTCGTCATTTTGGAACTGTGG-3,； SEQ ID NO:9 ：5' -GAArr<XCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCC AGGTTCCACTGGTGACAACTGGATAGATGTA-3' ； SEQ ID NO:10 ：5'-GGAr6CTCATTTCGTCATTTTGGAACTGTGG~3'； 2) IL-15/sIL-15Ra融合基因重组亲本质粒的构建： 将步骤1)中序列正确的带有酶切位点的IL-15/sIL-15Ra融合基因插入到微环亲本 克隆载体中，转化感受态大肠杆菌后筛选阳性菌落，抽取质粒后，通过测序获得序列正确的 IL-15/sIL-15Ra融合基因重组亲本质粒； 3) IL-15/sIL-15Ra融合基因微环DNA的诱导和纯化： 将步骤2)中获得的序列正确的IL-15/sIL-15Ra融合基因重组亲本质粒转化至大肠杆 菌菌体，首先将菌体接种于TB培养基中，摇菌过夜，次日加入LB培养基，然后分次向菌液中 添加阿拉伯糖以诱导微环DNA的产生，随时检测pH值并保持在7. 0~8. 5的范围之内，诱导 完毕后进行质粒抽提和纯化，得到携带IL-15/sIL-15Ra融合基因的微环DNA表达载体。
[0008] 上述技术方案中，步骤1)中所述组织为肌肉组织，通过Trizol法提取其中的总 RNA〇
[0009] 上述技术方案中，步骤1)中所述软链接包含78个碱基。
[0010] 上述技术方案中，步骤2)中所述微环亲本克隆载体为pMC. CMV-MCS-SV40polyA载 体。
[0011] 上述技术方案中，步骤2)中采用双酶切法将序列正确的IL-15/SIL-15Ra融合基 因插入到微环亲本克隆载体中，优选使用EcoRI内切酶和BamHI内切酶。
[0012] 上述技术方案中，步骤2)中所述感受态大肠杆菌为感受态DH5a大肠杆菌。
[0013] 上述技术方案中，步骤3)中所述大肠杆菌为大肠杆菌ZYCY10P3S2T。
[0014] 上述技术方案中，步骤3)中分3~5次向菌液中添加阿拉伯糖，各次之间的间隔为 1~3小时。
[0015] 上述技术方案中，步骤3)中所述阿拉伯糖与菌液之间的重量体积比为3~6g: 1L。
[0016] 由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有下列优点： (1) 本发明首次将IL-15/sIL-15Ra融合基因重组于微环DNA，与体外将IL-15和 IL-15Ra两种细胞因子混合或两种质粒的共转染等传统方法相比，IL-15/sIL-15Ra融合基 因的获得更加方便，其功能也更加稳定； (2) 在生物体内表达时，携带IL-15/sIL-15Ra融合基因的微环DNA由于没有复制起始 点和抗性标记等细菌序列，故而增加了生物安全性； (3) 经实验证明，携带11-15/8几-151^融合基因的微环0嫩可用于各种体内外实验，其 在生物体内存在的时间要比传统质粒更长。
【附图说明】
[0017] 图1为IL-15、sIL-15Ra以及IL-15/sIL-15Ra融合基因的2%琼脂糖凝胶电泳图， 其中A中的M代表Marker，1代表表达IL-15的基因片段，2代表表达sIL-15Ra的基因片 段，B中的M代表Marker，l代表1L-15/sIL-15Ra融合基因。由此可知，表达IL-15的基因 片段与表达sIL-15Ra的基因片段成功地连接在一起，形成了 IL-15/sIL-15Ra融合基因。
[0018] 图2为携带IL-15/sIL-15Ra融合基因的T载体的BamHI/EcoRI双酶切鉴定电泳图 以及测序比对图，其中