一种提高千层塔芽孢移栽成活率的方法
【专利摘要】本发明公开了一种提高千层塔芽孢移栽成活率的方法，该方法包括利用千层塔植株外植体获得千层塔伴生蕨原叶体，将千层塔伴生蕨原叶体转接到青苔基质中培养，再利用培养过千层塔伴生蕨的原叶体的青苔基质进行千层塔芽孢的移栽培养；利用培养过从千层塔中分离出的伴生蕨的青苔来培养千层塔的芽孢，提高了千层塔芽孢的移栽成活率。本发明独特易行，为千层塔的人工繁殖提供重要途径。
【专利说明】
_种提局!千层塔芽孢移栽成活率的方法
技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及种一种提高千层塔(Huperziaserrata(Thunb.)Trev.)芽孢移栽成活率的方法。
【背景技术】
[0002]千层塔(Huperziaserrata(Thunb.)Trev.)为石松目(Lycopodiales)石杉科(Lycopodiaceae)石杉属(Lycopodium L.)多年生草本蕨类植物。具有散瘀消肿、解毒和止痛的功效。1927年我国科技工作者报道了从该植物中分离的石杉碱甲具有横纹肌松弛作用，之后的大量研究发现石杉碱甲是一种高效、低毒、可逆和高选择性的乙酰胆碱酯酶抑制剂。现在，被石杉碱甲及经作为治疗阿尔茨海默病(AD,Alzheimer disease)的药物，同时在美国被用做益智的营养保健品。
[0003]但是，千层塔自然资源严重短缺。千层塔生长缓慢，野生状态下千层塔的繁殖主要以孢子繁殖为主，孢子萌发周期长，萌发后属地下生配子体，需6-15年才能成熟。因此极大地限制了千层塔野生资源的再生。目前，石杉碱甲的提取主要依赖于野生资源，提取率仅为
0.006 % -0.1 %。因此，市场对千层塔的需求量极大，迅速导致千层塔的自然资源处于灭绝的边缘。人们试图利用组织培养技术或者扦插的手段进行千层塔的快速繁殖，但是都进展缓慢。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于，提供一种千层塔芽孢移栽成活率的方法，该方法能够显著提高千层塔芽孢移栽成活率，为千层塔的人工繁殖提供重要途径。
[0005]为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案:
[0006]—种提高千层塔芽孢移栽成活率的方法，该方法包括利用千层塔外植体获得千层塔伴生蕨原叶体，将千层塔伴生蕨原叶体转接到青苔基质中培养得到千层塔芽孢移栽青苔基质，再利用千层塔芽孢移栽青苔基质进行千层塔芽孢的移栽培养。
[0007]具体的，所述的千层塔外植体包括千层塔叶片或千层塔茎。
[0008]更具体的，所述的青苔基质为干青苔饱和吸水后得到的青苔。
[0009]进一步的，所述的利用千层塔外植体获得千层塔伴生蕨原叶体包括:取千层塔外植体灭菌后接种到MS固体培养基上培养直至生长出千层塔伴生蕨原叶体，培养环境温度为28 °C，培养环境光照强度为100Lux，培养光周期为12小时。
[0010]更进一步的，千层塔芽孢移栽青苔基质的获得包括:将体积为0.3?0.5cm3的千层塔伴生蕨原叶体转接到青苔基质上培养，一周后将青苔基质用含有聚乙烯吡咯烷酮的MS培养液填充饱和后继续培养，培养环境湿度为60%?75%，培养环境温度25°C，培养环境光照强度为2000LUX，培养光周期为8小时，继续培养三个月后即得千层塔芽孢移栽青苔基质。
[0011]具体的，所述的含有聚乙烯吡咯烷酮MS培养液中聚乙烯吡咯烷酮的浓度为50?150mg/Lo
[0012]另外，利用千层塔芽孢移栽青苔基质进行千层塔芽孢的移栽培养包括:将千层塔芽孢移栽青苔基质用抗坏血酸溶液喷施饱和后移栽千层塔芽苞，再用含有吲哚丁酸的MS培养液喷施饱和千层塔芽孢移栽青苔基质进行千层塔芽孢的培养，培养环境湿度为60%?75%，培养环境温度为25°C，培养光照强度为2000LuX，培养光周期8小时。
[0013]具体的，所述的抗坏血酸溶液的浓度为150?250mg/L。
[0014]更具体的，含有吲哚丁酸的MS培养液中吲哚丁酸浓度为2?4mg/L。
[0015]本发明的特点是:
[0016]I)利用千层塔植株进行千层塔伴生蕨原叶体的培养，千层塔伴生蕨原叶体生长过的青苔基质培养芽孢。在自然生境中伴生蕨本身是和千层塔伴生的植物，在长期的生存过程中形成了其共有的促进生长的物质基础。本发明巧妙的利用千层塔伴生蕨原叶体生长过的青苔来栽培千层塔芽孢，芽孢因为利用伴生蕨生长过程中分泌的物质而促其生长；
[0017]2)利用聚乙烯吡咯烷酮、抗坏血酸和吲哚乙酸处理青苔，明显提高了千层塔芽孢的移栽效率；
[0018]3)无论是用千层塔的叶片还是用千层塔的茎培养获得的伴生蕨的原叶体，对千层塔芽孢的移栽差异不大。最佳的参数是:聚乙烯吡咯烷酮的浓度为100mg/L，抗坏血酸的浓度为200mg/L，抗坏血酸的浓度为3mg/L。在这样的条件下，千层塔芽孢的移栽成活率达到96%。
【附图说明】
[0019]图1为本发明的提高千层塔芽孢移栽成活率的具体操作流程图；
[0020]以下结合说明书附图和【具体实施方式】对本发明做具体说明。
【具体实施方式】
[0021]芽孢繁殖是石杉科植物常见的繁殖方式，是生长在植株上的一种营养繁殖，国外已有报道芽孢的形成机理，繁殖作用等。王德立等(2011，安徽农业科学)初步对千层塔的芽孢移栽进行了研究，但是繁殖效率不是很高。发明人在前期研究基础上，从千层塔外植体中培养出伴生蕨原叶体，再利用生长过伴生蕨原叶体的青苔来培养千层塔的芽孢，这样芽孢移栽的成活率显著提高。
[0022]结合图1，本发明的提高千层塔外植体表面灭菌效率的方法，按以下步骤操作:
[0023]步骤一，千层塔伴生蕨原叶体的获得:
[0024]取千层塔的叶片或者茎，用常规植物外植体灭菌法进行表面灭菌，然后接种到MS固体培养基上，放置到培养室中的培养，培养条件为:温度为280C，光照强度为lOOOLux，光周期12小时。培养2个月后，从千层塔外植体边缘长出伴生蕨的原叶体。
[0025]步骤二，用于培养千层塔芽孢的青苔基质的获得:
[0026]待原叶体长至体积为0.3?0.5cm3时，将其转接到青苔基质中。一周以后用含有50?150mg//L聚乙烯吡咯烷酮的MS培养液喷撒饱和基质后，再放置到培养室培养。培养条件为:湿度为60 %?75 %，温度25 0C，光照强度为2000LUX、光周期8小时。培养过程中，用自来水浇灌，以保证青苔湿润。培养30天后的青苔可用于千层塔芽孢的移栽。
[0027]步骤三，千层塔芽孢的移栽:
[0028]将培养有伴生蕨原叶体的青苔基质用150?250mg/L抗坏血酸溶液喷洒润湿饱和，将千层塔的芽孢移栽于其中，再用含有2?4mg//L吲哚丁酸的MS培养液喷撒饱和基质，然后放置于培养室培养。培养条件为:湿度为60%?75%，温度为25°C，光照强度为2000Lux、光周期8小时。培养过程中，用自来水浇灌，以保证青苔湿润。60天后统计已成活芽孢的数量，并计算移栽成活率。
[0029]MS培养基组成:I.65g/L的NH4NO3、I.9g/L的ΚΝ03、0.17g/L的KH2POl0.37g/L的MgS047H20、0.44g/l的CaCl22H20、0.83mg/L的K1、6.2mg/L的H3B03、22.3mg/L的MnS044H20、8.6mg/L的ZnS047H20、0.25mg/L的Na2Mo042H20、0.025mg/L的CuC125H20、0.025mg/L的C0CI26H2O、37.3mg/L 的 Na2EDTA、27.8mg/L 的 FeS047H20。
[0030]这里的各成分是按照每升液体计算的，MS是组织培养中比较常规的培养基，如果是固体MS培养基，在上述成分中添加琼脂粉;如果是MS培养液即按照上述成分进行配制，含有聚乙烯吡咯烷酮MS培养液即在原有的MS培养液中加入聚乙烯吡咯烷酮即得，含有吲哚丁酸的MS培养液即在原有的MS培养液中加入吲哚丁酸即得。
[0031 ]青苔基质为市面上购买的干燥青苔，经过自来水充分吸水饱和后得到的青苔，与平常养花使用的青苔基质相同。
[0032]移栽成活率是指:经过千层塔芽孢移栽青苔基质培养60天后，已经生根的芽孢数量占总芽孢数的百分比。
[0033]千层塔外植体的常规表面灭菌包括:先用自来水冲洗千层塔外植体表面的脏污，然后在超净工作台上用体积分数为70%的酒精表面灭菌30?60s，再用体积分数为0.1%的氯化汞溶液灭菌8分钟，最后用无菌水冲洗3?5次即完成千层塔外植体的表面灭菌
[0034]以下结合具体实例对本发明做具体说明:
[0035]实施例1:
[0036]将千层塔的芽孢移栽于用自来水充分湿润的青苔基质中，然后放置于培养室培养。培养条件为:湿度大于75%，温度25°C，光照强度为2000LuX、光周期8小时。培养过程中，用自来水浇灌，以保证青苔湿润。60天后千层塔芽孢的移栽成活率为32%。
[0037]实施例2:
[0038]将千层塔的芽孢移栽于用含有3mg//L吲哚丁酸的MS培养液喷洒过的青苔基质中，然后放置于培养室培养。培养条件为:湿度大于75%，温度25 °C，光照强度为2000LUX、光周期8小时。培养过程中，用自来水浇灌，以保证青苔湿润。60天后千层塔芽孢的移栽成活率为46%。
[0039]实施例3:
[0040]步骤一，千层塔中伴生蕨原叶体的获得:
[0041 ]取千层塔的叶片，用常规植物外植体灭菌法进行表面灭菌，然后将表面灭菌的千层塔叶片接种到MS固体培养基上，放置到培养室中的培养，培养条件为:温度为28°C，光照强度为lOOOLux，光周期12小时。培养2个月后，从千层塔叶片边缘长出伴生蕨的原叶体。
[0042]步骤二，用于培养千层塔芽孢的青苔基质的获得:
[0043]待原叶体长至0.5cm3以上，将其转接到青苔基质中培养。培养条件为:湿度大于75%，温度25°C，光照强度为2000LUX、光周期8小时。培养过程中，用自来水浇灌，以保证青苔湿润。培养30天后的青苔可用于千层塔芽孢的移栽。
[0044]步骤三，千层塔芽孢的移栽:
[0045]将千层塔的芽孢移栽于有千层塔原叶生长的青苔基质中，然后放置于培养室培养。培养条件为:湿度大于75%，温度25°C，光照强度为2000LuX、光周期8小时。培养过程中，用自来水浇灌，以保证青苔湿润。
[0046]60天后千层塔芽孢的移栽成活率为57 %。
[0047]实施例4:
[0048]步骤一，千层塔中伴生蕨原叶体的获得:
[0049]取千层塔的叶片，用常规植物外植体灭菌法进行表面灭菌，然后接种到MS固体培养基上，放置到培养室中的培养，培养条件为:温度为28°C，光照强度为lOOOLux，光周期12小时。培养2个月后，从千层塔叶片边缘长出伴生蕨的原叶体。
[0050]步骤二，用于培养千层塔芽孢的青苔基质的获得:
[0051 ]待原叶体长至0.5cm3以上，将其转接到青苔基质中。一周以后用含有50mg/L聚乙烯吡咯烷酮的MS培养液喷撒一次，再放置到培养室培养。培养条件为:湿度大于75%，温度25°C，光照强度为2000LUX、光周期8小时。培养过程中，用自来水浇灌，以保证青苔湿润。培养30天后的青苔可用于千层塔芽孢的移栽。
[0052]步骤三，千层塔芽孢的移栽:
[0053]将培养有伴生蕨原叶体的青苔用150mg/L抗坏血酸喷洒润湿，再将千层塔的芽孢移栽于其中，用含有2mg/L吲哚丁酸的MS培养液喷撒一次，然后放置于培养室培养。培养条件为:湿度大于75%，温度25°C，光照强度为2000LuX、光周期8小时。培养过程中，用自来水浇灌，以保证青苔湿润。
[0054]60天后千层塔芽孢的移栽成活率为73%。
[0055]实施例5:
[0056]步骤一:同实施例4。
[0057]步骤二，用于培养千层塔芽孢的青苔基质的获得:
[0058]待原叶体长至0.5cm3以上，将其转接到青苔基质中。一周以后用含有10mg/!聚乙烯吡咯烷酮的MS培养液喷撒一次，再放置到培养室培养。培养条件为:湿度大于75%，温度25°C，光照强度为2000LUX、光周期8小时。培养过程中，用自来水浇灌，以保证青苔湿润。培养30天后的青苔可用于千层塔芽孢的移栽。
[0059]步骤三，千层塔芽孢的移栽:
[0060]将培养有伴生蕨原叶体的青苔用200mg/L抗坏血酸喷洒润湿，再将千层塔的芽孢移栽于其中，用含有3mg/L吲哚丁酸的MS培养液喷撒一次，然后放置于培养室培养。培养条件为:湿度大于75%，温度25°C，光照强度为2000LuX、光周期8小时。培养过程中，用自来水浇灌，以保证青苔湿润。
[0061]60天后千层塔芽孢的移栽成活率为96%。
[0062]实施例6:
[0063]步骤一:同实施例4。
[0064]步骤二，用于培养千层塔芽孢的青苔基质的获得:
[0065]待原叶体长至0.5cm3以上，将其转接到青苔基质中。一周以后用含有10mg/!聚乙烯吡咯烷酮的MS培养液喷撒一次，再放置到培养室培养。培养条件为:湿度大于75%，温度25°C，光照强度为2000Lux、光周期8小时。培养过程中，用自来水浇灌，以保证青苔湿润。培养30天后的青苔可用于千层塔芽孢的移栽。
[0066]步骤三，千层塔芽孢的移栽:
[0067]将培养有伴生蕨原叶体的青苔用250mg/L抗坏血酸喷洒润湿，再将千层塔的芽孢移栽于其中，用含有4mg/Ln引噪丁酸的MS培养液喷撒一次，然后放置于培养室培养。培养条件为:湿度大于75%，温度25°C，光照强度为2000LuX、光周期8小时。培养过程中，用自来水浇灌，以保证青苔湿润。
[0068]60天后千层塔芽孢的移栽成活率为80%。
[0069]实施例7:
[0070]步骤一:同实施例4。
[0071]步骤二，用于培养千层塔芽孢的青苔基质的获得:
[0072]待原叶体长至0.5cm3以上，将其转接到青苔基质中。一周以后用含有150mg//L聚乙烯吡咯烷酮的MS培养液喷撒一次，再放置到培养室培养。培养条件为:湿度大于75%，温度25°C，光照强度为2000LUX、光周期8小时。培养过程中，用自来水浇灌，以保证青苔湿润。培养30天后的青苔可用于千层塔芽孢的移栽。
[0073]步骤三，千层塔芽孢的移栽:
[0074]将培养有伴生蕨原叶体的青苔用200mg/L抗坏血酸喷洒润湿，再将千层塔的芽孢移栽于其中，用含有3mg/L吲哚丁酸的MS培养液喷撒一次，然后放置于培养室培养。培养条件为:湿度大于75%，温度25°C，光照强度为2000LuX、光周期8小时。培养过程中，用自来水浇灌，以保证青苔湿润。
[0075]60天后千层塔芽孢的移栽成活率为85%。
[0076]实施例8:
[0077]步骤一，千层塔中伴生蕨原叶体的获得:
[0078]取千层塔的茎，用常规植物外植体灭菌法进行表面灭菌，然后接种到MS固体培养基上，放置到培养室中的培养，培养条件为:温度为280C，光照强度为lOOOLux，光周期12小时。培养2个月后，从千层塔茎边缘长出伴生蕨的原叶体。
[0079]步骤二，用于培养千层塔芽孢的青苔基质的获得:
[0080]待原叶体长至0.5cm3以上，将其转接到青苔基质中。一周以后用含有50mg/L聚乙烯吡咯烷酮的MS培养液喷撒一次，再放置到培养室培养。培养条件为:湿度大于75%，温度25°C，光照强度为2000LUX、光周期8小时。培养过程中，用自来水浇灌，以保证青苔湿润。培养30天后的青苔可用于千层塔芽孢的移栽。
[0081 ]步骤三，千层塔芽孢的移栽:
[0082]将培养有伴生蕨原叶体的青苔用150mg/L抗坏血酸喷洒润湿，再将千层塔的芽孢移栽于其中，用含有4mg/Ln引噪丁酸的MS培养液喷撒一次，然后放置于培养室培养。培养条件为:湿度大于75%，温度25°C，光照强度为2000LuX、光周期8小时。培养过程中，用自来水浇灌，以保证青苔湿润。
[0083]60天后千层塔芽孢的移栽成活率为73%。
[0084]实施例9:
[0085]同实施例5，不同之处是将步骤一中千层塔的叶片换成千层塔的茎。
[0086]千层塔芽孢的移栽成活率为93%。
[0087]实施例10:
[0088]步骤一:同实施例8。
[0089]步骤二，用于培养千层塔芽孢的青苔基质的获得:
[0090]待原叶体长至0.5cm3以上，将其转接到青苔基质中。一周以后用含有150mg//L聚乙烯吡咯烷酮的MS培养液喷撒一次，再放置到培养室培养。培养条件为:湿度大于75%，温度25°C，光照强度为2000LUX、光周期8小时。培养过程中，用自来水浇灌，以保证青苔湿润。培养30天后的青苔可用于千层塔芽孢的移栽。
[0091]步骤三，千层塔芽孢的移栽:
[0092]将培养有伴生蕨原叶体的青苔用250mg/L抗坏血酸喷洒润湿，再将千层塔的芽孢移栽于其中，用含有2mg/L吲哚丁酸的MS培养液喷撒一次，然后放置于培养室培养。培养条件为:湿度大于75%，温度25°C，光照强度为2000LuX、光周期8小时。培养过程中，用自来水浇灌，以保证青苔湿润。
[0093]60天后千层塔芽孢的移栽成活率为78%。
【主权项】
1.一种提高千层塔芽孢移栽成活率的方法，其特征在于，该方法包括利用千层塔外植体获得千层塔伴生蕨原叶体，将千层塔伴生蕨原叶体转接到青苔基质中培养得到千层塔芽孢移栽青苔基质，再利用千层塔芽孢移栽青苔基质进行千层塔芽孢的移栽培养。2.如权利要求1所述的提高千层塔芽孢移栽成活率的方法，其特征在于，所述的千层塔外植体包括千层塔叶片或千层塔茎。3.如权利要求1或2所述的提高千层塔芽孢移栽成活率的方法，其特征在于，所述的青笞基质为干青笞饱和吸水后得到的青笞。4.如权利要求1或2所述的提高千层塔芽孢移栽成活率的方法，其特征在于，所述的利用千层塔外植体获得千层塔伴生蕨原叶体包括:取千层塔外植体灭菌后接种到MS固体培养基上培养直至生长出千层塔伴生蕨原叶体，培养环境温度为28°C，培养环境光照强度为lOOOLux，培养光周期为12小时。5.如权利要求1或2所述的提高千层塔芽孢移栽成活率的方法，其特征在于，千层塔芽孢移栽青苔基质的获得包括:将体积为0.3?0.5cm3的千层塔伴生蕨原叶体转接到青苔基质上培养，一周后将青苔基质用含有聚乙烯吡咯烷酮的MS培养液填充饱和后继续培养，培养环境湿度为60%?75%，培养环境温度25°C，培养环境光照强度为2000Lux，培养光周期为8小时，继续培养30天后即得千层塔芽孢移栽青苔基质。6.如权利要求5所述的提高千层塔芽孢移栽成活率的方法，其特征在于，所述的含有聚乙烯吡咯烷酮MS培养液中聚乙烯吡咯烷酮的浓度为50?150mg/L。7.如权利要求1或2所述的提高千层塔芽孢移栽成活率的方法，其特征在于，利用千层塔芽孢移栽青苔基质进行千层塔芽孢的移栽培养包括:将千层塔芽孢移栽青苔基质用抗坏血酸溶液喷施饱和后移栽千层塔芽苞，再用含有吲哚丁酸的MS培养液喷施饱和千层塔芽孢移栽青苔基质进行千层塔芽孢的培养，培养环境湿度为60 %?75 %，培养环境温度为250C，培养光照强度为2000LUX，培养光周期8小时。8.如权利要求7所述的提高千层塔芽孢移栽成活率的方法，其特征在于，所述的抗坏血酸溶液的浓度为150?2 50mg/L。9.如权利要求7所述的提高千层塔芽孢移栽成活率的方法，其特征在于，所述的含有吲哚丁酸的MS培养液中吲哚丁酸浓度为2?4mg/L。
【文档编号】A01H4/00GK105830918SQ201610186943
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年3月29日
【发明人】郭斌, 任岩岩, 何玮, 傅艳萍, 尉亚辉
【申请人】西北大学