专利名称：从金黄色葡萄球菌代谢产物中提取治疗恶性肿瘤用药的方法
技术领域：
本发明涉及生物反应调节剂即用金黄色葡萄球菌代谢产物提取预防和治疗恶性肿瘤用药的方法。该方法的产品对恶性肿瘤细胞有直接杀伤作用，还能大幅度提高机体的免疫功能，间接抑制和杀灭肿瘤细胞，明显的修复正常组织细胞，增加白细胞、血小板的数量和功能。所述的生物反应调节剂是指能显著增强、促进或恢复人体防御能力(免疫力)的物质，这些物质统称生物反应调节剂，所述的该方法的产品简称为“BM828”。
委托国家专利局审查四部的审查员(委托编号91019)通过联机检索提出以下相应文献。JP55-8730公开了一种用于支气管气喘的药剂，方法分别是培养每一杆菌属收集起细胞体，并用加热来杀死细胞，再用“福尔马林”消毒，然后，悬浮在生理盐水溶液中，这样就制得死细胞基础溶液，将所得的基础溶液混合做成注射针剂，它就可以用作一种抗病毒制剂，其不足之处，这种方法制得的产品质量欠佳、稳定性差，有一定副作用。
另一篇是JP5445161公开了一种用于防治恶性肿瘤的免疫性增强剂，其方法是将葡萄球菌属金色细胞或细菌体粉碎、过滤掉固体组分后，所得的组分是一种免疫性增强剂。可用于有效地防治细胞的免疫性功能被降低的症状，主要治疗病毒性感染。
不足之外细菌先粉碎再过滤，滤液成份复杂，过滤掉固体，液体中含有粉碎的细物质，不难想到副作用大，虽然有免疫增强作用，但对肿瘤治疗作用和增白细胞作用没有效果。
本发明的目的为了克服现有技术的不足之处公开了一种工艺简单、质量可靠、毒副作用极小用金黄色葡萄球菌的代谢产物提取治疗恶性肿瘤用药的方法。
本发明的目的通过如下方案来实现本发明的方法按工艺流程描述可分三部分第一部分·菌种的制备;第二部分·培养基制备;第三部分·合并接种培养、发酵、提取、制剂的制备。
第一部分菌种的制备1、复苏培养将金黄色葡萄球菌接种于用猪心浸出液配制的营养琼脂斜面35℃培养18小时;
2、分装取斜面培养适量，均匀磨于1ml脱脂牛奶制成悬液分装入无菌菌种管，每管0.3ml;
3、冻结将装有菌悬液的菌种管置-30℃低温酒精中速冻一小时;
4、低压抽干将冻结后的菌种管置含干燥CaCl2真空干燥器中接上真空泵，真空抽干(约需七小时);
5、密封将上述抽干的菌种管接在橡皮多岐管上真空抽气约10-20分钟，在真空条件下火焰封闭管口。
第二部分培养基的制备主要成分蛋白胨0.5-2g%、氯化钠0.3-0.9g%、硫胺0.0-0.05g%、猪心浸液5-20ml%、羊肝浸液5-30ml%。
1、猪心浸液制备取新鲜猪血、去除血块、脂肪、筋膜用自来水、新鲜重蒸馏水洗净、铰碎、称重、加二倍量的针剂用新鲜重蒸馏水置冰箱(4℃)14小时，煮沸二小时趁热用八层沙布粗滤，再用布氏漏斗定量滤纸抽滤，得澄清黄色液体备用。
2、羊肝浸液用同样方法制备;
3、按需配药量，称取蛋白胨、氯化钠，用新鲜重蒸馏水加热溶液;
4、按需配药量量取(吸取)猪心浸出液，羊肝浸出液和硫胺;
5、将3.4溶液混合，加针剂用新鲜重蒸馏水至所需量;
6、调PH至3-4加入0.5g%针剂用粉末状优质活性碳，煮沸(不停搅拌)半小时;
7、用布氏漏斗定量滤纸抽滤脱碳;
8、调PH至7-9加0.5g%针剂用粉末状优质活性碳再次煮沸半小时;
9、抽滤脱碳;
10、调PH至6.0-7.5分装500ml(已经清洁液处理，重蒸馏水洗净180℃干烤二小时除热源的)盐水瓶加铝盖轧口;
11、高压15磅30分钟灭菌备用。
第三部分接种采用浓度10000-20亿/ml，比例0.5-5ml%，培养在30℃-38℃，18-72/小时，调整PH6-7.6，除菌过滤微孔滤膜0.22μ。
本菌株可命名为高聚金葡萄(HAS)是一种高效低毒的新菌株，在申请日之前已送往中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心提供微生物样品。
1、提供微生物样品的请求人是沈阳协合生物制剂技术有限公司法人代表陈巨余，地址沈阳市和平区三好街9甲8号，时间1991年3月，保藏号待查，简要说明如下高聚金葡菌是从医院临床各科送细菌室检验的各种病理标本中分离得到的105株葡萄球菌中筛选出来的，菌株的保存方法-真空冷冻干燥法，保护剂、脱脂牛奶，为了达到既要长期保存又要保持菌株遗传学性质不变的目的，除了选择有效稳定的方法和每次对冷冻干燥的效果进行检测外，还要对复苏的菌株进行全面鉴定。
毒理试验供试药液为临床用“BM828”注射液的20倍浓配液，小白鼠体重17-20克/只，雌、雄各半健康无孕，取20只按性别体重随机分为两组，每组10只，正常对照组不给任何药物，试验组每只小白鼠腹腔注射上述供试液0.5ml给药后，小白鼠无任何立发反应，观察七天，小白鼠健存，称取体重，断颈处死，解剖肉眼观察，各主要脏器未见明显病理改变，摘取心、肝、脾、双肾分别称重，计算各动物的心-体比、肝-体比、脾-体比、肾-体比，对正常对照组与给药组的相关数据进行显著性测验，将上述脏器按常规固定制成组织切片，在光学显微镜下观察，对照组与给药组的各主要脏器(心、肝、脾、肾)均未见明显的组织学改变。
结论给药七天后剖析小鼠各主要内脏无异常所见与正常对照组相比较，小白鼠生长速度、心-体比、肝-体比、脾-体比、肾一体比均无显著差异(P770.05)心肝脾肾的组织学检查亦未见异常改变。
本实验每只小鼠均注射0.5ml，若按20克体重计算，相当小白鼠腹腔注射20倍浓配液25ml/kg，换算成注射液500ml/kg，此剂量按公斤体重计算为人临床剂量的50000倍。
临床试验中国医科大学肿瘤研究所、军科院307医院、鞍山市中心医院肿瘤部、辽宁省武警医院肿瘤科等单位分别作了临床应用。
举例鞍山市中心医院肿瘤住院部应用“BM828”对原发性肝癌、乳腺癌、结肠癌、脑瘤、癌转移淋巴结等患者进行免疫治疗、追踪监测获得满意结果，如治疗1个月后，NK细胞(提高免疫功能一个指标)，增加162-312%实体瘤缩小50%-75%。
1)病例选择李明 男 31岁患脑膜瘤，于1989年10月在沈阳陆军总院手术，取出二个2×3公分的肿瘤，1990年8月病情复发二次手术，又取出一个3×4公分肿瘤，术后不到4个月，第三次复发瘫痪，不得已再进行第三次手术，此时癌细胞已广泛转移只取掉了一部分癌瘤，当病人接受BM828一个疗程后，病情就得到了控制，症状明显减轻精神日益好转，现在已经和正常人一样进食，可以下床走路，甚至干一些轻便劳动。
鞍山20例恶性肿瘤患者进行免疫治疗均获得满意效果。
2)治疗方案
BM828为微黄色，澄清的灭菌生物制剂，不含防腐剂，无任何毒副作用，注射液2ml/支，含1000单位肌肉注射，1-2天注射一次，30次为一个疗程。
3)疗效标准显效对恶性肿瘤有直接杀伤作用，还能大幅度，提高机体的免疫功能间接抑制和杀灭肿瘤细胞，增加白细胞、血小板的作用。
鞍山中心医院提供的数据，有效率90%，无毒副作用。
中国人民解放军军事科学院肿瘤医院提供证明，经动物药效试验，结果局部用药1500单位/一次，抑瘤率达91%。
4)治疗结果徐洪英左乳腺癌，左腋下淋巴结转移，肿块4×3公斤用药一个疗程，NK细胞明显增多达413%，淋巴结缩小2/3，二个疗程后，肿块基本消失。
王桂生原发性肝癌，门静脉癌栓、高压、大量腹水、下肢浮肿，用药二个疗程，均恢复正常腹水明显减少双下肢浮肿消失。
罗长满食道癌，胸椎转移，用药二个疗程后，NK细胞明显增多，钦透食道粘膜粗糙病灶消失。
李恩权鼻咽癌复发，骨转移，经治疗二个疗程以后，NK细胞增多，左肋肿块消退，疼痛减轻，颈部活动增大。
以上足以证明BM828具有显著的疗效，与化疗相比，具有相当的优越性。
根据本发明所描述的用金黄色葡萄球菌制备生物调节剂的方法是一种经济、合理的方法，因为该方法的成分均取优质的品种，不加任何防腐剂，又是灭菌制剂，无任何副作用，其安全可靠程度远远超过一般生物制剂，特别是采用本法制备的BM828制剂注射液，质量和疗效稳定，避光凉暗处保存二年不沉淀澄清度好。经毒理检查证明完全无任何毒副作用，药理检验不仅证实有显著增强机体免疫功能的作用，如正常小鼠注射BM828(650单位/鼠)，自然杀伤细胞(NK细胞)的活性较给药前增加232%，在患有肺癌小鼠中注射，此药后NK活性较对照组，增加304%，淋巴细胞转化率增加158%等，对恶性肿瘤细胞的杀伤也非常理想，动物实验结果证实对肺癌、宫颈癌、消化道恶性肿瘤抑瘤率在30%-40%之间，达到或超过了国际标准。
实施例结合附
图1描述，附图1是本发明的工艺流程图。举例来说明步骤实施例1 第一部分菌种的制备1、复苏培养将金黄色葡萄球菌接种于用猪心浸出液配制的营养琼脂斜面35℃培养18小时;
2、分装取斜面培养适量，均匀磨于1ml脱脂牛奶制成悬液分装入无菌菌种管，每0.3ml;
3、冻结将装有菌悬液的菌种管置-30℃低温酒精中速冻一小时;
4、低压抽干将冻结后的菌种管置含干燥CaCl2真空干燥器中接上真空泵，真空抽干(约需七小时);
5、密封将上述抽干的菌种管接在橡皮多岐管上真空抽气约10-20分钟，在真空条件下火焰封闭管口。
第二部分培养基的制备主要成分蛋白胨0.5g%、氯化钠0.3g%、硫胺0.0g%、猪心浸液5ml%、羊肝浸液5ml%。
1、猪心浸液制备取新鲜猪血、去除血块、脂肪、筋膜用自来水、新鲜重蒸馏水洗净、铰碎、称重、加二倍量的针剂用新鲜重蒸馏水置冰箱(4℃)14小时，煮沸二小时趁热用入层沙布粗滤，再用布氏漏斗定量滤纸抽滤，得澄清黄色液备用。
2、羊肝浸液用同样方法做;
3、按需配药量，称取蛋白胨、氯化钠，用新鲜重蒸馏水加热溶液;
4、按需配药量量取(吸取)猪心浸出液，羊肝浸出液和硫胺;
5、将3.4溶液混合，加针剂用新鲜重蒸馏水至所需量;
6、调PH至3-4加入0.5g%针剂用粉末状优质活性碳，煮沸(不停搅拌)半小时;
7、用布氏漏斗定量滤纸抽滤脱碳;
8、调PH至7-9加0.5g%针剂用粉末状优质活性碳再次煮沸半小时;
9、抽滤脱碳;
10、调PH至6.0-7.5分装500ml(已经清洁液处理，重蒸馏水洗净180℃干烤二小时除热源的)盐水瓶加铝盖轧口;
11、高压15磅30分钟灭菌备用。
第三部分接种采用浓度10000-20亿/ml，比例0.5ml%，培养在30℃-38℃，18-72/时，调整PH6-7.6，除菌1、除菌2微孔滤膜0.22μ。
实施例2 第一部分菌种的制备1、复苏培养将金黄色葡萄球菌接种于用猪心浸出液配制的营养琼脂斜面35℃培养18小时;
2、分装取斜面培养适量，均匀磨于1ml脱脂牛奶制成悬液分装入无菌菌种管，每0.3ml;
3、冻结将装有菌悬液的菌种管置-30℃低温酒精中速冻一小时;
4、低压抽干将冻结后的菌种管置含干燥CaCl2真空干燥器中接上真空泵，真空抽干(约需七小时);
5、密封将上述抽干的菌种管接在橡皮多岐管上真空抽气约10-20分钟，在真空条件下火焰封闭管口。
第二部分培养基的制备主要成分蛋白胨2g%、氯化钠0.9g%、硫胺0.05g%、猪心浸液20ml%、羊肝浸液30ml%。
1、猪心浸液制备取新鲜猪血、去除血块、脂肪、筋膜用自来水、新鲜重蒸馏水洗净、铰碎、称重、加二倍量的针剂用新鲜重蒸馏水置冰箱(4℃)14小时，煮沸二小时趁热用入层沙布粗滤，再用布氏漏斗定量滤纸抽滤，得澄清黄色液备用。
2、羊肝浸液用同样方法做;
3、按需配药量，称取蛋白胨、氯化钠，用新鲜重蒸馏水加热溶液;
4、按需配药量量取(吸取)猪心浸出液，羊肝浸出液和硫胺;
5、将3.4溶液混合，加针剂用新鲜重蒸馏水至所需量;
6、调PH至3-4加入0.5g%针剂用粉末状优质活性碳，煮沸(不停搅拌)半小时;
7、用布氏漏斗定量滤纸抽滤脱碳;
8、调PH至7-9加0.5g%针剂用粉末状优质活性碳再次煮沸半小时;
9、抽滤脱碳;
10、调PH至6.0-7.5分装500ml(已经清洁液处理，重蒸馏水洗净180℃干烤二小时除热源的)盐水瓶加铝盖轧口;
11、高压15磅30分钟灭菌备用。
第三部分接种采用浓度10000-20亿/ml，比例5ml%，培养在30℃-38℃，18-72小时，调整PH6-7.6，除菌1、除菌2微孔滤膜0.22μ。
权利要求
1.一种用于对恶性肿瘤预防和治疗的生物反应调节剂，所述的生物反应调节剂是从金黄色葡萄球菌的代谢产物中提取的，其特征可概括为如下步骤菌株复苏培养、培养基的精制，将上述两种液体合并，在浓度10000-20亿/ml，比例0.5-5ml%下接种，在30℃-38℃，18-72/小时条件下培养，调PH值6-7.6，用0.22μ，微孔滤膜除二次菌，再通过流通蒸气高压灭菌。所述的复苏培养方法是用肉汤注入开启后的冷冻干燥管中，使成悬液，然后接种到血平板上35℃培养24小时观察其存活情况。(1)培养将金黄色葡萄球菌Z2菌株接种于用猪心浸出液配制的营养珠脂斜面35℃培养18小时；(2)分装取斜面培养适量，均匀磨于1ml脱脂牛奶制成悬液分装入无菌菌种管，每管0.3ml；(3)冻结将装有菌悬液的菌种管置-30℃低温酒精中速冻一小时；(4)低压抽干将冻结后的菌种管置含干燥CaCl2的真空干燥器中，接上真空泵，真空抽干(约需七小时)；(5)密封将上述抽干的菌种管接在橡皮多岐管上，真空抽气约10-20分钟，在真空条件下火焰封闭管口；所述的培养基精制方法是精制培养基蛋白胨0.5-2%氯化钠0.3-0.9%硫胺 0.01-0.05%猪心浸液 5-20ml%羊肝浸液 5-30ml%PGH培养基的精制(1)猪心浸液制备取新鲜猪血，去除血块、脂及筋膜，用自来水、新鲜重蒸馏水洗净，铰碎，称重，加两倍量的针剂用新鲜重蒸馏水置冰箱(4℃)14小时，煮沸二小时趁热用八层纱布粗滤，再用布氏漏斗定量滤纸抽滤，得澄清黄色滤液备用；(2)羊肝浸液制备去除血块、脂及筋膜，用自来水、新鲜重蒸馏水洗净，铰碎，称重，加两倍量的针剂用新鲜重蒸馏水置冰箱(4℃)14小时，煮沸二小时趁热用八层纱布粗滤，再用布氏漏斗定量滤纸抽滤，得澄清黄色滤液备用；(3)按需配药量，称取蛋白胨、氯化钠，用新鲜重蒸馏水加热溶解；(4)按需配药量，(吸取)猪心浸出液、新肝浸出液和硫胺；(5)将3、4溶液混合，加针剂用新鲜重蒸馏水至所需量；(6)调PH至3.5加入3.5g%针剂用粉末状优质活性碳煮沸(不停搅拌)半小时；(7)用布氏漏斗定量滤纸抽滤、脱碳；(8)调PH至8.5加入0.5g%针剂用粉末状优质活性碳再次煮沸(不停搅拌)半小时；(9)先后用布氏漏斗定量滤纸、G4玻璃滤器抽滤脱碳；(10)调PH至6.2分装500ml(已经清洁液处理，重蒸馏水洗净180℃干烤二小时除热源的)盐水瓶加铝盖轧口；(11)高压15磅30分钟灭菌备用。
2.按照权利要求1所述的金黄色葡萄球菌代谢产物中提出治疗恶性肿瘤用药的方法，其特征在于菌株保存-真空冷冻干燥法，保护剂脱脂牛奶蛋白胨以牛奶为基质，猪心、羊肝限离体四个小时内的健康原料，氢氧化钠，盐酸硫胺、活性碳、氯化钠、蒸馏水。
全文摘要
本发明公开了一种用金黄色葡萄球菌的代谢产物提取治疗恶性肿瘤用药的方法，该方法的产品简称“BM828”对恶性肿瘤细胞有直接和间接的杀伤作用，培养基主要成分采用蛋白胨、猪心浸液、羊肝浸液制备。用肉汤复苏培养菌种，用脱脂牛奶作菌株的保护剂，高压灭菌不加任何防腐剂，经热处理、冷浸出、活性炭处理、除菌过滤等方式制得注射液，具有显著的大幅度地增强机体免疫功能的作用。
文档编号A61K35/74GK1054190SQ9110606
公开日1991年9月4日 申请日期1991年4月1日 优先权日1991年4月1日
发明者朱正中, 陈互余, 吴珺, 藏英年, 张育琴 申请人:沈阳协合生物制剂技术有限公司